基因組DNA的提取

1、核酸的提取技術主要技術nDNA分子的分離和鑒定n切割技術n載體DNA分離、鑒定n宿主細胞：原核細胞、酵母、真核細胞nDNA導入技術：轉化、轉染、轉導n重組子鑒定：酶切、PCR技術n表達產(chǎn)物的鑒定及活性測定目的基因 載體DNA(限制性內切酶切開)宿主細胞重組體已轉化的宿主細胞繁殖陽性克隆株表 達基因克隆示意圖目的基因載體DNA+dGTP+dCTPPolyGPolyC3333一、實驗原理一、實驗原理1、核酸的分類、核酸的分類l DNA DNA 主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量主要存在于細胞核的染色體中。核外也有少量DNADNA，如線粒體如線粒體DNADNA（mtDNAmtDNA），葉綠體）

2、，葉綠體DNADNA（cpDNAcpDNA），質粒），質粒DNADNA。l RNARNA 存在于細胞質中，如存在于細胞質中，如mRNA, rRNA, tRNAmRNA, rRNA, tRNA等。等。l 除上述除上述DNADNA，RNARNA外，還有非細胞形式存在的病毒和外，還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含噬菌體，其或只含DNADNA，或只含有，或只含有RNARNA。l分離純化核酸總的原則：分離純化核酸總的原則： 應保證核酸一級結構的完整性；應保證核酸一級結構的完整性； 排除其它分子的污染。排除其它分子的污染。l核酸純化應達到的要求：核酸純化應達到的要求： 核酸樣品中不應存在對酶有抑制

3、作用的有機溶劑和過高核酸樣品中不應存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子；濃度的金屬離子； 其它生物大分子的污染應降低到最低程度；其它生物大分子的污染應降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。排除其它核酸分子的污染。2、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則一、實驗原理一、實驗原理l核酸制備時應注意的事項核酸制備時應注意的事項: : 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。 減少化學因素對核酸的降解。減少化學因素對核酸的降解。 減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫 防止核酸的生物降解。防止核酸的生物降解。 3、

4、核酸制備的一般原則、核酸制備的一般原則一、實驗原理一、實驗原理l核酸制備的步驟：核酸制備的步驟：I. I.材料準備材料準備II.II.破碎細胞或包膜內容物釋放破碎細胞或包膜內容物釋放III.III.核酸分離、純化核酸分離、純化IV.IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質沉淀或吸附核酸，并去除雜質 V.V.核酸溶解在適量緩沖液或水中核酸溶解在適量緩沖液或水中l(wèi)核酸酶的抑制和抑制劑核酸酶的抑制和抑制劑 降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當然，幾個條件并用更好。 對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。 對于RNA，因分子較小

5、，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設法抑制RNase更重要。4、核酸制備的一般方法和原理、核酸制備的一般方法和原理一、實驗原理一、實驗原理l核酸酶的抑制和抑制劑 DNase抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬酸鈉，DNase基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。l核酸酶的抑制和抑制劑 RNase抑制 操作要帶手套。 所有器皿要嚴格消毒， 試劑處理 低溫操作 在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。 l核酸制備中常用的去垢劑核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負電荷，結合帶正電荷的蛋白質。用于核

6、酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑，去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂； 2溶解核糖體上面的蛋白質，使其解聚，將核酸釋放出來； 3對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：如：SDSSDS、脫氧膽酸鈉、脫氧膽酸鈉、4-4-氨基水楊酸鈉、萘氨基水楊酸鈉、萘-1.5-1.5-二磺酸鈉、二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉三異丙基萘磺酸鈉l核酸制備中常用的蛋白質變性劑核酸制備中常用的蛋白質變性劑 蛋白質變性劑的作用：蛋白質變性劑的作用： 1. 1.使蛋白質變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造使蛋白質變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。成蛋白污染。 2.2.使蛋白質變

7、性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。使蛋白質變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3.3.某些蛋白質變性劑也有抑制某些蛋白質變性劑也有抑制RNaseRNase活性和破裂細胞的作用?；钚院推屏鸭毎淖饔谩?如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、0.1%DEPC-0.1%DEPC-焦碳酸二乙酯焦碳酸二乙酯 l核酸制備中常用的酶核酸制備中常用的酶 DNaseDNase RNase RNase 蛋白酶蛋白酶K K 溶菌酶溶菌酶 l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程1 1）破碎細胞）破碎細胞（防止核酸酶的作用）（防止核酸酶的作用） 微生物微生物：溶菌酶、：溶菌酶、SDSSDS裂解。裂解。 高等植物

8、高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶，酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復凍融或液氮凍后組織搗碎。冰凍法：反復凍融或液氮凍后組織搗碎。 動物動物：液氮處理后用勻漿器破碎。：液氮處理后用勻漿器破碎。 細胞器細胞器DNADNA：首先純化細胞器。：首先純化細胞器。 以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程2 2）破碎抽提核酸除去雜質）破碎抽提核酸除去雜質 1 1首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與 其它成分分離其它成分分離 2 2使核

9、酸與蛋白質分離使核酸與蛋白質分離 3 3除去脂類除去脂類 4 4多糖的除去多糖的除去l核酸提取的一般過程核酸提取的一般過程 3 3）核酸的純化）核酸的純化 根據(jù)所需核酸的性質和特點除去其它核酸污根據(jù)所需核酸的性質和特點除去其它核酸污染染, ,并除去提取過程中的系列試劑并除去提取過程中的系列試劑( (鹽、有機溶劑鹽、有機溶劑等）雜質，最后得到均一的核酸樣品。等）雜質，最后得到均一的核酸樣品。 4 4）核酸樣品的保存）核酸樣品的保存核酸保存的主要條件是核酸保存的主要條件是溫度溫度和和介質介質 溫度溫度： 44（55）最佳和最簡單）最佳和最簡單 -70-70是長期保存的良好溫度，為一次性保存是長期保

10、存的良好溫度，為一次性保存 -20-20保存保存 保存介質保存介質： TETE緩沖溶液緩沖溶液( (最常用最常用) ) 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0二、材料、設備及試劑二、材料、設備及試劑 菌種菌種 ：DBT降解菌設備設備 ：eppendorf管、微量取液器(20l,200l,1000l)， 臺式高速離心機， 渦旋振蕩器試劑：試劑：LB液體培養(yǎng)基 、裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸鈉,1mMEDTA,1%SDS,pH8.0）、5M NaCl 、T

11、ris-飽和酚、氯仿、RNA酶A 、無水乙醇 1、1.5ml菌液（每組兩管）4 12000rpm離心30sec，棄去上清，倒置試管于吸水紙上吸干。2、每管加入400l裂解液，用移液槍槍頭反復抽吸輔助裂解，37 水浴30min。3、每管加入132l的5M NaCl溶液，顛倒試管，充分混勻后，13000rpm離心15min。用粗口的槍頭（用剪刀剪去1ml槍頭的尖端）小心取出上清液轉倒兩支新的eppendorf管中。4、加入等體積的飽和苯酚，充分混勻后，12000rpm離心3min，離心后的水層如混濁則說明仍含有蛋白質，則需將上清液轉入新的試管，重復上述步驟直到水層透明，水層和酚層之間不再白色沉淀物

12、為止（約2次）。三、操作步驟三、操作步驟5、將上層清液轉入新的eppendorf管，加等體積的氯仿，混勻后13000rpm離心3min，除去苯酚。6、小心吸出上清液轉入新的eppendorf管，用預冷的兩倍體積的無水乙醇沉淀，放置20冰箱30min，然后13000rpm離心15min，可見白色絲狀沉淀物。7、小心吸出液體，棄上清液，用預冷的400l 70乙醇洗滌2次，室溫干燥后，用50lTE （含20g/ml的Rnase）溶解DNA，20冰箱放置備用。 最好使用新鮮材料，低溫保最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復凍融存的樣品材料不要反復凍融 提取血液基因組提取血液基因組DNADNA時，

13、要時，要選擇有核細胞（白細胞）選擇有核細胞（白細胞） 組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，組培細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成否則會造成DNADNA降解降解 含病毒的液體材料含病毒的液體材料DNADNA含量含量較少，提取前先富集較少，提取前先富集 材料應適量，過多會影響裂解，導致材料應適量，過多會影響裂解，導致DNADNA量量少，純度低少，純度低 針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：針對不同材料，選擇適當?shù)牧呀忸A處理方式：植物材料液氮研磨植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶組培細胞蛋白酶K K細菌溶菌酶破壁細菌溶菌酶破壁酵母破壁酶或玻璃珠酵母破壁酶或玻璃珠 高溫

14、溫浴時，定時輕柔振蕩高溫溫浴時，定時輕柔振蕩 采用吸附材料吸附的方式分離采用吸附材料吸附的方式分離DNADNA時，應提時，應提供相應的緩沖體系供相應的緩沖體系 采用有機（酚采用有機（酚/ /氯仿）抽提時應充分混勻，但氯仿）抽提時應充分混勻，但動作要輕柔動作要輕柔 離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間離心分離兩相時，應保證一定的轉速和時間 針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應的去雜質的方法應的去雜質的方法 當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，當沉淀時間有限時，用預冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀會更充分 沉淀時加入沉淀時加入1/101/1

15、0體積的體積的NaAcNaAc（pH5.2pH5.2，3M3M），有利），有利于充分沉淀于充分沉淀 沉淀后應用沉淀后應用7070的乙醇洗滌，以除去鹽離子等的乙醇洗滌，以除去鹽離子等 晾干晾干DNADNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥），讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分干燥） 若長期儲存建議使用若長期儲存建議使用TETE緩沖液溶解緩沖液溶解TETE中的中的EDTAEDTA能螯和能螯和MgMg2+2+或或MnMn2+2+離子，抑制離子，抑制DNaseDNasepHpH值為值為8.08.0，可防止，可防止DNADNA發(fā)生酸解發(fā)生酸解 DNADNA中含有蛋白、中含有蛋白、多糖、多酚類雜質多糖、多酚類雜質DNA

16、DNA在溶解前，有在溶解前，有酒精殘留，酒精抑酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應制后續(xù)酶解反應DNADNA中殘留有金屬中殘留有金屬離子離子重新純化重新純化DNADNA，去，去除蛋白、多糖、多酚除蛋白、多糖、多酚等雜質等雜質重新沉淀重新沉淀DNADNA，讓，讓酒精充分揮發(fā)酒精充分揮發(fā)增加增加7070乙醇洗滌乙醇洗滌的次數(shù)（的次數(shù)（2-32-3次）次）q問題一：問題一：DNADNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCRPCR反應。反應。 原原因因對對策策材料不新鮮或反復凍材料不新鮮或反復凍融融未很好抑制內源核酸未很好抑制內源核酸酶的活性酶的活性提取過程操作過于劇提取過程操作過于劇烈，烈

17、，DNADNA被機械打斷被機械打斷外源核酸酶污染外源核酸酶污染反復凍融反復凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復凍融免反復凍融液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍液氮研磨或勻漿組織后，應在解凍前加入裂解緩沖液前加入裂解緩沖液在提取內源核酸酶含量豐富的材料在提取內源核酸酶含量豐富的材料的的DNADNA時，可增加裂解液中螯合劑時，可增加裂解液中螯合劑的含量的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔細胞裂解后的后續(xù)操作應盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌溫滅菌將將DNADNA分裝保存于緩沖液中，避免分裝保存于緩沖液中，避免反復凍融反復凍融q問題二：問題二：DNADNA降解降解對對策策 原原因因實驗材料不佳或量少實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分破壁或裂解不充分沉淀不完全沉淀不完全洗滌時洗滌