PCR技術(shù)的過程和意義參考模板

1、PCR技術(shù)的過程和意義一、PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的 天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR是一種體外DNA 擴增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴增的DNA片段與其兩側(cè)互補的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性低溫退火引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。在環(huán)境檢測中，靶核酸序列往往存在于個復(fù)雜的混合物如細胞提取液中，且含量很低，對于探測這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大幾個數(shù)量級，再用

2、探針雜交探測對被擴增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。二、PCR技術(shù)的步驟PCR由變性-退火-延伸三個基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1、模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準備；2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結(jié)合；3、引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性

3、-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 24分鐘，23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。到達平臺期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 三、PCR技術(shù)的意義1 / 41、特異性強PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進行，結(jié)

4、合的特異性大大增加，被擴增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2、靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級的起始待測模板擴增到微克（g=-6）水平。能從100萬個細胞中檢出一個靶細胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU(空斑形成單位）；在細菌學(xué)中最小檢出率為3個細菌。3、簡便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴增液和水浴鍋上進行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。

5、4、對標本的純度要求低不需要分離病毒或細菌及培養(yǎng)細胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板。可直接用臨床標本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細胞、活組織等DNA擴增檢測。四、PCR技術(shù)主要應(yīng)用的領(lǐng)域1、核酸的基礎(chǔ)研究：基因組克隆2、不對稱PCR制備單鏈DNA用于DNA測序3、反向PCR測定未知DNA區(qū)域4、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）用于檢測細胞中基因表達水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、熒光定量PCR用于對PCR產(chǎn)物實時監(jiān)控6、cDNA末端快速擴增技術(shù)7、檢測基因的表達8、醫(yī)學(xué)應(yīng)用：檢測細菌、病毒類疾?。辉\斷遺傳疾?。辉\斷腫瘤；應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)。五、關(guān)于RT-PCR4月17

6、日，在北京檢驗檢疫局承擔的國家質(zhì)檢總局科技計劃項目“禽流感病毒H7N9亞型雙重?zé)晒釸T-PCR定型技術(shù)研究”鑒定會上，專家組一致認為：該項目創(chuàng)新性地實現(xiàn)了對禽流感病毒H7N9亞型的一步快速定型，可在一次檢測中確認樣品中是否存在H7N9亞型禽流感病毒或其他H7亞型和N9亞型的禽流感病毒;在通用性、特異性、靈敏性上，技術(shù)優(yōu)勢突出。專家組同意項目成果通過鑒定，并建議在進一步擴大和完善動物臨床驗證實驗基礎(chǔ)上，盡快推廣應(yīng)用。RT-PCR 為反轉(zhuǎn)錄RCR（reverse transcription PCR）和實時PCR（real time PCR）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補DNA，再以此為模板通過PCR進行DNA擴增。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的R