CGRP和NGF對(duì)全腦缺血再灌注大鼠腦組織PKB表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

1、CGRP和NGF對(duì)全腦缺血再灌注大鼠腦組織PKB表達(dá)的調(diào)節(jié)作用         08-10-16 15:26:00     作者：邢雪松，呂威力，臧晉    編輯：studa20【摘要】  研究大鼠腦缺血再灌注后蛋白激酶B（protein kinaseB, PKB）的表達(dá)，探討降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）對(duì)腦組織缺血再灌注的保護(hù)作用及機(jī)制。方法：根據(jù)Nagasawa線栓法制作大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MC

2、AO)模型,采用電鏡、免疫組織化學(xué)SABC法及顯微圖像分析檢測(cè)海馬及皮質(zhì)內(nèi)PKB的表達(dá)。結(jié)果：大鼠缺血再灌注海馬及頂葉皮質(zhì)內(nèi)PKB反應(yīng)產(chǎn)物較正常組增多(P<0.05),而注射CGRP或NGF后陽(yáng)性產(chǎn)物明顯高于缺血再灌注組(P<0.01),二者聯(lián)合應(yīng)用效果更加顯著(P<0.05)。結(jié)論：CGRP及NGF參與缺血神經(jīng)元PKB的調(diào)節(jié),二者對(duì)缺血神經(jīng)元有協(xié)同修復(fù)作用。 【關(guān)鍵詞】  蛋白激酶 神經(jīng)生長(zhǎng)因子：To investigate the expression of protein kinase B(PKB) in hippocampusafter regional c

3、erebral ischemia and reperfusion in rats, explore the protective effects and mechanism of calcitonin and generelated peptide(CGRP) and nerve growth factor(NGF) on brain tissue.Methods：An novel model of regional cerebral ischemia and reperfusion induced by middle cerebral artery occluded (MCAO)in rat

4、s was modeThe expression of PKB in hippocampus and cortex was detected with electron microscope,SABC immunohistochemical method and analyzed by microimage system. Results：The expression of PKB in hippocampus and cortex was increased after cerebral ischemia and reperfusion(P<0.05)ompared with this

5、, the percentage of PKB immunoreaction positive cells in CGRP or NGF group were higher (P<0.01)The combined usage of CGRP and NGF enhanced such effects(P<0.05).Conclusion：The results indicate that CGRP and NGF participate in the regulation of expression of PKB in ischemic neurons,and they may

6、cooperate with each other.calcitonin generelated peptide; nerve growth factor; protein kinase B; hippocampus; neuron ischemia    腦缺血導(dǎo)致神經(jīng)元壞死變性、遲發(fā)性神經(jīng)元死亡和（或）凋亡，其機(jī)制十分復(fù)雜，至今尚不完全清楚。降鈣素基因相關(guān)肽（calcitonin generelated peptide, CGRP）是于1982年第一個(gè)利用基因重組技術(shù)發(fā)現(xiàn)的活性多肽，由37個(gè)氨基酸組成，廣泛存在于神經(jīng)組織，具有改善腦血流及神經(jīng)保護(hù)作用1。神經(jīng)生

7、長(zhǎng)因子（nerve growth factor, NGF）作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)中最重要的生物活性物質(zhì)，可控制神經(jīng)細(xì)胞存活的數(shù)量和分化，維持成熟神經(jīng)元的存活，參與受損神經(jīng)元的修復(fù)。此外，NGF可以增強(qiáng)CGRP的表達(dá)，刺激CGRP的合成2,3。近年來(lái)，許多研究表明，蛋白激酶B(proteih Kinase B,PKB)在腦缺血再灌注損害的病理生理機(jī)制中可能扮演重要角色4。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)PKB的表達(dá)，來(lái)研究CGRP和NGF對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)作用及其機(jī)制。    1材料與方法1.1腦缺血再灌注模型與分組健康雄性Wistar大鼠30只，體重300350g，由沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8、中心提供。分設(shè)假手術(shù)組、缺血再灌注組、NGF組、CGRP組、NGF與CGRP合用組(N&C組),每組6只大鼠。根據(jù)Nagasawa線栓法制作右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型，實(shí)驗(yàn)大鼠以0.4%戊比妥鈉(40mg/kg)腹腔注射麻醉。將大鼠固定于手術(shù)操作臺(tái),作頸前正中切口,游離出右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)、外動(dòng)脈后結(jié)扎頸總動(dòng)脈和頸外動(dòng)脈起始部,于頸總動(dòng)脈分叉部下方剪一小口,將一預(yù)先燒成圓頭的尼龍線插入頸內(nèi)動(dòng)脈,向上至遇到輕微阻力為止(一般線的頭端已達(dá)大腦中動(dòng)脈起始部)以栓塞血管。由頸總動(dòng)脈分叉部起始,其插入的深度平均為(20.5±0.5)mm。栓塞90 min后回抽出線栓約10 mm

9、,恢復(fù)再灌注。其它各組分別向頸動(dòng)脈內(nèi)注入NGF（500 U/ml，0.5ml）、CGRP（2g/ml，0.5ml）、CGRP（2g/ml，0.5ml）和NGF（500U/ml，0.5ml）30min注射完。此后分別于24 h后處死取材。手術(shù)過(guò)程中常規(guī)檢測(cè)肛溫,使肛溫保持在(37.0±0.5)。大鼠術(shù)畢清醒后,觀察其行為學(xué)變化,按ZeaLonga評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)將動(dòng)物的行為變化分為5級(jí):0級(jí),行為無(wú)明顯變化;1級(jí),左前肢屈曲,左后肢伸展;2級(jí),有左側(cè)追尾現(xiàn)象;3級(jí),行走困難,搖擺不定;4級(jí),意識(shí)不清。將1、2、3級(jí)動(dòng)物定為模型成功大鼠,0、4級(jí)棄去不用。假手術(shù)組僅夾閉右側(cè)頸總、頸外動(dòng)脈以中斷血

10、流90min,術(shù)后未見(jiàn)行為異常。用4%多聚甲醛灌注，常規(guī)冰凍切片。1.2電鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,將各組大鼠斷頭處死,迅速取出海馬,按電鏡樣品取材要求,3%戊二醛、1%鋨酸雙固定,常規(guī)包埋,光鏡選區(qū),制備超薄切片,鈾、鉛雙染,100CX 型透射電鏡觀察。1.3免疫組織化學(xué)染色腦的冠狀切面冰凍切片，片厚12m。常規(guī)HE染色,光鏡下觀察假手術(shù)組及缺血組的組織學(xué)變化，采用免疫組化SABC法檢測(cè)大腦皮質(zhì)及海馬PKB的表達(dá)。多克隆PKB抗體（兔抗大鼠，Santa Cruz,中國(guó)Boster公司代理）以1：100稀釋，按SABC試劑盒（Boster公司）說(shuō)明操作。陽(yáng)性對(duì)照實(shí)驗(yàn)磷酸驗(yàn)緩沖液代替一抗進(jìn)行免疫組化染色。用

11、圖像分析儀取每張切片每個(gè)部位各測(cè)5個(gè)相同單位面積的平均灰度值。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)采用t檢驗(yàn)并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。    2結(jié)果2.1電鏡假手術(shù)組大鼠海馬神經(jīng)元核比較大、呈圓形或橢圓形,核膜清晰、完整,核質(zhì)電子密度低,常染色質(zhì)多,呈細(xì)顆粒狀,分布均勻,核仁呈網(wǎng)狀,居中;胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器豐富,線粒體呈橢圓形或桿狀,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(RER)散在分布,結(jié)構(gòu)清晰。缺血再灌注組可見(jiàn)核染色較淺,核仁增大且致密,胞質(zhì)水腫,線粒體腫脹、嵴斷裂,基質(zhì)電子密度增高,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒;軸突內(nèi)線粒體空泡樣變,髓鞘分層、散亂。神經(jīng)元胞體水腫,核膜斷裂、模糊不清或崩解,異染色質(zhì)增多,核仁濃密,胞質(zhì)內(nèi)線粒體外膜模糊、不連續(xù),嵴斷裂、溶解、消失呈空泡化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)水腫、擴(kuò)張、脫顆粒。有的神經(jīng)元部分核膜清晰,核周隙增寬,部分核膜溶解,染色質(zhì)呈團(tuán)塊狀凝集,核仁碎裂;胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器明顯減少而致電子密度變低,殘存的線粒體崩解呈空泡狀,但尚可辨認(rèn);內(nèi)質(zhì)網(wǎng)減少,神經(jīng)絲增多,出現(xiàn)細(xì)胞凋亡。2.2免疫組化染色及定量分析結(jié)果正常組，PKB在頂葉皮質(zhì)(Brodmann分區(qū)第4區(qū))及海馬CA1區(qū)細(xì)胞核內(nèi)無(wú)表達(dá)，胞漿內(nèi)極少表達(dá)；I/R組，PKB表達(dá)較sham組有所增加（P<0.05）；CGRP組和NGF組，大腦皮質(zhì)及海馬PKB表達(dá)較I