細(xì)胞融合的原理與技術(shù)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上細(xì)胞融合的原理與技術(shù)摘要：細(xì)胞工程是生物工程主要組成之一，出現(xiàn)于20世紀(jì)70年代末至80年代初，是在細(xì)胞水平上改變細(xì)胞的遺傳特性或通過大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)以獲得人們所需物質(zhì)的技術(shù)過程。隨著細(xì)胞融合技術(shù)的不斷改進和完善，動物、植物及微生物細(xì)胞融合技術(shù)無論在基礎(chǔ)理論研究還是在實際應(yīng)用中產(chǎn)生的影響將日益顯著。1.細(xì)胞融合原理細(xì)胞融合技術(shù)是20世紀(jì)60年代迅速發(fā)展起來的一項新興細(xì)胞工程技術(shù)。細(xì)胞融合(cell fusion)也稱細(xì)胞雜交( cellhybridization) 、原生質(zhì)體融合(protoplast fusion)或體細(xì)胞雜交(somatic hybridizatio

2、n), 是指細(xì)胞通過介導(dǎo)和培養(yǎng), 在離體條件下用人工方法將不同種的細(xì)胞通過無性方式融合( 合并) 成一個核或多核的雜合細(xì)胞的過程。體細(xì)胞融合后可形成四倍體或多倍體細(xì)胞，由此形成的雜交細(xì)胞，其特性會有很大的變化。細(xì)胞融合大體分三個階段進行。第一階段是制出細(xì)胞融合體。首先要用氧把細(xì)胞分散開，再把細(xì)胞壁溶解掉，這時的細(xì)胞就成了原生質(zhì)體。原生質(zhì)體用聚乙烯乙二醇(PEG)處理后，再把PEG洗掉，形成原生質(zhì)體的結(jié)合。第二階段是融合子的鑒定。利用利于融合子生存的培養(yǎng)基刪選出已經(jīng)融合的雜種細(xì)胞。第三階段是培養(yǎng)融合細(xì)胞階段。融合細(xì)胞在細(xì)菌培養(yǎng)基或是不含有細(xì)菌的液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，結(jié)合細(xì)胞反復(fù)分裂后，形成細(xì)胞團

3、，把細(xì)胞團移植于含有植物激素的培養(yǎng)基里長出莖、葉，再把它們移植于土壤之中或嫁接于植物體上，繼續(xù)生長形成新植物。1.1動物細(xì)胞融合一些致癌病毒雖然能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合,但由于具有毒性大等潛在的危險性而在應(yīng)用上受到很大的限制,由此科研人員又試圖嘗試使用滅活的病毒來作為促融物,并且以異種細(xì)胞作為融合對象。1965年,英國Harris等報告滅活病毒可以用來融合不同種動物的細(xì)胞,并且指出由此產(chǎn)生的雜交細(xì)胞可以存活。當(dāng)時世界上許多報刊很快就對這一發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)上的重要性做出了評價,認(rèn)為這是在細(xì)胞融合研究中的又一次突破。他們的貢獻在于證明了滅活的病毒可以作為一般方法用來在一定的條件下融合動物細(xì)胞,而且差異很大的動

4、物種之間的細(xì)胞可以被誘導(dǎo)融合,融合的細(xì)胞可以存活。1967年Weise和Green發(fā)現(xiàn)在人和鼠的融合細(xì)胞中,人的染色體優(yōu)先丟失,并證明利用這一特點有可能對人染色體上的基因進行定位。1970年Ladda又進一步發(fā)展了去核的小鼠成纖維細(xì)胞進行融合實驗,開始了各種細(xì)胞重組的研究工作。從發(fā)現(xiàn)病毒能夠誘導(dǎo)細(xì)胞融合之后,動物細(xì)胞融合的研究工作迅速發(fā)展起來。然而,由于HVJ誘導(dǎo)細(xì)胞融合存在著病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異大等原因,人們一直試圖發(fā)現(xiàn)一種替代物作介質(zhì)誘導(dǎo)細(xì)胞融合。1.2植物細(xì)胞融合植物細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展可追溯到1937年,Mi-chel用0. 5 mol/L硝酸鈉處理原生質(zhì)體使之凝集

5、、融合。但那時還不能用酶法大量制備原生質(zhì)體,使實驗受到原生質(zhì)體數(shù)量的限制,因此植物細(xì)胞融合的起步比動物細(xì)胞融合要遲十年左右。直到1960年Cocking用酶法大量制備有活力的原生質(zhì)體獲得成功,才使植物原生質(zhì)體的融合工作迅速發(fā)展起來。1972年美國科學(xué)家Carlson等將粉藍(lán)煙草和郎氏煙草兩個異種的體細(xì)胞融合成功。20世紀(jì)70年代,細(xì)胞融合的研究范圍又?jǐn)U展到植物間、動物間、動植物間、甚至人體細(xì)胞與動植物細(xì)胞之間。1.3微生物細(xì)胞融合1975年原生質(zhì)體融合技術(shù)已擴展運用到微生物中,匈牙利的Ferenczy首先報道PEG促使真菌融合,以后的成功報道涉及酵母、霉菌、細(xì)菌、放線菌等多種微生物的種間以至屬

6、間,使細(xì)胞融合技術(shù)繼動、植物之后,在微生物中也形成了實驗體系。2.細(xì)胞融合技術(shù)細(xì)胞融合技術(shù)作為細(xì)胞工程的核心基礎(chǔ)技術(shù)之一,已在農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領(lǐng)域取得了開創(chuàng)性的研究成果,而且應(yīng)用領(lǐng)域不斷擴大。細(xì)胞融合技術(shù)不僅為核質(zhì)關(guān)系、基因調(diào)控、遺傳互補、細(xì)胞免疫學(xué)、腫瘤發(fā)生、基因定位、衰老控制等理論領(lǐng)域的研究提供了有力的手段,而且被廣泛應(yīng)用于免疫學(xué)、遺傳學(xué)、發(fā)生生物學(xué),特別是在單克隆抗體及動植物遠(yuǎn)緣雜交育種等方面具有十分重要的意義。細(xì)胞融合技術(shù)大體上可分為化學(xué)誘導(dǎo)融合、生物誘導(dǎo)融合和物理誘導(dǎo)融合三類。2.1化學(xué)誘導(dǎo)融合2.1.1鹽類融合法此法是應(yīng)用最早的誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法。鹽類融合劑對原生質(zhì)體的破壞小

7、。今后研究應(yīng)提高其融合率 ,使其對液泡化發(fā)達的原生質(zhì)體能夠誘發(fā)融合。 2.1.2高鈣和高 pH值融合法Keller首先發(fā)現(xiàn)高 Ca2 +和高 pH值可以誘發(fā)融合。Melchers用此法將煙草種內(nèi) 2個光敏感突變體誘導(dǎo)融合成功并獲得 100余株體細(xì)胞雜種。提高該方法的使用范圍是亟待解決的問題。 2.1.3聚乙二醇融合法 ( PEG法)1974 年發(fā)現(xiàn)的高效融合劑聚乙二醇(PEG)使不同科屬的植物原生質(zhì)體之間都可以融合，融合率可達30%。聚乙二醇是乙二醇的多聚化合物，存在一系列不同分子量的多聚體。PEG可與水分子借氫鍵結(jié)合，導(dǎo)致細(xì)胞脫水而發(fā)生質(zhì)膜結(jié)構(gòu)的變化，從而引起細(xì)胞融合。為了發(fā)揮PEG 促進細(xì)

8、胞融合的效力，必須采用較高的濃度(40%50%，分子量為6000)，但PEG 在高濃度下，細(xì)胞可能因脫水而受到顯著的破壞。因此，選擇合適的分子量、濃度及作用時間是PEG融合技術(shù)的關(guān)鍵。影響原生質(zhì)體融合的因素很多。特別是環(huán)境中的陽離子存在，融合時的pH 也對原生質(zhì)體融合有較明顯的影響。一般來講鈣、鎂離子有助于融合。如有鈣離子存在時，可得到較高的融合率。但在缺乏鈣離子時，若pH 較低，融合頻率也較高。這是因為鈣離子和帶負(fù)電荷的PEG與細(xì)胞膜表面分子相互作用，使原生質(zhì)體帶電，彼此易于附著發(fā)生凝集所致。PEG誘導(dǎo)細(xì)胞融合由于具有容易制備和控制、活性穩(wěn)定、使用方便等特點，在細(xì)胞融合領(lǐng)域取得了可喜的成績，

9、大量的研究仍采用此法。雖然PEG作為融合劑有很多成功的報道，但存在著對細(xì)胞損傷大、殘存有毒性、融合率較底及經(jīng)驗性大等缺陷。2.2 物理誘導(dǎo)融合2.2.1細(xì)胞電融合技術(shù)細(xì)胞電融合是以脂質(zhì)膜和脂質(zhì)一蛋白質(zhì)膜的電學(xué)性質(zhì)為基礎(chǔ)的，以雙向電泳和電子擊穿細(xì)胞質(zhì)膜的聯(lián)合作用為手段，和細(xì)胞電注射構(gòu)成一對互補技術(shù)。在短時間強電場的作用下，細(xì)胞膜發(fā)生可逆性電擊穿(Reverisb leb reakdown)，瞬時失去其高電阻和低通透特性，然后在數(shù)分鐘后恢復(fù)原狀。當(dāng)可逆電擊穿發(fā)生在兩個相鄰細(xì)胞的接觸區(qū)時，即可誘導(dǎo)他們的膜相互融合，從而導(dǎo)致細(xì)胞融合。細(xì)胞融合分為兩步：第一步是建立細(xì)胞間接觸(cell-to-cell

10、contact) ； 第二步，接受區(qū)膜結(jié)構(gòu)受擾動而紊亂，然后恢復(fù)并融合。根據(jù)其誘導(dǎo)細(xì)胞接觸的性質(zhì)，分為特異性和非特異性兩大類。非特異性細(xì)胞電融合法是指在進行細(xì)胞電融合時，無法排除親本細(xì)胞的自體融合而只進行雙親本間的細(xì)胞雜交融合。主要原因是細(xì)胞間的相互接觸是無選擇性的，是非特異性細(xì)胞聚集。非特異性電融合技術(shù)包括細(xì)胞物理聚集電融合法和細(xì)胞化學(xué)聚集電融合法。細(xì)胞融合所必需的兩個步驟為：細(xì)胞間接觸；接觸區(qū)的膜結(jié)構(gòu)受到瞬間擾動而導(dǎo)致融合。只要其中的任意一步有特異性，就能形成特異性的細(xì)胞融合。與使用PEG的化學(xué)法相比，電融合誘導(dǎo)法是一種非常高效的細(xì)胞融合方法。電融合技術(shù)的優(yōu)點在于：融合頻率高，是PEG的1

11、00倍；操作簡便、快速；對細(xì)胞無毒；可在鏡下觀察融合過程。故這種方法得以在短期內(nèi)被廣泛采用，成為細(xì)胞融合的主要技術(shù)手段。該方法的缺點是必須購置專用的細(xì)胞電融合設(shè)備。2.2.2 激光誘導(dǎo)法激光誘導(dǎo)細(xì)胞融合術(shù)是利用激光微束對相鄰細(xì)胞接觸區(qū)的細(xì)胞膜進行破壞(或擾動)，可將兩個不同特性、不同大小的細(xì)胞在顯微鏡下實現(xiàn)融合。即利用光鑷捕捉并拖動一個細(xì)胞使之靠近另一個細(xì)胞并緊密接觸，然后對接觸處進行脈沖激光束處理，使質(zhì)膜發(fā)生光擊穿，產(chǎn)生微米級的微孔。這樣，由于質(zhì)膜上微孔的可逆性，細(xì)胞開始變形融合，最終成為一個細(xì)胞。使用此技術(shù)時， 使細(xì)胞接觸的方法可用光俘虜法；用低濃度的融合劑PEG (5% )使細(xì)胞聚法。目

12、前，最新穎的方法是利用激光光阱建立兩細(xì)胞間接觸，即光鑷(potical tweezers)利用激光高斯光束光場的梯度力把細(xì)胞從光束邊緣拉向光束中間，在光斑直徑與光波波長尺度相比擬時，指向束腰的軸向梯度力要大于沿光束方向的散射力，該梯度力把細(xì)胞豎直地拉到激光束腰下方處，從而實現(xiàn)對細(xì)胞的操作。激光微束融合法與病毒法、PEG法、電融合法相比較，可選擇任意兩個細(xì)胞進行融合，易于實現(xiàn)特異性細(xì)胞融合，作用于細(xì)胞的應(yīng)力小，定時、定位性強，損傷小，參數(shù)易于控制，操作方便，可利用監(jiān)控器清晰地觀察整個融合過程，實驗重復(fù)性好，無菌，無毒性。但它只能逐一處理細(xì)胞，不能像其他方法一樣同時處理大量細(xì)胞。而且由于其所需設(shè)備

13、昂貴復(fù)雜，操作技術(shù)難度大，很難推廣應(yīng)用。在微生物原生質(zhì)體融合中應(yīng)用激光微束技，融合效率較低且喪失了高度選擇性的優(yōu)點有賴后續(xù)步驟檢出融合子激光誘導(dǎo)融合技術(shù)仍處在發(fā)展初期，還有待進一步完善。2.3生物誘導(dǎo)融合(仙臺病毒(HvJ)誘導(dǎo)法)1962年日本的岡田善雄(Okada)偶然發(fā)現(xiàn)了由日本血凝性病毒(HVJ)或稱仙臺病毒引起的艾氏腹水瘤細(xì)胞融合成多核細(xì)胞的現(xiàn)象。岡田善雄的研究為人工誘導(dǎo)體細(xì)胞雜交奠定了方法學(xué)基礎(chǔ)。細(xì)胞融合現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)引起細(xì)胞學(xué)界的高度重。1965年英國的Harris和Watkins在利用滅活病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合方面做了大量的工作，并進一步利用這種滅活病毒來誘導(dǎo)不同種動物細(xì)胞間的融合。自從

14、發(fā)現(xiàn)活病毒可在體內(nèi)介導(dǎo)癌細(xì)胞融合后，人們又實現(xiàn)了滅活病毒促進動物異種細(xì)胞的融合，從而打破了細(xì)胞融合的種屬屏障，推動細(xì)胞融合技術(shù)躍上新的臺階。但是，利用滅活的病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合，存在著許多問題，如病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活病毒的效價差異大、實驗的重復(fù)性差、融合率很低等。目前，這種方法主要適用于動物細(xì)胞融合，用于實驗室研究。2.4新細(xì)胞融合技術(shù)2.4.1離子束細(xì)胞融合技術(shù)雷電、輻射等自然過程中產(chǎn)生的低能離子可作用于生物體，20世紀(jì)80 年代中期，中國科學(xué)院等離子體物理研究所余增亮等人發(fā)現(xiàn)并證實了離子注入生物效應(yīng)和粒子沉積生物效應(yīng)的存在，建立了質(zhì)量、能量、電荷三因子作用機制體系。在離子束與生物體相互

15、作用中，粒子的植入、動量的傳遞和電荷交換可導(dǎo)致細(xì)胞表面被刻蝕，引起細(xì)胞膜透性和跨膜電場的改變，據(jù)此原理，發(fā)展了離子束誘導(dǎo)細(xì)胞融合技術(shù)。由于用于輻照的離子束的參數(shù)除了能量可調(diào)外，離子種類、電荷、質(zhì)量皆可調(diào)，因此，離子束的可操縱性高，可以用微束對細(xì)胞進行超微加工，有目的地切割染色體用于基因工程和細(xì)胞工程，通過消除部分染色體或染色體的某些片段達到細(xì)胞非對稱融合的目的。此項研究一旦成功，將改變傳統(tǒng)的一對一細(xì)胞融合的弊端，減少供體細(xì)胞導(dǎo)入的染色體范圍，使融合更具目的性，大大減少篩選的工作量，將是細(xì)胞融合研究的一大進步。2.4.2空間細(xì)胞融合技術(shù)植物細(xì)胞融合過程中由于地面上地球重力的存在，有液泡的原生質(zhì)體

16、與無液泡的原生質(zhì)體的密度差加大，異源細(xì)胞融合得率十分有限。在利用動物細(xì)胞融合生產(chǎn)單克隆抗體過程中，在地面上由于無法排除地球重力的影響，要提高B淋巴細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞的融合得率相當(dāng)困難?？臻g站微重力環(huán)境沒有重力沉降、熱對流和靜水壓等特點，不僅是研究重力生物學(xué)問題的理想場所，而且也為那些在地面因重力限制而難以發(fā)展的生物技術(shù)提供了新的機遇。20世紀(jì)80年代以來，德國細(xì)胞電融合技術(shù)發(fā)明家Zimmermann等人在空間材料科學(xué)的啟發(fā)下，試圖利用空間微重力條件改進細(xì)胞融合技術(shù)。大量的飛行實驗結(jié)果表明，在微重力條件下酵母細(xì)胞雜種得率有很大的增加。融合得率增加顯然是由于沒有重力沉降影響的緣故，雜種細(xì)胞活力增加可

17、能是細(xì)胞排列時間縮短引起的。最近的飛行試驗結(jié)果表明在微重力條件下，哺乳動物細(xì)胞融合得率增加10倍，有活力的雜種細(xì)胞數(shù)比地面對照增加2倍。植物有無液泡原生質(zhì)體的電融合得率，在微重力條件下比地面增加10-15倍。在取得這些成功實驗的基礎(chǔ)上，進一步研究融合后的細(xì)胞在空間培養(yǎng)的可能性已經(jīng)開始。2.4.3非對稱細(xì)胞融合技術(shù)即利用某種外界因素(常為射線，即融合，gamma-fusion) 輻照某一細(xì)胞原生質(zhì)體，選擇性地破壞其細(xì)胞核。并用碘乙酰胺堿性蕊香紅6 G處理在細(xì)胞核中含有優(yōu)良基因的第二種原生質(zhì)體，選擇性地使其細(xì)胞質(zhì)失活。然后融合來自這兩個原生質(zhì)體品系的細(xì)胞，從而實現(xiàn)所需胞質(zhì)和細(xì)胞核基因的優(yōu)化組合，或

18、使前者被打碎的細(xì)胞核染色體片段中的個別基因滲入到后者原生質(zhì)體的染色體內(nèi)，實現(xiàn)有限基因的轉(zhuǎn)移，從而在保留親本之一全部優(yōu)良性狀的同時改良其某個不良性狀。實踐表明非對稱細(xì)胞融合技術(shù)通過射線和X射線等照射，為實現(xiàn)供體親本少數(shù)基因的轉(zhuǎn)移，創(chuàng)造種間、屬間雜種提供了可能性。值得注意的是，此方法特別適用于細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的轉(zhuǎn)移，通過輻照胞質(zhì)不育的原生質(zhì)體，破壞其染色體，與其具有優(yōu)良性狀品種的原生質(zhì)體融合，從而獲得實用的新的胞質(zhì)不育系。這些都是常規(guī)育種所做不到的。2.4.4高通量細(xì)胞融合芯片高通量細(xì)胞融合芯片利用微電極陣列在微米范圍內(nèi)(1040m)產(chǎn)生的高強度、高梯度輻射電場，使得細(xì)胞在特殊輻射電場的作用下產(chǎn)

19、生介電質(zhì)電泳力，精確處理和刺激預(yù)定的目標(biāo)細(xì)胞，從而使目標(biāo)細(xì)胞按照預(yù)先設(shè)計的方向(可以是任何預(yù)先設(shè)計好的方向)以預(yù)定的速度(可以是不同種的細(xì)胞以不同的速度定向)移動，從而按照設(shè)計要求準(zhǔn)確地、大批量地得到目標(biāo)細(xì)胞配型，集成微電極陣列的微流控系統(tǒng)，可以方便靈活地實現(xiàn)對細(xì)胞的操作、隔離和轉(zhuǎn)移由于在微通道內(nèi)微電極間距可以做得很小，因此獲得同樣強度的輻射電場強度只需施加較低電壓的交變電場和脈沖即可，不用加載昂貴的高電壓發(fā)生裝置。高通量細(xì)胞融合芯片可以與化學(xué)誘導(dǎo)融合、電誘導(dǎo)融合等方法相互結(jié)合，比如：在細(xì)胞融合緩沖液中加入少量的PEG可大大提高細(xì)胞的融合率此外，二價陽離子(例如：鈣離子)以及蛋白酶對細(xì)胞進行預(yù)

20、處理，融合率也可大幅提高。2.4.5基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)隨著微機電系統(tǒng)(MEMS)技術(shù)和微加工技術(shù)的發(fā)展。微電極陣列的設(shè)計加工制作也日趨成熟，加之微通道網(wǎng)絡(luò)可以整合到生物芯片之上，這將使得微流控系統(tǒng)成為細(xì)胞融合的理想平臺，利用微流控系統(tǒng)可以按照預(yù)定的要求大量融合異種細(xì)胞。目前，基于微流控芯片的細(xì)胞融合技術(shù)已成為細(xì)胞融合技術(shù)研究的重點領(lǐng)域。利用基于芯片技術(shù)的微流控系統(tǒng)不僅可以實現(xiàn)對細(xì)胞甚至單個細(xì)胞的操控，比如轉(zhuǎn)移、定位、變形等，也可以同時輸送、合并、分離和分選大量細(xì)胞，細(xì)胞融合在芯片上可以通過并行或快速排隊的方式實現(xiàn)此外由于在微通道內(nèi)的腔體容積很小，所以會大幅減少細(xì)胞融合中所需的細(xì)胞數(shù)量，同時細(xì)胞融合率和雜合細(xì)胞的成活率會大大提高。3.細(xì)胞融合技術(shù)的應(yīng)用及發(fā)展前景縱觀細(xì)胞融合技術(shù)的發(fā)展歷史，細(xì)胞融合技術(shù)的不斷改進一方面表現(xiàn)在融合劑上，另一方面體現(xiàn)在新方法上，再者體現(xiàn)在融合對象的不斷擴展上。融合劑走過了從活病毒，滅活病毒生物階段到PEG化學(xué)物質(zhì)階段；新方法不斷涌現(xiàn)，從生物學(xué)，化學(xué)方法，物理學(xué)方法過渡到各種方法的綜合應(yīng)用乃至應(yīng)用空間技術(shù)。