免疫標記技術(shù)

1、課程名稱：臨床免疫學檢驗技術(shù)課題名稱：免疫標記技術(shù)組員：朱恩鵬 拉巴卓嘎 張燕培 汪婷婷免疫標記技術(shù)免疫標記技術(shù)指用熒光素、放射性同位素、酶、鐵蛋白、膠體金及化學(或生物)發(fā)光劑等作為追蹤物，標記抗體或抗原進行的抗原抗體反應(yīng)。藉助于熒光顯微鏡、射線測量儀、酶標檢測儀、和發(fā)光免疫測定儀等精密儀器，對實驗結(jié)果直接鏡檢觀察或進行自動化測定，可以在細胞、亞細胞、超微結(jié)構(gòu)及分子水平上，對抗原抗體反應(yīng)進行定性和定位研究；或應(yīng)用各種液相和固相免疫分析方法，對體液中的半抗原、抗原或抗體進行定性和定量測定。因此，免疫標記技術(shù)在敏感性、特異性、精確性及應(yīng)用范圍等方面遠遠超過一般免疫血清學方法。近年來，隨著分子生物

2、學、細胞生物學、基礎(chǔ)免疫學和免疫化學等學科的發(fā)展以及現(xiàn)代高新技術(shù)建立的儀器分析的應(yīng)用，免疫標記技術(shù)也不斷完善和更新。各種新技術(shù)和新方法不斷涌現(xiàn)，至今已成為一類檢測微量和超微量生物活性物質(zhì)的免疫生物化學分析技術(shù)，在醫(yī)學和其他生物學科的研究領(lǐng)域及臨床檢驗中應(yīng)用十分廣泛。根據(jù)試驗中所用標記物的種類和檢測方法不同，免疫標記技術(shù)分為免疫熒光技術(shù)、放射免疫技術(shù)、免疫酶技術(shù)、免疫電鏡技術(shù)、免疫膠體金技術(shù)和發(fā)光免疫測定等。第一節(jié) 放射免疫技術(shù) 放射免疫標記技術(shù)是將同位素分析的高靈敏度與抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合，以放射性同位素作為示蹤物的標記免疫測定方法，由于此項技術(shù)具有靈敏度高(可檢測出毫微克(ng)至微微

3、克(pg)，甚至毫微微克(fg)的超微量物質(zhì)，特異性強(可分辨結(jié)構(gòu)類似的抗原)、重復(fù)性強、樣品及試劑用量少、測定方法易規(guī)范化和自動化等多個優(yōu)點。因此，在醫(yī)學及其他生物學科的研究領(lǐng)域和臨床實驗診斷中廣泛應(yīng)用于各種微量蛋白質(zhì)、激素、小分子藥物及腫瘤標志物等的分析與定量測定。 （一）放射免疫測定(RIA)放射免疫測定(Radio immunoassay，RIA)是1959年Yalow和Berson首先創(chuàng)建的經(jīng)典放射免疫分析技術(shù)，用于血清中胰島素含量的測定。30多年來，由于此項技術(shù)靈敏、特異、并已制成多種標準試劑盒，使用方便，應(yīng)用范圍十分廣泛。目前國外已成功地應(yīng)用RIA檢測的物質(zhì)多達300余種，國內(nèi)研

4、究的被測物質(zhì)也達百余種，試制的RIA試劑盒已有60余種，是測定各種微量物質(zhì)不可缺少的手段。（二）免疫放射測定 (IRMA)1968年Miles和Hales應(yīng)用同位素標記的抗胰島素抗體檢測牛血清中胰島素獲得成功，為了區(qū)別于經(jīng)典的放射免疫測定(RIA)，他們將其稱為免疫放射測定或免疫放射度量分析(IRMA)。由于在反應(yīng)系統(tǒng)中使用過量的標記抗體，且無競爭性抑制反應(yīng)，因此抗體與待測抗原達到結(jié)合狀態(tài)的化學平衡，在2-3h即可完成，較少受到抗體親和常數(shù)的限制，即使單克隆抗體的親和力較低，也能滿足試驗要求。同時一個抗原分子可以結(jié)合多個標記抗體分子，使IRMA的靈敏度明顯高于RIA?；驹恚篒RMA是待測抗

5、原與過量標記抗體的非競爭綜合反應(yīng)，然后加入固相的抗原免疫吸附劑以結(jié)合游離的標記抗體，離心除去沉淀，測定上清液中放射性強度從而推算出檢品中抗原含量。第二節(jié) 免疫熒光技術(shù)免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是將免疫反應(yīng)的特異性與熒光技術(shù)的敏感性及顯微術(shù)的精確性相結(jié)合的免疫標記技術(shù)。以熒光素作為標記物與抗體結(jié)合成為熒光抗體，但不影響抗體的免疫學活性。用已知的熒光抗體檢測待檢標本中的未知抗原，如果彼此相互對應(yīng)，則在局部形成熒光素標記的抗原抗體復(fù)合物。熒光素受到紫外光照射時能發(fā)出可見熒光，可借助熒光顯微鏡觀察呈現(xiàn)熒光的抗原抗體復(fù)合物及其存在部位。近年來，免疫熒光技術(shù)已有很大改進和發(fā)展，已從原來僅限于固定標本，

6、檢測組織切片或細胞表面Ag或血清中抗體的定性檢測，擴大到進行活細胞分類檢測及多種成分的定量檢測，因此具有較廣泛的用途。 （一） 熒光及熒光素熒光是指-個分子或原子吸收了給予的能量后，即刻引起發(fā)光；停止能量供給，發(fā)光亦瞬即停止。熒光素是-種能吸收激發(fā)光的光能產(chǎn)生熒光，并能作為染料使用的有機化合物，亦稱熒光色素。目前用于標記抗體的熒光素主要有異硫氰酸熒光黃(FITC)、四乙基羅丹明及四甲基異硫氰酸羅丹明。 （二） 熒光抗體染色方法直接法：這是熒光抗體技術(shù)最簡單和基本的方法。滴加熒光抗體于待檢標本片上，經(jīng)反應(yīng)和洗滌后在熒光顯微鏡下觀察。標本中如有相應(yīng)抗原存在，即與熒光抗體特異結(jié)合，在鏡下可見有熒光的

7、抗原抗體復(fù)合物。此法的優(yōu)點是簡單、特異。但其缺點是檢查每種抗原均需制備相應(yīng)的特異性熒光抗體，且敏感性低于間接法。間接法：先將待測抗體(第一抗體)加在含有已知抗原的標本片上作用一定時間，洗去未結(jié)合的抗體。然后，滴加標記抗抗體。如果第一步中的抗原抗體已發(fā)生結(jié)合，此時加入的標記抗抗體就和已固定在抗原上的抗體(一抗)分子結(jié)合，形成抗原-抗體-標記抗抗體復(fù)合物，并顯示特異熒光。此法的優(yōu)點是敏感性高于直接法，而且無需制備一種熒光素標記的抗球蛋白抗體，就可用于檢測同種動物的多種抗原抗體系統(tǒng)。間接法有時易產(chǎn)生非特異性熒光，為其缺點。此法常用于各種自身抗體的檢測。 熒光顯微鏡根據(jù)其光路不同可分為透射光熒光顯微鏡

8、和落射光熒光顯微鏡兩大類。熒光顯微鏡組成成像系統(tǒng)的光具組必須無自發(fā)熒光特性。 (1)熒光光源 能發(fā)射豐富的紫外光和紫蘭光。常用高壓汞燈、氙燈、鹵鎢燈等。高壓汞燈的光源中以380、449、600nm波長為主，是較為理想的熒光光源。 (2)濾光片系統(tǒng) 熒光顯微鏡的濾光片種類主要有， 吸熱濾光片 選擇性吸收紅外光熱輻射線，防止損傷光具組。 激發(fā)濾光片 選擇性吸收長波譜線而只通過紫外線、紫色、藍色和綠色光線，而激發(fā)熒光素發(fā)出熒光。 阻擋濾光片 選擇性吸收短波譜線和紅外線而通透較長波可視線，以便觀察到熒光并保護眼睛。 色光分離濾光片 只用于落射光熒光顯微鏡，可將激發(fā)光反射到標本上，使標本發(fā)出熒光，再將熒

9、光透射到目鏡的濾光反射鏡。 激發(fā)光束必須通過載物玻片，為了減少激發(fā)光線損失，必需使用昂貴的石英載物片和蓋玻片。 使用方法： (1)將熒光顯微鏡置暗室，開啟光源，待光源穩(wěn)定并達到一定亮度(約510分鐘)后，對準光軸。 (2)裝好配對的激發(fā)濾光片和吸收濾光片后再作觀察，操作同顯微鏡。 注意事項： (1)如用高壓汞燈作光源，使用時一經(jīng)開啟不宜中斷。斷電后需待汞燈冷卻后(約15分鐘)方能再啟動。 （2）觀察標本時間不宜太長，因標本在高壓泵燈下照射超過3分鐘，即有熒光減弱現(xiàn)象。第三節(jié) 酶免疫技術(shù)免疫酶技術(shù)是將酶的催化放大作用和抗原抗體反應(yīng)的特異性相結(jié)合的一種微量分析技術(shù)。酶標記抗原或抗體后形成的酶標記物

10、，既保留抗原或抗體的免疫活性，又保留了酶的催化活性。當酶標記物與待檢標本中相應(yīng)的抗原或抗體相互作用時，可形成酶標記抗原抗體復(fù)合物。利用復(fù)合物上標記的酶催化無色的底物顯色，其顏色的深淺與待檢標本中抗原或抗體的量相關(guān)。免疫酶技術(shù)分為酶免疫組織化學技術(shù)和酶免疫測定兩大類，目前已發(fā)展成形式各異，各有其優(yōu)點和用途的定位、定量、半定量和超微量分析的技術(shù)。在酶免疫技術(shù)中引進放大系統(tǒng)，使測定的靈敏度達到10-19mol/L，優(yōu)于放射免疫測定，更重要的是沒有放射性污染，酶標記物有效期長，不需要昂貴的儀器等。 一、酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay , ELISA

11、）ELISA是根據(jù)酶免疫測定原理發(fā)展的一種固相免疫酶技術(shù)。其原理是：抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面仍保持免疫活性；抗原或抗體與酶結(jié)合形成的結(jié)合物仍保持其免疫活性和酶活性；結(jié)合物與相應(yīng)抗體或抗原反應(yīng)后，免疫復(fù)合物上標記的酶在遇到相應(yīng)底物時，可以催化底物水解、氧化還原，從而產(chǎn)生有色物質(zhì)，其顏色的深淺與相應(yīng)的抗體或抗原有關(guān)。ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標記的抗原或抗體，酶作用的底物。根據(jù)試劑的來源和標本的性狀以及檢測的具備條件，可設(shè)計出各種不同類型的檢測方法。ELISA有三種基本類型：間接法、雙抗體夾心法、競爭法。（一）間接法測抗體

12、間接法是檢測抗體最常用的方法，其原理為利用酶標記的抗抗體以檢測已與固相結(jié)合的受檢抗體，故稱為間接法。操作步驟如下：（1）將特異性抗原與固相載體連接，形成固相抗原：洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。（2）加稀釋的受檢血清：其中的特異抗體與抗原結(jié)合，形成固相抗原抗體復(fù)合物。經(jīng)洗滌后，固相載體上只留下特異性抗體。其他免疫球蛋白及血清中的雜質(zhì)由于不能與固相抗原結(jié)合，在洗滌過程中被洗去。（3）加酶標抗抗體：與固相復(fù)合物中的抗體結(jié)合，從而使該抗體間接地標記上酶。洗滌后，固相載體上的酶量就代表特異性抗體的量。（4）加底物顯色：顏色深度代表標本中受檢抗體的量。本法只要更換不同的固相抗原，可以用一種酶標抗抗體檢測各種

13、與抗原相應(yīng)的抗體。（二） 雙抗體夾心法雙抗體夾心法是檢測抗原最常用的方法，操作步驟如下：（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)。（2）加受檢標本：使之與固相抗體反應(yīng)一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結(jié)合，形成固相抗原復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合的物質(zhì)。（3）加酶標抗體：使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標抗體結(jié)合。徹底洗滌未結(jié)合的酶標抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關(guān)。（4）加底物：夾心式復(fù)合物中的酶催化底物成為有色產(chǎn)物。根據(jù)顏色反應(yīng)的程度進行該抗原的定性或定量。根據(jù)同樣原理，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標抗原結(jié)合物，即可用雙抗原夾

14、心法測定標本中的抗體。（三） 雙位點一步法在雙抗體夾心法測定抗原時，如應(yīng)用針對抗原分子上兩個不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標抗體，則在測定時可使標本的加入和酶標抗體的加入兩步并作一步。這種雙位點一步不但簡化了操作，縮短了反應(yīng)時間，如應(yīng)用高親和力的單克隆抗體，測定的敏感性和特異性也顯著提高。單克隆抗體的應(yīng)用使測定抗原的ELISA提高到新水平。（四）競爭法競爭法可用于測定抗原，也可用于測定抗體。以測定抗原為例，受檢抗原和酶標抗原競爭與固相抗體結(jié)合，因此結(jié)合于固相的酶標抗原量與受檢抗原的量呈反比。操作步驟如下：（1）將特異抗體與固相載體連接，形成固相抗體。洗滌。（2）待測管中加受檢標

15、本和一定量酶標抗原的混合溶液，使之與固相抗體反應(yīng)。如受檢標本中無抗原，則酶標抗原能順利地與固相抗體結(jié)合。如受檢標本中含有抗原，則與酶標抗原以同樣的機會與固相抗體結(jié)合，競爭性地占去了酶標抗原與固相載體結(jié)合的機會，使酶標抗原與固相載體的結(jié)合量減少。參考管中只加酶標抗原，保溫后，酶標抗原與固相抗體的結(jié)合可達最充分的量。洗滌。 （3）加底物顯色：參考管中由于結(jié)合的酶標抗原最多，故顏色最深。參考管顏色深度與待測管顏色深度之差，代表受檢標本抗原的量。待測管顏色越淡，表示標本中抗原含量越多。（五）捕獲法測IgM抗體血清中針對某些抗原的特異性IgM常和特異性IgG同時存在，后者會干擾IgM抗體的測定。因此測定

16、IgM抗本多用捕獲法，先將所有血清IgM（包括異性IgM和非特異性IgM）固定在固相上，在去除IgG后再測定特異性IgM。操作步驟如下：（1）將抗人IgM抗體連接在固相載體上，形成固相抗人IgM。洗滌。（2）加入稀釋的血清標本：保溫反應(yīng)后血清中的IgM抗體被固相抗體捕獲。洗滌除去其他免疫球蛋白和血清中的雜質(zhì)成分。（3）加入特異性抗原試劑：它只與固相上的特異性IgM結(jié)合。洗滌。（4）加入針對特異性的酶標抗體：使之與結(jié)合在固相上的抗原反應(yīng)結(jié)合。洗滌。（5）加底物顯色：如有顏色顯示，則表示血清標本中的特異性IgM抗體存在，是為陽性反應(yīng)第四節(jié)     

17、   化學發(fā)光免疫分析化學發(fā)光免疫分析（Chemiluminescence Immunoassay，CLIA）是近十年來在世界范圍內(nèi)發(fā)展非常迅速的非放射性免疫分析。它具有高靈敏度、檢測范圍寬、操作簡便快速、標記物穩(wěn)定性好、無污染、儀器簡單經(jīng)濟等優(yōu)點。它是放射性免疫分析與普通酶免疫分析的取代者，是免疫分析重要的發(fā)展方向。CLIA發(fā)展迅猛，已占各種免疫分析的首位?；瘜W發(fā)光是一種特異的化學反應(yīng)，有機分子吸收化學能后發(fā)生能級躍遷，產(chǎn)生一種高能級的電子激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定的中間體，當其返回到基態(tài)而發(fā)出光子，即為化學發(fā)光。將化學發(fā)光與抗原抗體相結(jié)合而形成的免疫分析技術(shù)，即為化學發(fā)光免疫分析?；?/p>

18、學發(fā)光的發(fā)光類型通常分為閃光型（flash type）和輝光型（glow type）兩種。閃光型發(fā)光時間很短，只有零點幾秒到幾秒。輝光型又稱持續(xù)型，發(fā)光時間從幾分鐘到幾十分鐘，或幾小時至更久。閃光型的樣品必須立即測量，必須配以全自動化的加樣及測量儀。測量輝光型的樣品可以使用通用型儀器，也可以配有全自動化儀器。 化學發(fā)光免疫分析的研究現(xiàn)狀：類型原理及試劑發(fā)光類型化學發(fā)光免疫分析（CLIA） 用化學發(fā)光物質(zhì)直接標記抗原或抗體組成 吖啶酯（acrydinum esters）閃光型化學發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 不用化學發(fā)光物直接標記免疫制劑。在酶免疫分析完成后加入化學

19、發(fā)光底物，產(chǎn)生化學發(fā)光 1.         辣根過氧化物酶(HRP)/H2O2/Luminol系統(tǒng) 輝光型1.2. 堿性磷酸酶(AP)/1，2二氧乙烷穩(wěn)定衍生物（AMPPD）系統(tǒng) 輝光型 電化學發(fā)光免疫分析（ECLIA） 應(yīng)用電致化學發(fā)光標記物與電化學手段相結(jié)合產(chǎn)生化學發(fā)光的免疫分析三聯(lián)吡啶釕（Rucbpy）32+三丙胺氨系統(tǒng) 閃光型 第五節(jié) 生物素-親和素技術(shù)親和素（avidin）是一種糖蛋白，分子量60kD，每個分子由4個亞基組成，可以和4個生物素分子親密結(jié)合。親和素可由蛋清中提取，但目前使用較多的是從鏈霉菌中提取的鏈菌蛋白（strepavidin）。生物素（biotin）又稱維生素H，分子量244.31，存在于蛋黃中。用化學方法制成的衍生物，生物素羥基琥珀亞胺酯（biotin-hydroxysuccinimide，BNHS）可與蛋白質(zhì)、糖類和酶