植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上植物體內(nèi)游離脯氨酸含量的測定目的意義植物在正常條件下游離脯氨酸（proline，Pro）含量很低，但在干旱、高溫、低溫、鹽堿、水澇等逆境條件下便會大量積累，并且積累指數(shù)與植物的抗逆性呈正相關(guān)關(guān)系。因此，脯氨酸可作為植物抗逆性的一項生化指標(biāo)，測定其含量也成為抗性生理研究的重要內(nèi)容之一。本實驗的目的是掌握游離脯氨酸含量的測定方法、原理及操作技術(shù)。一、酸性茚三酮法（一）原理植物體內(nèi)的氨基酸只有脯氨酸能與酸性茚三酮發(fā)生反應(yīng)，生成穩(wěn)定的紅色產(chǎn)物。該產(chǎn)物在515nm有一最大吸收高峰，其吸收值與脯氨酸的含量呈直線關(guān)系。因此，樣品中的脯氨酸含量可用酸性茚三酮法測定。除脯氨酸外，酸性和

2、中性氨基酸不能與酸性茚三酮形成紅色產(chǎn)物，堿性氨基酸對這一反應(yīng)只有輕度干擾，在同類樣品的測定中可忽略不計，在不同樣品的測定中可加入人造沸石排除這種干擾。（二）實驗材料、儀器與試劑1. 實驗材料：正常生長與經(jīng)逆境處理的植物莖、葉、穗等器官或組織。2. 儀器：分光光度計、分析天平、離心機(jī)、溫箱、冰箱、移液管、容量瓶、剪刀、鑷子、紗布、研缽、漏斗、濾紙、具塞刻度試管、量筒、培養(yǎng)皿等。3. 試劑：（1）酸性茚三酮試劑：稱取重結(jié)晶茚三酮2.5g放入燒杯，加冰醋酸60mL、6mol·L-1磷酸40mL 于70下溶解，冷卻后裝入棕色瓶內(nèi)貯于4冰箱中，24h內(nèi)穩(wěn)定?，F(xiàn)用現(xiàn)配。（2）100g·

3、mL-1脯氨酸母液：精確稱取脯氨酸0.0100g溶于少量80乙醇中，用蒸餾水定容至100mL。（3）其他試劑：人造沸石、活性炭粉、冰醋酸、80乙醇。（三）操作步驟1. 標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：（1）取7個50mL容量瓶，分別放入脯氨酸母液0.5、1.25、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0g·mL-1。（2）另取具塞刻度試管8只（07號），0號加入2mL蒸餾水，17號分別加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)系列各2mL，再分別加入冰醋酸2mL和茚三酮試劑2mL，充分搖勻，加蓋，沸水浴101

4、5min。以0號管溶液為空白對照，于515nm處比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標(biāo)，脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2. 樣品提取：稱取鮮樣0.51.0g，放入研缽或勻漿器中，加入80乙醇3mL和石英砂少許研成勻漿，移入具塞刻度試管中，并用80乙醇沖洗研缽，勻漿液與洗液合并總量為10mL，加蓋后沸水浴煮沸10min，再加活性炭粉末0.25g，振蕩過濾（用80乙醇沖洗濾紙與殘渣3次），濾液于8085水浴上蒸去乙醇，殘渣用蒸餾水洗滌并定容至100mL供測定之用。3. 樣品測定：取大試管1只，加樣品提取液10mL和人造沸石1g，搖動10min并濾去人造沸石。取具塞刻度試管2只，各加入上述過濾樣液2

5、mL、冰醋酸2mL、茚三酮試劑2mL，搖勻后加蓋，于沸水浴中煮沸1015min，冷卻后于515nm下比色，記錄OD值。（四）結(jié)果計算式中：為樣品脯氨酸含量（g·g-1）；為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得脯氨酸濃度（g·mL-1）；為樣品稀釋體積（mL）；為樣品重量（g）?！靖阶ⅰ扛彼崤c茚三酮于100下的反應(yīng)時間需嚴(yán)格控制，不宜過久，否則將產(chǎn)生沉淀。二、磺基水楊酸法（一）原理當(dāng)用磺基水楊酸提取植物樣品時，脯氨酸便游離于磺基水楊酸的溶液中，然后用酸性茚三酮加熱處理后，溶液即成紅色，再用甲苯處理，則色素全部轉(zhuǎn)移至甲苯中。色素顏色的深淺即表示脯氨酸含量的高低。在520nm波長下比色測定吸光度，

6、從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出脯氨酸的含量。（二）實驗材料、儀器與試劑1. 實驗材料：待測植物（水稻小麥、玉米、高粱、大豆等）葉片。2. 儀器：分光光度計、冰浴鍋、研缽、小燒杯、容量瓶、具塞刻度試管、普通試管、移液管、注射器、漏斗、濾紙、剪刀等。3. 試劑：（1）酸性茚三酮溶液：將1.25g茚三酮溶于30mL冰醋酸和20mL 6mol·L-1磷酸中，攪拌加熱（70）溶解，貯于冰箱中。（2）3磺基水楊酸：稱取3g磺基水楊酸加蒸餾水溶解后定容至100mL。（3）其他試劑：冰醋酸、甲苯。（三）操作步驟1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作（1）在分析天平上精確稱取25mg脯氨酸，倒入小燒杯內(nèi)，用少量蒸餾水溶解，然后倒入250

7、mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，此標(biāo)準(zhǔn)液濃度為100g·mL-1。（2）取6個50mL容量瓶，分別加入脯氨酸原液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL，用蒸餾水定容至刻度，搖勻，各瓶的脯氨酸濃度分別為l、2、3、4、5、6g·mL-1。（3）取6支具塞刻度試管，分別吸取2mL系列標(biāo)準(zhǔn)濃度的脯氨酸溶液及2mL冰醋酸和2mL酸性茚三酮溶液，每管在沸水浴中加熱30min。（4）冷卻后各試管準(zhǔn)確加入4mL甲苯，振蕩30s，靜置片刻，使色素全部轉(zhuǎn)至甲苯溶液。（5）用注射器輕輕吸取各管上層脯氨酸甲苯溶液至比色杯中，以甲苯溶液為空白對照，于520 nm波長處進(jìn)行比色。（6）以消光值為縱坐標(biāo)，脯氨酸濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2樣品的測定（1）準(zhǔn)確稱取不同處理的待測植物葉片各0.5g，分別置于具塞刻度試管中，然后向各管分別加入5mL 3磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10min（提取過程中要經(jīng)常搖動），冷卻后過濾于干凈的試管中，濾液即為脯氨酸的提取液。（2）吸取2mL提取液于另一干凈的具塞刻度試管中，加入2mL冰醋酸及2mL酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30min，溶液即呈紅色。（3）冷卻后加入4mL甲苯，搖蕩30s，靜置片刻，取上層液至10mL離心管中，以3000rpm離心5min。（4）用注射器輕輕吸取上層脯氨