第七章固定化酶-酶應(yīng)用過程

1、第七章固定化酶第七章固定化酶- -酶應(yīng)用過酶應(yīng)用過程程酶應(yīng)用過程中的一些不足酶應(yīng)用過程中的一些不足 酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如酶的穩(wěn)定性較差：除了某些耐高溫的酶，如-淀粉酶淀粉酶等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的等；和胃蛋白酶等可以耐受較低的pHpH條件以外，大多數(shù)條件以外，大多數(shù)的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響的酶在高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿和重金屬離子等外界因素影響下，都容易變性失活。下，都容易變性失活。 酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這酶的一次性使用：酶一般都是在溶液中與底物反應(yīng)，這樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)物混在一起，反應(yīng)結(jié)束樣酶在反應(yīng)系統(tǒng)中，與底物和產(chǎn)

2、物混在一起，反應(yīng)結(jié)束后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一后，即使酶仍有很高的活力，也難于回收利用。這種一次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連次性使用酶的方式，不僅使生產(chǎn)成本提高，而且難于連續(xù)化生產(chǎn)。續(xù)化生產(chǎn)。 產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在產(chǎn)物的分離純化較困難：酶反應(yīng)后成為雜質(zhì)與產(chǎn)物混在一起，無疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步的分離純化帶來一定的困難。一起，無疑給產(chǎn)物的進(jìn)一步的分離純化帶來一定的困難。 固定化技術(shù)固定化技術(shù)什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性載體水不溶性載體水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技術(shù)固定化技術(shù)v在一定空間

3、內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)的酶，能連續(xù)地進(jìn)在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)利用。行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)利用。 固定化酶的優(yōu)點(diǎn)：固定化酶的優(yōu)點(diǎn)： 酶與產(chǎn)物、底物易分開；酶與產(chǎn)物、底物易分開； 可多批次使用和裝柱連續(xù)反應(yīng)；可多批次使用和裝柱連續(xù)反應(yīng)； 提高酶的穩(wěn)定性；提高酶的穩(wěn)定性； 產(chǎn)物中無酶殘留，簡化產(chǎn)品純化工藝；產(chǎn)物中無酶殘留，簡化產(chǎn)品純化工藝； 提高酶的使用效率，成本降低；提高酶的使用效率，成本降低； 增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量。增加產(chǎn)物收率，提高產(chǎn)物質(zhì)量。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 酶活力損失；酶活力損失； 增加了酶的成本；增加了酶的成本； 只適用于可溶性底物，尤其可溶

4、性小分子只適用于可溶性底物，尤其可溶性小分子底物，對(duì)大分子不適宜；底物，對(duì)大分子不適宜； 不適宜于多酶反應(yīng)。不適宜于多酶反應(yīng)。選擇載體選擇載體 應(yīng)考慮：應(yīng)考慮： 載體的形式：薄片狀、管狀、纖維狀、顆載體的形式：薄片狀、管狀、纖維狀、顆粒狀等；粒狀等； 載體的結(jié)構(gòu)：孔型、半透膜性和非孔型；載體的結(jié)構(gòu)：孔型、半透膜性和非孔型； 載體的性質(zhì)：水溶性和水不溶性；載體的性質(zhì)：水溶性和水不溶性； 酶偶聯(lián)量或裝載量和實(shí)效系數(shù)。酶偶聯(lián)量或裝載量和實(shí)效系數(shù)。 無機(jī)（無機(jī)（inorganicinorganic） 天然有機(jī)（天然有機(jī)（organic from natural organic from natural

5、 sources)sources) 合成有機(jī)（合成有機(jī)（organic synthetic organic synthetic materials)materials)酶固定化時(shí)遵循的原則：酶固定化時(shí)遵循的原則： 維持酶的催化活性和專一性；維持酶的催化活性和專一性； 固定化應(yīng)有利于自動(dòng)化、連續(xù)化反應(yīng)；固定化應(yīng)有利于自動(dòng)化、連續(xù)化反應(yīng)； 固定化酶應(yīng)具有最小的空間位阻；固定化酶應(yīng)具有最小的空間位阻； 酶與載體必須牢固結(jié)合；酶與載體必須牢固結(jié)合； 固定化酶應(yīng)具有最大的穩(wěn)定性；固定化酶應(yīng)具有最大的穩(wěn)定性； 固定化酶易與產(chǎn)物分離；固定化酶易與產(chǎn)物分離； 固定化酶成本要低；固定化酶成本要低； 充分考慮固定

6、化酶在制備工程和應(yīng)用中的安全充分考慮固定化酶在制備工程和應(yīng)用中的安全因素。因素。酶的固定化方法酶的固定化方法 1 1 非化學(xué)結(jié)合法：非化學(xué)結(jié)合法： 結(jié)晶法、分散法、物結(jié)晶法、分散法、物理吸附法、離子結(jié)合法；理吸附法、離子結(jié)合法； 2 2 化學(xué)結(jié)合法：交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法；化學(xué)結(jié)合法：交聯(lián)法、共價(jià)結(jié)合法； 3 3 包埋法：微囊法、網(wǎng)格法。包埋法：微囊法、網(wǎng)格法。非化學(xué)結(jié)合法非化學(xué)結(jié)合法 結(jié)晶法：使酶結(jié)晶從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法。結(jié)晶法：使酶結(jié)晶從而實(shí)現(xiàn)固定化的方法。 分散法：將酶分散于水不溶相中而實(shí)現(xiàn)固分散法：將酶分散于水不溶相中而實(shí)現(xiàn)固定。定。 超濾反應(yīng)體系超濾反應(yīng)體系 離子結(jié)合：酶通過離子鍵結(jié)合具

7、有離子交離子結(jié)合：酶通過離子鍵結(jié)合具有離子交換基的水不溶性載體的固定化方法。換基的水不溶性載體的固定化方法。常常用載體用載體: :DEAE-DEAE-纖維素，纖維素， DEAE-DEAE-葡聚糖凝膠葡聚糖凝膠等。等。使用注意使用注意：pHpH、離子強(qiáng)度、溫度、離子強(qiáng)度、溫度吸附法：物理吸附、離子交換吸附法：物理吸附、離子交換 吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸吸附：利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上而實(shí)現(xiàn)每固定化的方法。附在其表面上而實(shí)現(xiàn)每固定化的方法。 常用的固體吸附劑：常用的固體吸附劑： 無機(jī)載體：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶無機(jī)載體：活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、

8、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、白土、漂瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石、白土、漂白土、高嶺石、氧化鋁、金屬氧化物。白土、高嶺石、氧化鋁、金屬氧化物。 天然及合成高分子載體：淀粉、天然及合成高分子載體：淀粉、CMCCMC、DEAE-DEAE-纖纖維素、大孔樹脂維素、大孔樹脂 非共價(jià)作用力，如靜電、范德華力、離子鍵和非共價(jià)作用力，如靜電、范德華力、離子鍵和氫鍵等。氫鍵等。物理吸附 通過氫鍵、疏水鍵、電子親和力等物理作通過氫鍵、疏水鍵、電子親和力等物理作用用 選擇載體的原則選擇載體的原則 （1 1）要有巨大的比表面積）要有巨大的比表面積 （2 2） 要有活潑的表面要有活潑的表面 （3 3） 便于裝柱進(jìn)行

9、連續(xù)反應(yīng)。便于裝柱進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)。 缺點(diǎn)：結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固缺點(diǎn)：結(jié)合力較弱，酶與載體結(jié)合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制而容易脫落，所以使用受到一定的限制離子鍵結(jié)合法 通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。通過離子鍵使酶與載體結(jié)合的固定化方法。 使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常使用的載體是某些不溶于水的離子交換劑。常用的有用的有DEAE-DEAE-纖維素、纖維素、TEAE-TEAE-纖維素、纖維素、DEAE-DEAE-葡聚葡聚糖凝膠等糖凝膠等 。 固定化方法：條件溫和，操作簡單，在一定固定化方法：條件溫和，操作簡單，在一定pHpH，T T、離子強(qiáng)度下，酶液與載體混合

10、攪拌幾個(gè)小時(shí)、離子強(qiáng)度下，酶液與載體混合攪拌幾個(gè)小時(shí)/ /酶液流過處理好的離子交換柱，獲得固定化酶。酶液流過處理好的離子交換柱，獲得固定化酶。 應(yīng)用：制備過程中，活力損失較少。但是，離應(yīng)用：制備過程中，活力損失較少。但是，離子鍵結(jié)合力較弱，結(jié)合不牢固，在子鍵結(jié)合力較弱，結(jié)合不牢固，在pHpH和離子強(qiáng)和離子強(qiáng)度等條件改變時(shí)，酶容易脫落。在酶催化反應(yīng)度等條件改變時(shí)，酶容易脫落。在酶催化反應(yīng)時(shí)，要控制好時(shí)，要控制好pHpH、離子強(qiáng)度和溫度等條件。、離子強(qiáng)度和溫度等條件。吸附吸附法法原理原理載體載體優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)缺點(diǎn)物理物理吸附吸附通過氫鍵、疏水鍵通過氫鍵、疏水鍵和和- -電子親和力等電子親和力等物理作用力

11、將酶固物理作用力將酶固定于水不溶性載體定于水不溶性載體無無機(jī)機(jī)載載體體高嶺土、皂土、高嶺土、皂土、硅膠、氧化鋁、硅膠、氧化鋁、微孔玻璃微孔玻璃吸附量較低，多為吸附量較低，多為1mg1mg蛋白蛋白/ /每克吸附劑；易每克吸附劑；易使某些酶發(fā)生吸附變使某些酶發(fā)生吸附變性性有有機(jī)機(jī)載載體體纖維素、膠原、纖維素、膠原、以及火棉膠以及火棉膠吸附容量高，通常高吸附容量高，通常高于于50mg50mg蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)/ /每克膠每克膠原膜；不易使酶發(fā)生原膜；不易使酶發(fā)生變性變性離子離子交換交換吸附吸附在適宜的在適宜的PHPH和離子和離子強(qiáng)度條件下，利用強(qiáng)度條件下，利用酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)酶的側(cè)鏈解離基團(tuán)和離子交換基團(tuán)

12、的和離子交換基團(tuán)的相互作用而達(dá)到酶相互作用而達(dá)到酶的固定化的固定化CM-CM-纖維素、纖維素、DEAE-DEAE-纖纖維素、維素、DEAE-DEAE-葡聚糖凝葡聚糖凝膠、膠、Amberlitex-97Amberlitex-97、Dowex-50Dowex-50吸附容量大于物理吸吸附容量大于物理吸附，約附，約50-150mg50-150mg蛋白蛋白/ /每克載體每克載體 物理吸附和離子交換吸附的比較物理吸附和離子交換吸附的比較吸附法的優(yōu)點(diǎn)吸附法的優(yōu)點(diǎn)不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶活影響很小，無副作用。不發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，對(duì)酶活影響很小，無副作用。固定化操作簡單，條件溫和，固定化操作簡單，條件溫和，容易再生，吸

13、附劑可反復(fù)使用。容易再生，吸附劑可反復(fù)使用。缺點(diǎn)：缺點(diǎn)：作用力弱，容易泄漏，污染產(chǎn)物，作用力弱，容易泄漏，污染產(chǎn)物，載體非專一性結(jié)合其他物質(zhì)載體非專一性結(jié)合其他物質(zhì)被吸附的酶要過量，酶損耗大被吸附的酶要過量，酶損耗大解決途徑：解決途徑：開發(fā)新的載體開發(fā)新的載體 根據(jù)載體的性質(zhì)對(duì)酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，以增加吸根據(jù)載體的性質(zhì)對(duì)酶進(jìn)行適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾，以增加吸附力附力包埋法（包埋法（entrapping methodentrapping method） 定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載定義：將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。 包埋法分

14、為網(wǎng)格型和微囊型包埋法分為網(wǎng)格型和微囊型 1 1網(wǎng)格型網(wǎng)格型 2 2微囊型微囊型網(wǎng)格型網(wǎng)格型 概念概念 將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，將酶或含酶菌體包埋在凝膠細(xì)微網(wǎng)格中，制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。制成一定形狀的固定化酶，稱為網(wǎng)格型包埋法。也稱為凝膠包埋法也稱為凝膠包埋法p包埋劑：較好的機(jī)械強(qiáng)度、半透性、惰性、不與酶發(fā)包埋劑：較好的機(jī)械強(qiáng)度、半透性、惰性、不與酶發(fā)生物理化學(xué)變化、包埋后酶活性喪失少等。生物理化學(xué)變化、包埋后酶活性喪失少等。p固定微生物細(xì)胞最為廣泛，多酶體系的包埋。固定微生物細(xì)胞最為廣泛，多酶體系的包埋。p高分子化合物：聚丙烯酰胺、聚乙烯酰胺、高分子化合物：聚

15、丙烯酰胺、聚乙烯酰胺、p天然高分子：淀粉、明膠、海藻酸等。天然高分子：淀粉、明膠、海藻酸等。微囊型包埋法微囊型包埋法 酶包埋在各種高分子聚合物半透膜中制成的小酶包埋在各種高分子聚合物半透膜中制成的小球，制成固定化酶。球，制成固定化酶。 形成的固定化酶小球直徑一般幾微米至幾百微形成的固定化酶小球直徑一般幾微米至幾百微米，所以也稱為微囊化法。米，所以也稱為微囊化法。 半透膜的孔徑。顆粒比網(wǎng)格型小，有利于底物半透膜的孔徑。顆粒比網(wǎng)格型小，有利于底物和產(chǎn)物擴(kuò)散。和產(chǎn)物擴(kuò)散。v反應(yīng)條件要求高，反應(yīng)條件要求高，成本高成本高v半透膜材料：聚酰半透膜材料：聚酰胺、火棉膠、硝化胺、火棉膠、硝化纖維、聚苯乙烯、纖

16、維、聚苯乙烯、殼聚糖等。殼聚糖等。化學(xué)結(jié)合法化學(xué)結(jié)合法 共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法 交聯(lián)法交聯(lián)法共價(jià)鍵結(jié)合法共價(jià)鍵結(jié)合法 （1 1）概念：通過共價(jià)鍵將酶蛋白分子上的反應(yīng)）概念：通過共價(jià)鍵將酶蛋白分子上的反應(yīng)基團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合，從而使酶固定基團(tuán)與載體表面反應(yīng)基團(tuán)結(jié)合，從而使酶固定化的方法?；姆椒ā?（2 2）可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)：）可以形成共價(jià)鍵的基團(tuán)： 游離氨基，游離氨基， 游游離羧基，離羧基， 巰基，巰基， 咪唑基，咪唑基， 酚基，酚基， 羥基，羥基， 甲甲硫基，硫基， 吲哚基，二硫鍵吲哚基，二硫鍵 （3 3）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚）常用載體：天然高分子、人工合成的高聚

17、物、無機(jī)載體，如：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡物、無機(jī)載體，如：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀聚糖凝膠、甲殼質(zhì)、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物醇共聚物 共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的共價(jià)鍵結(jié)合法制備固定化酶的“通式通式” 1.1.首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán)首先載體上引進(jìn)活潑基團(tuán) 2.2.然后活化該活潑基團(tuán)然后活化該活潑基團(tuán) 3.3.最后最后, ,活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形活潑基團(tuán)再與酶分子上某一基團(tuán)形成共價(jià)鍵成共價(jià)鍵載體活化的方法載體活化的方法 A A重氮法重氮法 B B疊氮法疊氮法 C C烷基化反應(yīng)法烷基化反應(yīng)法 D D硅烷化法硅烷化法 E E溴化氰法溴化氰法A重氮法重

18、氮法v使用較多的載體是對(duì)氨基苯磺酰乙基（使用較多的載體是對(duì)氨基苯磺酰乙基（ABSEABSE）纖維）纖維素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等素、瓊脂糖，葡聚糖凝膠和瓊脂等v載體具有芳香族氨基，苯氨基與亞硝酸生成重氮鹽載體具有芳香族氨基，苯氨基與亞硝酸生成重氮鹽衍生物，引入活潑的重氮基團(tuán)。衍生物，引入活潑的重氮基團(tuán)。v重氮基團(tuán)與酶分子的酚基、咪唑基發(fā)生偶聯(lián)。重氮基團(tuán)與酶分子的酚基、咪唑基發(fā)生偶聯(lián)。B B 疊氮法疊氮法 羧基的載體，酯化，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載羧基的載體，酯化，與肼基作用生成含有酰肼基團(tuán)的載體，再與亞硝酸活化，生成活潑的疊氮化合物，最后于體，再與亞硝酸活化，生成活潑的疊氮化合物，最

19、后于酶偶聯(lián)。酶偶聯(lián)。 疊氮基團(tuán)與酶分子的氨基、羥基、巰基反應(yīng)，固定化酶。疊氮基團(tuán)與酶分子的氨基、羥基、巰基反應(yīng)，固定化酶。如如CM-CM-纖維素、纖維素、葡聚糖、聚氨基葡聚糖、聚氨基酸、乙烯酸、乙烯- -順丁順丁烯二酸酐共聚等烯二酸酐共聚等C C烷基化反應(yīng)法烷基化反應(yīng)法 首先，含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物首先，含羥基的載體可用三氯三嗪等多鹵代物進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活潑載體。進(jìn)行活化，形成含有鹵素基團(tuán)的活潑載體。 然后，與酶分子的氨基、巰基、羥基烷基化反然后，與酶分子的氨基、巰基、羥基烷基化反應(yīng)偶聯(lián)固定化酶應(yīng)偶聯(lián)固定化酶. .D D 溴化氰法溴化氰法 用溴化氰（用溴化氰（CNBrC

20、NBr）活化多糖類物質(zhì)。）活化多糖類物質(zhì)。 載體：如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂載體：如纖維素、葡聚糖、瓊脂糖等，其中以瓊脂糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。糖為載體的占多數(shù)（大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)）。 用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用溴化氰法活化瓊脂糖制備得到的固定化酶目前使用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。用很廣，特別用作親和層析，有著良好的性能。E硅烷化法v一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。一般常用的載體：多孔玻璃，多孔陶瓷。v多孔玻璃特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。多孔玻璃特點(diǎn)：機(jī)械強(qiáng)度好，表面積大。v耐有機(jī)溶劑和微生物破壞耐有機(jī)溶劑和微生物破壞, ,載體再生，壽命長

21、。載體再生，壽命長。 共價(jià)結(jié)合法優(yōu)點(diǎn)：共價(jià)結(jié)合法優(yōu)點(diǎn)： 結(jié)合牢固，固定化酶的穩(wěn)定性好，利于連結(jié)合牢固，固定化酶的穩(wěn)定性好，利于連續(xù)使用，不會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)條件等原因輕易脫續(xù)使用，不會(huì)因?yàn)榉磻?yīng)條件等原因輕易脫落，應(yīng)用和報(bào)道最多的一種方法。落，應(yīng)用和報(bào)道最多的一種方法。 缺點(diǎn)：缺點(diǎn)： 反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜，反應(yīng)條件苛刻，操作復(fù)雜， 引起高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，破環(huán)活性中心，不易引起高級(jí)結(jié)構(gòu)變化，破環(huán)活性中心，不易得到比活力高的固定化酶，酶活回收率得到比活力高的固定化酶，酶活回收率30%30%， 底物專一性會(huì)發(fā)生變化。底物專一性會(huì)發(fā)生變化。交聯(lián)法交聯(lián)法 借助雙功能試劑使酶分子之間發(fā)生交聯(lián)作借助雙功能試劑使酶分子之

22、間發(fā)生交聯(lián)作用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為用，制成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的固定化酶的方法稱為交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的交聯(lián)法。也可用于含酶菌體或菌體碎片的固定化。固定化。交聯(lián)法常用試劑交聯(lián)法常用試劑 常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、常用試劑：戊二醛、異氰酸酯、N N，N N乙烯馬來亞乙烯馬來亞胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。胺、雙重氮聯(lián)苯胺等。 應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個(gè)醛基都可以與酶或應(yīng)用最廣泛的是戊二醛，它兩個(gè)醛基都可以與酶或蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿蛋白質(zhì)的游離氨基形成席夫堿(shiff)(shiff)，而交聯(lián)成，而交聯(lián)成固定化酶固定化酶 交聯(lián)法固定化酶的特點(diǎn)交聯(lián)法固定化酶的特點(diǎn): :結(jié)合牢固，可長

23、時(shí)間使用結(jié)合牢固，可長時(shí)間使用交聯(lián)反應(yīng)條件較劇烈，酶分子多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，交聯(lián)反應(yīng)條件較劇烈，酶分子多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，酶活力損失較大酶活力損失較大顆粒較小，使用不便。顆粒較小，使用不便。p通常交聯(lián)、吸附法或包埋法聯(lián)合使用，取長補(bǔ)通常交聯(lián)、吸附法或包埋法聯(lián)合使用，取長補(bǔ)短。短。（1 1） 吸附交聯(lián)法吸附交聯(lián)法（2 2） 交聯(lián)包埋法交聯(lián)包埋法 吸附交聯(lián)法：吸附交聯(lián)法：酶先吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛酶先吸附在硅膠、皂土、氧化鋁、球狀酚醛樹脂或大孔離子交換樹脂，樹脂或大孔離子交換樹脂，再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，也稱殼狀固再用戊二醛等雙功能試劑交聯(lián)，也稱殼狀固定化酶。定化酶。 交聯(lián)包埋法：交聯(lián)包埋

24、法：1st step:1st step:酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝酶液和雙功能試劑（戊二醛）凝結(jié)成顆粒很細(xì)的聚合體。結(jié)成顆粒很細(xì)的聚合體。2nd step2nd step：高分子或多糖類物質(zhì)包埋成顆粒。：高分子或多糖類物質(zhì)包埋成顆粒。避免顆粒太細(xì)的缺點(diǎn)，固定化酶穩(wěn)定性好。避免顆粒太細(xì)的缺點(diǎn)，固定化酶穩(wěn)定性好。方法方法優(yōu)點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)缺點(diǎn)缺點(diǎn)非非化化學(xué)學(xué)結(jié)結(jié)合合法法結(jié)晶結(jié)晶法法提供非常高的酶濃度，對(duì)于活力提供非常高的酶濃度，對(duì)于活力較低的酶來說具有很大的優(yōu)越性；較低的酶來說具有很大的優(yōu)越性；應(yīng)用時(shí)可大大縮短反應(yīng)時(shí)間應(yīng)用時(shí)可大大縮短反應(yīng)時(shí)間在不斷重復(fù)循環(huán)中，酶會(huì)有損在不斷重復(fù)循環(huán)中，酶會(huì)有損耗，從而使固

25、定化酶濃度降低耗，從而使固定化酶濃度降低分散分散法法通過過濾或離心法將酶與介質(zhì)完通過過濾或離心法將酶與介質(zhì)完全分離，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)酶的再利用全分離，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)酶的再利用酶分散不好將會(huì)引起傳質(zhì)效應(yīng)，酶分散不好將會(huì)引起傳質(zhì)效應(yīng)，使酶的催化活力降低。使酶的催化活力降低。物理物理吸附吸附法法活性中心不易被破壞，高級(jí)結(jié)構(gòu)活性中心不易被破壞，高級(jí)結(jié)構(gòu)變化少，操作方便，條件溫和，變化少，操作方便，條件溫和，載體價(jià)廉易得、可反復(fù)使用等。載體價(jià)廉易得、可反復(fù)使用等。酶與載體結(jié)合力弱，酶容易脫酶與載體結(jié)合力弱，酶容易脫落。落。離子離子結(jié)合結(jié)合法法操作簡單、處理?xiàng)l件溫和、酶活操作簡單、處理?xiàng)l件溫和、酶活性中心氨基酸殘基和酶

26、高級(jí)結(jié)構(gòu)性中心氨基酸殘基和酶高級(jí)結(jié)構(gòu)不易被破壞，酶的回收率高不易被破壞，酶的回收率高酶與載體結(jié)合力弱，容易受緩酶與載體結(jié)合力弱，容易受緩沖液或沖液或pHpH的影響，離子強(qiáng)度高的影響，離子強(qiáng)度高時(shí)酶易脫落時(shí)酶易脫落化化學(xué)學(xué)結(jié)結(jié)合合法法共價(jià)共價(jià)結(jié)合結(jié)合法法酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)因底物酶與載體結(jié)合牢固，不會(huì)因底物濃度高或存在鹽而脫落濃度高或存在鹽而脫落反應(yīng)條件苛刻、操作復(fù)雜；活反應(yīng)條件苛刻、操作復(fù)雜；活性中心、酶高級(jí)結(jié)構(gòu)和酶專一性中心、酶高級(jí)結(jié)構(gòu)和酶專一性易受破壞性易受破壞交聯(lián)交聯(lián)法法比較牢固，可長時(shí)間使用比較牢固，可長時(shí)間使用反應(yīng)條件激烈，酶多個(gè)基團(tuán)被反應(yīng)條件激烈，酶多個(gè)基團(tuán)被交聯(lián)，活力損失大，顆

27、粒小交聯(lián)，活力損失大，顆粒小固定化酶操作的注意事項(xiàng)固定化酶操作的注意事項(xiàng) 活性中心：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性活性中心：保護(hù)酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基團(tuán)固有的高級(jí)結(jié)構(gòu)不受到損害，中心的氨基酸基團(tuán)固有的高級(jí)結(jié)構(gòu)不受到損害，在制備固定化酶時(shí)，需要在非常嚴(yán)密的條件下在制備固定化酶時(shí)，需要在非常嚴(yán)密的條件下進(jìn)行。進(jìn)行。 功能基團(tuán)：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的功能基團(tuán)：如游離的氨基、羧基、半胱氨酸的巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨巰基、組氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、絲氨酸和蘇氨酸的羥基等，當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶酸和蘇氨酸的羥基等，當(dāng)這些功能基團(tuán)位于酶的活性中心時(shí)，要求不參與酶的

28、固定化結(jié)合的活性中心時(shí)，要求不參與酶的固定化結(jié)合 酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等酶的高級(jí)結(jié)構(gòu)：要避免用高溫、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等處理，而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會(huì)使酶變處理，而且有機(jī)溶劑、高濃度的鹽也會(huì)使酶變性、失活，因此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條性、失活，因此，操作應(yīng)盡量在非常溫和的條件下進(jìn)行。件下進(jìn)行。固定化酶的性質(zhì)及其影響因素 影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素 固定化后酶性質(zhì)的變化固定化后酶性質(zhì)的變化 評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)影響固定化酶性質(zhì)的因素影響固定化酶性質(zhì)的因素 1.1.酶本身的變化，酶本身的變化， 主要是由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀主要是

29、由于活性中心的氨基酸殘基、高級(jí)結(jié)構(gòu)和電荷狀態(tài)等發(fā)生了變化。態(tài)等發(fā)生了變化。 2 2固定化方法的影響固定化方法的影響 3.3.載體的影響載體的影響 固定化酶的周圍形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層，固定化酶的周圍形成了能對(duì)底物產(chǎn)生立體影響的擴(kuò)散層，以及靜電的相互作用等引起的變化。以及靜電的相互作用等引起的變化。 （1 1） 分配效應(yīng)分配效應(yīng) （2 2） 空間障礙效應(yīng)空間障礙效應(yīng) （3 3） 擴(kuò)散限制效應(yīng)擴(kuò)散限制效應(yīng) 4.載體與酶直接作用：載體與酶直接作用： 活力喪失、破壞酶結(jié)構(gòu)、封閉酶活性部位活力喪失、破壞酶結(jié)構(gòu)、封閉酶活性部位固定化后酶性質(zhì)的變化固定化后酶性質(zhì)的變化 固定化對(duì)酶活性的影響：固定

30、化對(duì)酶活性的影響： 固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響 pHpH的變化的變化 最適溫度變化最適溫度變化 底物特異性變化底物特異性變化 米氏常數(shù)米氏常數(shù)KmKm的變化，的變化，KmKm值隨載體性質(zhì)變化值隨載體性質(zhì)變化1 1 固定化對(duì)酶活性的影響固定化對(duì)酶活性的影響 酶活性下降，反應(yīng)速度下降酶活性下降，反應(yīng)速度下降 原因：原因：酶結(jié)構(gòu)的變化、構(gòu)象變化，影響活性中心氨基酶結(jié)構(gòu)的變化、構(gòu)象變化，影響活性中心氨基酸酸空間位阻：活性中心對(duì)底物的定位空間位阻：活性中心對(duì)底物的定位內(nèi)擴(kuò)散阻力：底物與活性中心的接近內(nèi)擴(kuò)散阻力：底物與活性中心的接近包埋時(shí)被高分子物質(zhì)半透膜包圍，大分子底物包埋時(shí)被高分子物

31、質(zhì)半透膜包圍，大分子底物難以進(jìn)去。難以進(jìn)去。p個(gè)別情況：酶活提高，化學(xué)偶聯(lián)使得到化學(xué)修個(gè)別情況：酶活提高，化學(xué)偶聯(lián)使得到化學(xué)修飾。飾。2 2 固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響固定化對(duì)酶穩(wěn)定性的影響 （1 1）操作穩(wěn)定性提高）操作穩(wěn)定性提高 （2 2）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。）貯存穩(wěn)定性比游離酶大多數(shù)提高。 (3)(3)熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降熱穩(wěn)定性，大多數(shù)升高，有些反而降低。低。 (4(4）對(duì)分解酶的穩(wěn)定性提高。）對(duì)分解酶的穩(wěn)定性提高。 （5）pH穩(wěn)定性提高，明顯優(yōu)于游離酶穩(wěn)定性提高，明顯優(yōu)于游離酶 （6）對(duì)有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性提高）對(duì)有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性提高p穩(wěn)定性提高的原因：穩(wěn)定性提高的原因

32、：固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：固定化后酶穩(wěn)定性提高的原因：酶分子與載體多點(diǎn)連接，防止酶分子伸展變酶分子與載體多點(diǎn)連接，防止酶分子伸展變形，增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度形，增加了酶活性構(gòu)象的牢固程度酶活力的釋放是緩慢的。酶活力的釋放是緩慢的。酶與載體結(jié)合后，失去了分子間的相互作用酶與載體結(jié)合后，失去了分子間的相互作用的機(jī)會(huì)，抑制了酶自降解的機(jī)會(huì)，抑制了酶自降解，提高了酶穩(wěn)定性。，提高了酶穩(wěn)定性。阻擋了不利因素對(duì)酶的侵襲阻擋了不利因素對(duì)酶的侵襲限制了酶分子間的相互作用，但若固定化觸限制了酶分子間的相互作用，但若固定化觸及到酶的活性敏感區(qū)，也可能導(dǎo)致酶的穩(wěn)定及到酶的活性敏感區(qū)，也可能導(dǎo)致酶的穩(wěn)定性下降

33、。性下降。 pH的變化 pHpH對(duì)酶活性的影響：對(duì)酶活性的影響： （1 1） 改變酶的空間構(gòu)象改變酶的空間構(gòu)象 （2 2）影響酶的催化基團(tuán)的解離）影響酶的催化基團(tuán)的解離 （3 3）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離）影響酶的結(jié)合基團(tuán)的解離 （4 4）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物）改變底物的解離狀態(tài)，酶與底物不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。不能結(jié)合或結(jié)合后不能生成產(chǎn)物。pH對(duì)固定化酶的影響 載體帶負(fù)電荷，載體帶負(fù)電荷，pHpH向堿性方向移動(dòng)。向堿性方向移動(dòng)。 載體帶正電荷，載體帶正電荷，pHpH向酸性方向移動(dòng)。向酸性方向移動(dòng)。v微環(huán)境是指在固定化微環(huán)境是指在固定化酶附近的局部環(huán)境，酶附近的局部環(huán)境，v而把主體

34、溶液稱為宏而把主體溶液稱為宏觀環(huán)境。觀環(huán)境。 最適溫度變化最適溫度變化 隨熱穩(wěn)定性的提高，最適溫度隨之提高隨熱穩(wěn)定性的提高，最適溫度隨之提高 少數(shù)例外，最適溫度下降，活性或其他因素會(huì)改善少數(shù)例外，最適溫度下降，活性或其他因素會(huì)改善 底物特異性變化底物特異性變化 專一性會(huì)發(fā)生不同程度的變化專一性會(huì)發(fā)生不同程度的變化 作用于小分子底物的酶：特異性沒有明顯變化作用于小分子底物的酶：特異性沒有明顯變化 既可作用于小分子底物又可作用于大分子低物的酶：既可作用于小分子底物又可作用于大分子低物的酶：特異性往往會(huì)變化。特異性往往會(huì)變化。米氏常數(shù)米氏常數(shù)Km的變化，的變化，Km值隨載體性質(zhì)變值隨載體性質(zhì)變化化

35、米氏常數(shù)反映酶與底物的親合力：米氏常數(shù)反映酶與底物的親合力： KmKm升高，酶與底物的親和力降低升高，酶與底物的親和力降低 載體的帶電性能影響載體的帶電性能影響KmKm變化變化( (電中性載體，擴(kuò)散限電中性載體，擴(kuò)散限制使表觀制使表觀KmKm上升上升) )。 帶電載體與底物之間的靜電作用會(huì)引起底物分子在擴(kuò)散帶電載體與底物之間的靜電作用會(huì)引起底物分子在擴(kuò)散層和整個(gè)溶液之間不均一分布：層和整個(gè)溶液之間不均一分布：（1 1） 載體與底物帶相同電荷，載體與底物帶相同電荷，KmKm KmKm 固定化酶降低了酶的親和力。固定化酶降低了酶的親和力。（2 2） 載體與底物電荷相反，靜電作用，載體與底物電荷相反

36、，靜電作用，KmKmKmKm評(píng)價(jià)固定化酶的指標(biāo)： 1. 1. 固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具固定化酶的比活：每（克）干固定化酶所具有的酶活力單位。或：單位面積（有的酶活力單位?；颍簡挝幻娣e（cmcm2 2）的酶活）的酶活力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。力單位表示（酶膜、酶管、酶板）。 2. 2. 操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。操作半衰期：衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。 連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活連續(xù)測(cè)活條件下固定化酶活力下降為最初活力一半所需要的時(shí)間（力一半所需要的時(shí)間（t t1/21/2） 3. 酶結(jié)合效率酶結(jié)合效率v4. 4. 酶活力回收率酶活力回收率（或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)

37、）（或稱偶聯(lián)效率，活力保留百分?jǐn)?shù)）四 固定化酶的活力測(cè)定方法介紹1. 振蕩測(cè)定法：稱取一定量的固定化酶振蕩測(cè)定法：稱取一定量的固定化酶 加入一定量的加入一定量的底物溶液，底物溶液， 一邊振蕩或攪拌，一邊進(jìn)行催化反應(yīng)一邊振蕩或攪拌，一邊進(jìn)行催化反應(yīng) 取出一定量的反應(yīng)液進(jìn)行酶活力測(cè)定。取出一定量的反應(yīng)液進(jìn)行酶活力測(cè)定。2. 酶柱測(cè)定法：將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有恒溫裝置的反酶柱測(cè)定法：將一定量的固定化酶裝進(jìn)具有恒溫裝置的反應(yīng)柱中應(yīng)柱中 讓底物溶液以一定的流速流過酶柱讓底物溶液以一定的流速流過酶柱 收集流收集流出的反應(yīng)液出的反應(yīng)液 測(cè)定其中產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量測(cè)定其中產(chǎn)物的生成量或底物的消耗量

38、 3. 3. 連續(xù)測(cè)定法：利用連續(xù)分光光度法等測(cè)定方法可以連續(xù)測(cè)定法：利用連續(xù)分光光度法等測(cè)定方法可以對(duì)固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，從而測(cè)定固定化酶的對(duì)固定化酶反應(yīng)液進(jìn)行連續(xù)測(cè)定，從而測(cè)定固定化酶的酶活力。酶活力。 固定化細(xì)胞 固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行固定在載體上并在一定的空間范圍內(nèi)進(jìn)行生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞生命活動(dòng)的細(xì)胞稱為固定化細(xì)胞. 該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代該細(xì)胞能進(jìn)行正常的生長、繁殖和新陳代謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。謝，又稱固定化活細(xì)胞或固定化增殖細(xì)胞。固定化細(xì)胞的特點(diǎn)保持了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好保持了細(xì)胞的完整結(jié)構(gòu)和天然狀態(tài)，穩(wěn)定性好保持了細(xì)胞內(nèi)原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，保證保持了細(xì)胞內(nèi)原有的酶系、輔酶體系和代謝調(diào)控體系，保證了細(xì)胞的代謝途徑和代謝調(diào)控了細(xì)胞的代謝途徑和代謝調(diào)控發(fā)酵穩(wěn)定性好，可反復(fù)使用；發(fā)酵穩(wěn)定性好，可反復(fù)使用；固定化細(xì)胞密度提高，可以提高產(chǎn)率；固定化細(xì)胞密度提高，可以提高產(chǎn)率；提高了工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性提高了工程菌的質(zhì)粒穩(wěn)定性細(xì)胞固定化方法 吸附法 包埋法v