組織DNA提取原理和步驟詳細(xì)（課堂PPT）

1、1組織組織DNADNA提取提取Tissue DNA ExtractionTissue DNA Extraction 實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?shí)驗(yàn)?zāi)康?v學(xué)習(xí)從生物組織中提取學(xué)習(xí)從生物組織中提取DNADNA，為研究為研究DNADNA的理化的理化性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能打好基礎(chǔ)。性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能打好基礎(chǔ)。提取提取DNADNA總的原則：總的原則：1 1 保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；2 2 其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的其他生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降低到最低程度；污染應(yīng)降低到最低程度；3 3 核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶核酸樣品中不應(yīng)存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過

2、高濃度的金屬離子；劑和過高濃度的金屬離子；4 4 其他核酸分子，如其他核酸分子，如RNARNA，也應(yīng)盡量去除。也應(yīng)盡量去除。粉碎組織粉碎組織DNPDNP 裂解液裂解液 裂解細(xì)胞膜、核膜裂解細(xì)胞膜、核膜DNPDNP 苯酚、氯仿苯酚、氯仿 DNADNA（RNARNA） RNA RNA酶酶 Protase Protase 苯酚、乙醇苯酚、乙醇 純純DNA DNA 紫外定量紫外定量原理：原理：各種組織細(xì)胞破碎方法各種組織細(xì)胞破碎方法細(xì)胞破碎方法 應(yīng)用 機(jī)械法1勻漿法機(jī)體軟組織2搗碎法動(dòng)物韌性組織3研磨法細(xì)菌、酵母 物理法1超聲法細(xì)胞混懸液2反復(fù)凍融法培養(yǎng)細(xì)胞3冷熱交替法細(xì)菌、病毒4低滲裂解紅細(xì)胞 化學(xué)

3、法1有機(jī)溶劑細(xì)菌、酵母2去垢劑組織、培養(yǎng)細(xì)胞3酶解法細(xì)菌、酵母破裂細(xì)胞破裂細(xì)胞 、釋放核酸、釋放核酸DNA酚抽提法示意圖DNADNA鑒定鑒定(DNA identification)(DNA identification) 濃度鑒定濃度鑒定(concentration)(concentration) 純度鑒定純度鑒定(purity)(purity) 完整性鑒定完整性鑒定(integrity)(integrity)濃度鑒定濃度鑒定(concentration identification)(concentration identification)1 1）紫外分光光度法）紫外分光光度法(ultra

4、violet spectrophotometery)(ultraviolet spectrophotometery) 測定測定DNADNA在在A A260nm260nm的光吸收值。的光吸收值。 A A260260稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù)5050 g/mlg/ml紫外分光光度法只用于測定濃度大于紫外分光光度法只用于測定濃度大于0.250.25ug/mlug/ml的核酸溶液。的核酸溶液。(A值等于1時(shí)，相當(dāng)于50g/ml雙鏈DNA， 40g/ml單鏈DNA或RNA，20g/ml單鏈寡核苷酸） 各種堿基的紫外吸收光譜各種堿基的紫外吸收光譜2 2）熒光光度法）熒光光度法 熒光染料溴化乙錠（熒光染料溴化乙錠（e

5、thidium bromideethidium bromide，EBEB），可嵌），可嵌入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量入到堿基平面，而發(fā)出熒光，且熒光強(qiáng)度與核酸含量呈正比。呈正比。 適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（適用于低濃度核酸溶液的定量分析。（1-51-5ngng）EB與DNA的結(jié)合500 l全血提取的基因組全血提取的基因組DNA電泳電泳動(dòng)物組織提取基因組動(dòng)物組織提取基因組DNA純度鑒定純度鑒定(purity identification)(purity identification)紫外分光光度法：紫外分光光度法： 在在260260nmnm和和280280nmnm處測定

6、處測定DNADNA溶液的光吸收，純的溶液的光吸收，純的DNADNA， A A260260與與A A280280之比應(yīng)在之比應(yīng)在1.801.80；低于此值表明制備物中留有蛋；低于此值表明制備物中留有蛋白質(zhì)成份。高于此值表明有白質(zhì)成份。高于此值表明有RNARNA的殘留量。的殘留量。 純的純的RNA ARNA A260260與與A A280280之比應(yīng)在之比應(yīng)在2.02.0。 A260/A280A260/A280比值是純度檢測的重要指標(biāo)。比值是純度檢測的重要指標(biāo)。完整性鑒定完整性鑒定(integrity identification)(integrity identification)凝膠電泳法：凝

7、膠電泳法： 基因組基因組DNADNA電泳，在電場中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電電泳，在電場中泳動(dòng)慢，如果發(fā)生降解，可出現(xiàn)電泳圖譜脫尾現(xiàn)象；泳圖譜脫尾現(xiàn)象； 總總RNARNA電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在電泳，觀測各條帶的含量，提示是否存在RNARNA降解；如降解；如加樣槽中存在條帶，可能是加樣槽中存在條帶，可能是DNADNA污染。污染。核酸的貯存核酸的貯存DNADNA保存保存 (storage)(storage)1 1）短期貯存：）短期貯存： 4 4或或-20-20存放于存放于TETE（tristris和和EDTAEDTA）緩沖液中。緩沖液中。 TETE緩沖液的緩沖液的pHpH與與DN

8、A DNA 貯存有關(guān)，貯存有關(guān)，pHpH為為8 8時(shí)，可減少時(shí)，可減少DNADNA脫氨反應(yīng)，脫氨反應(yīng)，pHpH低于低于7.07.0時(shí)時(shí)DNADNA容易變性。容易變性。2 2）長期貯存：）長期貯存： TETE緩沖液中緩沖液中-70-70保存數(shù)年；在保存數(shù)年；在DNADNA溶液中加一滴氯仿溶液中加一滴氯仿可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。可有效防止細(xì)菌和核酸的污染。每克組織每克組織 + + mlml裂解液裂解液 組織勻漿器，勻漿組織勻漿器，勻漿取取2.0ml2.0ml勻漿，加等體積苯酚勻漿，加等體積苯酚- -氯仿，搖勻氯仿，搖勻5 5minmin，2,500rpm 10min2,500rpm 10min

9、 取水相取水相加等體積氯仿加等體積氯仿- -異戊醇異戊醇, ,搖勻搖勻5 5min, 2,500rpm 10minmin, 2,500rpm 10min方法：方法： 取水相取水相 加加5 5M NaClM NaCl至終濃度至終濃度0.30.3M NaCl, M NaCl, 加加2.52.5倍體積倍體積冰無水乙醇冰無水乙醇 ，搖勻，搖勻 見白色沉淀見白色沉淀, ,玻棒挑起玻棒挑起 DNA DNA 70% 70%乙醇洗滌乙醇洗滌一一次次沉淀溶于沉淀溶于1ml TE1ml TE 適當(dāng)稀釋適當(dāng)稀釋紫外分光光度計(jì)測紫外分光光度計(jì)測A A260nm260nm,A,A280nm280nm 吸取吸取DNADN

10、A原液原液 ll，用用ddHddH2 2O O稀釋至稀釋至 l l ，在紫外分光光度計(jì)上測定在紫外分光光度計(jì)上測定A A260nm260nm及及A A280nm280nm，計(jì)算計(jì)算A A2 6 0 n m2 6 0 n m/ A/ A2 8 0 n m2 8 0 n m比 值 及比 值 及 D N AD N A 濃 度 。濃 度 。 一 般 以一 般 以A260nm/280nm1.8A260nm/280nm1.8為標(biāo)準(zhǔn)。為標(biāo)準(zhǔn)。 A260nm/A280nm A260nm/A280nm若若1.61.6，提示有蛋白質(zhì)或，提示有蛋白質(zhì)或酚污染，應(yīng)進(jìn)一步純化。酚污染，應(yīng)進(jìn)一步純化。定量定量DNADNA

11、濃度（濃度（g/mlg/ml）= =A A260nm260nm 50 50 稀釋倍數(shù)稀釋倍數(shù) 1/ 1/光徑光徑* *1 1ODOD值相當(dāng)于值相當(dāng)于5050g/ml dsDNAg/ml dsDNA，40g/ml ssDNA40g/ml ssDNA或或RNARNA，2Og/ml2Og/ml寡核苷酸。寡核苷酸。濃度計(jì)算濃度計(jì)算1.1.裂解液（裂解液（Homogenization bufferHomogenization buffer）: : 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA 1mmol/L EDTA 0.1mo

12、l/L NaCl 0.1mol/L NaCl 1%SDS 1%SDS EDTAEDTA: :抑制抑制DNADNA酶活性酶活性試劑及其作用試劑及其作用SDSSDS是是離子型表面活性劑離子型表面活性劑，主要，主要功能功能：溶解細(xì)胞膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；溶解細(xì)胞膜蛋白而破壞細(xì)胞膜；解聚細(xì)胞中的核蛋白；解聚細(xì)胞中的核蛋白；與蛋白形成復(fù)合物與蛋白形成復(fù)合物2.2.苯酚苯酚- -氯仿氯仿( (Phenol-Chloroform):Phenol-Chloroform): 苯酚：苯酚：強(qiáng)蛋白變性劑強(qiáng)蛋白變性劑 氯仿：氯仿：蛋白變性劑蛋白變性劑，與水不互溶，與苯酚，與水不互溶，與苯酚 互溶，互溶，可以帶走殘余的酚

13、可以帶走殘余的酚。 為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于為什么苯酚要重蒸飽和后才能用于DNADNA的分離？的分離？ 苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自苯酚在空氣中經(jīng)常被氧化生成醌，它能夠產(chǎn)生自由基，直接用于由基，直接用于DNADNA分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，分離，會(huì)使磷酸二酯鍵斷裂，造成造成DNADNA降解。降解。 氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用氧化苯酚需要經(jīng)過高溫重蒸以除去氧化物，并用Tris-HclTris-Hcl飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。飽和酚，并調(diào)節(jié)至中性。3.3.氯仿氯仿- -異戊醇異戊醇（Isoamyl-alcoholIsoamyl-alcohol）：）： 能降低分子表面

14、張力能降低分子表面張力，所以能減少抽提過，所以能減少抽提過程中泡沫的產(chǎn)生，同時(shí)程中泡沫的產(chǎn)生，同時(shí)異戊醇有助于分相，異戊醇有助于分相，使使離心后的上層水相、中層變性蛋白質(zhì)及下層有離心后的上層水相、中層變性蛋白質(zhì)及下層有機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。機(jī)溶劑相維持穩(wěn)定。4.4.冰無水乙醇（冰無水乙醇（Absolute ethonalAbsolute ethonal）和和70%70%乙醇乙醇(70% (70% Ethonal):Ethonal):v無水乙醇無水乙醇會(huì)奪去會(huì)奪去DNADNA周圍的水分子，周圍的水分子，使使DNADNA失去水失去水而易于而易于聚合聚合；可；可除去殘余的氯仿除去殘余的氯仿。v70%70

15、%乙醇乙醇洗滌可洗滌可去除殘余的鹽離子去除殘余的鹽離子，鹽離子的存，鹽離子的存在會(huì)使之不易溶解，并可抑制酶反應(yīng)。在會(huì)使之不易溶解，并可抑制酶反應(yīng)。5.5.TE TE 緩沖液緩沖液 （TE BufferTE Buffer）：）： 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 10mmol/L pH8.0 Tris-HCl 1mmol/L EDTA 1mmol/L EDTA緩沖對(duì)緩沖對(duì)Tris-HClTris-HCl不存在金屬離子的干擾作用不存在金屬離子的干擾作用EDTAEDTA能穩(wěn)定能穩(wěn)定DNADNA的活性的活性。6.20%6.20%SDSSDS（十二烷基磺酸鈉）：十二烷基磺酸鈉）： 抑制抑制

16、DnaseDnase活性活性 7.107.10mg/mlmg/ml蛋白酶蛋白酶K(Protase K)K(Protase K)： 分解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞膜分解蛋白質(zhì)，破壞細(xì)胞膜 8.108.10mg/mlRNAmg/mlRNA酶酶( (RNase)RNase)：分解分解RNARNA9. 59. 5mol/L NaClmol/L NaCl： 減少減少DNADNA分子間的同性電荷相斥力，使分子間的同性電荷相斥力，使DNADNA易于易于相反相反聚合聚合而形成而形成DNADNA鈉鹽沉淀。鈉鹽沉淀。DNADNA提取試驗(yàn)中常遇到提取試驗(yàn)中常遇到的問題的問題v 基因組基因組DNADNA收率較低或無基因組收率較

17、低或無基因組DNADNA 樣本材料太少樣本材料太少 細(xì)胞破裂不夠充分，細(xì)胞破裂不夠充分，DNADNA釋放不完全釋放不完全 離心力偏小離心力偏小 兩相分離不完全兩相分離不完全 v DNADNA降解的原因降解的原因 樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊樣本不夠新鮮，采集材料過陳舊 樣本本身存在大量樣本本身存在大量DNADNA酶酶v 提取提取DNADNA的生物活性差的原因？的生物活性差的原因？ 提取的基因組提取的基因組DNADNA鹽濃度過高鹽濃度過高 基因組基因組DNADNA中乙醇未清除凈中乙醇未清除凈 基因組基因組DNADNA中可能存在其他抑制因素中可能存在其他抑制因素v 提取基因組提取基因組DNADNA，有時(shí)加入蔗糖的原因有時(shí)加入蔗糖的原因 加入多糖，保護(hù)加入多糖，保護(hù)DNADNA長度長度 注意事項(xiàng)注意事項(xiàng) 1.1.處死動(dòng)物取出所用臟器后應(yīng)盡快放入液氮中處死動(dòng)物取出所用臟器后應(yīng)盡快放入液氮中, ,以以免免DNaseDNase引起引起DNADNA降解。在純化過程中要加核酸降解。在純化過程中要加核酸酶抑制劑酶抑制劑( (eg.EDTA),eg.EDTA),以防以防DNADNA自身降解。自身降解。2.2.組織要盡量研磨得細(xì)一點(diǎn)，顆粒太大細(xì)胞裂解組織要盡量研磨得細(xì)一點(diǎn)，顆粒太大細(xì)胞裂解不徹底，在隨后過程