PCR技術(shù)的過(guò)程和意義參考模板

1、PCR技術(shù)的過(guò)程和意義一、PCR技術(shù)的基本原理類似于DNA的 天然復(fù)制過(guò)程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR是一種體外DNA 擴(kuò)增技術(shù)，是在模板DNA、引物和4種脫氧核苷酸存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促合反應(yīng)，將待擴(kuò)增的DNA片段與其兩側(cè)互補(bǔ)的寡核苷酸鏈引物經(jīng)“高溫變性低溫退火引物延伸”三步反應(yīng)的多次循環(huán)，使DNA片段在數(shù)量上呈指數(shù)增加，從而在短時(shí)間內(nèi)獲得我們所需的大量的特定基因片段。在環(huán)境檢測(cè)中，靶核酸序列往往存在于個(gè)復(fù)雜的混合物如細(xì)胞提取液中，且含量很低，對(duì)于探測(cè)這種復(fù)雜群體中的特異微生物或某個(gè)基因，雜交就顯得不敏感。使用PCR技術(shù)可將靶序列放大幾個(gè)數(shù)量級(jí)，再用

2、探針雜交探測(cè)對(duì)被擴(kuò)增序列作定性或定量研究分析微生物群體結(jié)構(gòu)。二、PCR技術(shù)的步驟PCR由變性-退火-延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：1、模板DNA的變性模板DNA經(jīng)加熱至93左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；2、模板DNA與引物的退火(復(fù)性)模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；3、引物的延伸DNA模板-引物結(jié)合 物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈，重復(fù)循環(huán)變性

3、-退火-延伸三過(guò)程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需 24分鐘，23小時(shí)就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。 三、PCR技術(shù)的意義1 / 41、特異性強(qiáng)PCR反應(yīng)的特異性決定因素為：引物與模板DNA特異正確的結(jié)合；堿基配對(duì)原則；Taq DNA聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性；靶基因的特異性與保守性。其中引物與模板的正確結(jié)合是關(guān)鍵。引物與模板的結(jié)合及引物鏈的延伸是遵循堿基配對(duì)原則的。聚合酶合成反應(yīng)的忠實(shí)性及TaqDNA聚合酶耐高溫性，使反應(yīng)中模板與引物的結(jié)合（復(fù)性）可以在較高的溫度下進(jìn)行，結(jié)

4、合的特異性大大增加，被擴(kuò)增的靶基因片段也就能保持很高的正確度。再通過(guò)選擇特異性和保守性高的靶基因區(qū)，其特異性程度就更高。2、靈敏度高PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能將皮克(pg=10-12）量級(jí)的起始待測(cè)模板擴(kuò)增到微克（g=-6）水平。能從100萬(wàn)個(gè)細(xì)胞中檢出一個(gè)靶細(xì)胞；在病毒的檢測(cè)中，PCR的靈敏度可達(dá)3個(gè)RFU(空斑形成單位）；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個(gè)細(xì)菌。3、簡(jiǎn)便、快速PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶，一次性地將反應(yīng)液加好后，即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng)，一般在24 小時(shí)完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無(wú)放射性污染、易推廣。

5、4、對(duì)標(biāo)本的純度要求低不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測(cè)。四、PCR技術(shù)主要應(yīng)用的領(lǐng)域1、核酸的基礎(chǔ)研究：基因組克隆2、不對(duì)稱PCR制備單鏈DNA用于DNA測(cè)序3、反向PCR測(cè)定未知DNA區(qū)域4、反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平、RNA病毒量以及直接克隆特定基因的cDNA5、熒光定量PCR用于對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)時(shí)監(jiān)控6、cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)7、檢測(cè)基因的表達(dá)8、醫(yī)學(xué)應(yīng)用：檢測(cè)細(xì)菌、病毒類疾病；診斷遺傳疾??；診斷腫瘤；應(yīng)用于法醫(yī)物證學(xué)。五、關(guān)于RT-PCR4月17

6、日，在北京檢驗(yàn)檢疫局承擔(dān)的國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目“禽流感病毒H7N9亞型雙重?zé)晒釸T-PCR定型技術(shù)研究”鑒定會(huì)上，專家組一致認(rèn)為：該項(xiàng)目創(chuàng)新性地實(shí)現(xiàn)了對(duì)禽流感病毒H7N9亞型的一步快速定型，可在一次檢測(cè)中確認(rèn)樣品中是否存在H7N9亞型禽流感病毒或其他H7亞型和N9亞型的禽流感病毒;在通用性、特異性、靈敏性上，技術(shù)優(yōu)勢(shì)突出。專家組同意項(xiàng)目成果通過(guò)鑒定，并建議在進(jìn)一步擴(kuò)大和完善動(dòng)物臨床驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，盡快推廣應(yīng)用。RT-PCR 為反轉(zhuǎn)錄RCR（reverse transcription PCR）和實(shí)時(shí)PCR（real time PCR）共同的縮寫。逆轉(zhuǎn)錄PCR，或者稱反轉(zhuǎn)錄PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的一種廣泛應(yīng)用的變形。在RT-PCR中，一條RNA鏈被逆轉(zhuǎn)錄成為互補(bǔ)DNA，再以此為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測(cè)細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作為模板的R