PCR實驗注意事項

1、實驗中的一些好習(xí)慣加入試劑之前把它混勻一下，以免放置時間長了濃度不均，移液槍用完之后要歸到最大計雖的位置，防止久而久之彈簧失去彈性一定要記著關(guān)水浴箱，切記切記多和大家討論，同時多關(guān)注別人討論的經(jīng)驗，這幾乎是最快提高的捷徑了所有的試劑都自己配，出了問題才好找原因防止RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于1809的高溫下干烤6hr或更長時間。2. 塑料器皿可用0. 1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機(jī)玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不 能使用）。3. 有機(jī)玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H202室溫 lOmin,然后用0.1WDEPC水沖洗，晾

2、干。4. 配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC,在37處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的 DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蕤水配制，然后經(jīng)0. 22 P m濾膜過濾 除菌。5. 操作人員戴一次性口罩、帽子、手套，實臉過程中手套要勤換。6設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。二、常用的RNA酶抑制劑1. 焦磷酸二乙酯（DEPC）：是一種強(qiáng)烈但不徹底的RNA 抑制劑。它通過和RNA酶的活性基團(tuán) 組氨酸的咪哩環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。2. 異碇歡酸?。耗壳氨徽J(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。 它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)

3、使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強(qiáng)烈的變性作用。3. 氧帆核穩(wěn)核昔復(fù)合物：由氧化銳離子和核昔形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物 質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。4. RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）:從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA 酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。5. 其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。因為DEPc不加選擇的修飾蛋白質(zhì)和RNA,因此在分離和純化RNA過程中不能使用，而且它與一 些緩沖液（例如Tri）不能相容在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RW。而實驗失敗的主要原

4、因是核糖核酸酶 （RNA酶的污染。RNA酶可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等。研究人員造成的污染RNA酶最主要的潛在污染源是研究人員的手。因此進(jìn)行RNA實驗時應(yīng)勤換 手套。但DEPC能與胺和蔬基反應(yīng)，因而含Tris和DTT的試劑不能用DEPC處理（一）動植物總RNA提取-Trizol法Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。 用Trizol法提取的總RNA絕無蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點分析，斑點雜 交，Poly（A）分離，體外戳譯，RNase封阻分析和分子克隆。1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg

5、組織加入lml Trizol液研磨，注意樣品總 體積不能超過所用Trizol體積的10%。2、研曆液室溫放置5分鐘，然后以每lmlTrizo 1液加入0. 2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心 管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。3、取上層水相于一新的離心管，按每mLTrizol液加0. 5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫 放置10分鐘，12000（?離心10分鐘。4、棄去上清液，按每mlTrizol液加入至少51的比例加入75%乙醇，渦.旋混勻，4。（2下7500r 離心5分鐘。5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低RNA 的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時

6、可55r-60C水溶10分鐘。RNA可進(jìn)行mRNA分離，或 貯存于70%乙醇并保存于-70GCo注意U整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。另外，提取上清這步一定要小心，靠近沉淀的部分一定要舍得不要，要不然會有蛋白質(zhì)污染，影 響比值2、加氨仿前的勻漿液可在-70匸保存一個月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4C保存一周， -20保存一年?？俶RM的提?。ㄗ约旱慕?jīng)驗）、關(guān)于Trizol Reagent需要的試劑1. Chloroform：氯仿（分析純）2. Isoproplyl alcohol：異丙酹（分析純）3. 75% Ethanol （in DEPC-1reated wate

7、r） ：75%乙醇。要求用分析純無水乙醇并用 0.01%的 DEPC 處理過的無Rnase的水稀釋。4. RNase-free water：無 Rnase 的水。方法是：將 DEPC 按 0. 01% （V/V）加在 d H20 中 500ml （50ul）,在37過夜，并高壓滅菌即得（1501 3小時）5. 一次性塑料手套6. 注意：DEPC有致癌之嫌二、關(guān)于Trizol Reagent的使用過程：1. Homogenization （勻漿）a. Tissues：組織每100mg組織勻漿加lmlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。b. Cel Is Grown in

8、monolayer （單層細(xì)胞接毒后出現(xiàn)病變的針對JEV細(xì)胞總RNA的抽提法：BHK21細(xì)胞長成單層后，接#0. 5-lml （采用大瓶），37C吸附lh,倒掉，加維持液（含2%的血 清和HEPE8的MEM約5ml,維持天。岀 現(xiàn)75%-100%的病變時，以PBS （預(yù)冷）沖洗細(xì)胞兩次， 直接在細(xì)胞瓶中加入Trizol試劑lml/10cm2,吹吸幾次，以裂解細(xì)胞（細(xì)胞瓶有兩 種常用規(guī)格: 大的約45cm2小的約30cm2故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3mL Trizol試劑的加入是 依細(xì)胞瓶而定，以蓋滿瓶底為度，而不是依據(jù)細(xì)胞的數(shù)量，否則可導(dǎo)致DNA的污染）具體方法 如下：（樣品一

9、定要新鮮）（1）組織接入預(yù)冷的EP管中，加入Trizol試劑1 ml/10cm2 （雖一定要加足，否則易污染）， 混勻，吹吸幾次，以破裂細(xì)胞，置室溫5min,以使核蛋白復(fù)合物徹底分離。（2）加氯仿0.2ml （每lml Trizol試劑加入氯仿0.2ml）,蓋好，劇烈震蕩15s,置室溫2-3 分鐘。（3）4離心，10000gX15mim離心后,混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氨仿相、 上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當(dāng)于所加的Trizol試劑雖的60%。（4）仔細(xì)吸取上層水相，移至另一 EP管中。（5）加0.5ml異丙醇，以沉淀RNA （每1ml Trizol試劑加入

10、0. 5ml異丙醇），置室溫10min。（6）4C離心，lOOOOgXIOmino RNA沉淀為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。（7）棄上清液，加入預(yù)冷的75%乙醇lml （每1 ml Trizol試劑加入75%乙醇至少lml）,震蕩, 充分洗滌沉淀，4離心，5500gX5mino棄上清液，空氣干燥（或真空干燥）后，沉淀重懸于無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，559-60它作用10分鐘以溶解RNA, -70C保存?zhèn)溆谩＃?）抽提出的細(xì)胞總RNA干燥后加水50ul,取10ul加無Rnase水990ul,稀釋100倍成lml。 于0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在72

11、1型紫外分光光度計下檢測，結(jié)果應(yīng)為： A260/280 ratio1.60（9）分離組織10mg （純組織）加800ul Trizol試劑。（10）擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定DEPC處理方法如下：1. DEPC處理（1）DEPC水:100ml超純水加入0. 2ml DEPC,充分混勻，高壓滅菌。（2）Tip頭（槍頭）、EP管等在提RNAii程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200 ul, 20 Tip頭;EP管和PCR反應(yīng)管等）：用0. 1%的DEPC水（1000 ml超純水加入lml DEPC） 37C 浸泡過夜，高壓滅菌。2. 提取RNA,用DEPC水溶解3. RT我是用PCR儀來控制溫度和

12、時間的，所以RT是在PCR反應(yīng)管中作的。4. 操作過程中要戴一次性手套，并經(jīng)常換手套。最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭后，加入l-2ml的0.1輻 C水，在滅菌就行了；現(xiàn)在有進(jìn)口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的如何消除污染機(jī)器運(yùn)行完后，取出PCR產(chǎn)物時不能隨便丟棄，應(yīng)該用塑料手套或其他打結(jié)包好后丟入垃圾桶。（1）試劑：mixer盡雖分裝，不要原瓶多次取用。（2）加樣：原則是DNA最后加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針 有多管的話只是DNA不同，那么采取的方法是算出總體積后加在一個管子里面，混合均勻之后再 分裝到各個管子里去

13、，這樣可以有效地避免誤差及污染。另外，普通實驗室容易污染，且污染程度很髙，與跑電泳還有質(zhì)粒制備提取都在同一個房間里有 比較大的關(guān)系，最容易造成高濃度污染的就是產(chǎn)物的開蓋和質(zhì)粒的稀釋。目前，國外各個公司提供的診斷試劑盒大多采用了 UNG來防污染。frac訂-DNA N-glycosylase（UNG）尿喘唳糖基酶，來源于大腸桿菌重組克隆表達(dá)。RNA定雖RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至于用分光光度計比較不 同標(biāo)本之間就更不準(zhǔn)了。RNA的貯藏，最主要的是溫度，一20不夠，最好一80,液氮最保險mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度的彩響R

14、T-PCR有兩種做法：條件具備的話可用kit進(jìn)行一步法進(jìn)行；若條件不太好的話可分兩步進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄再PCR。但后來 發(fā)現(xiàn)兩步法的結(jié)果更加理想，條帶特異性強(qiáng)且無拖尾現(xiàn)象，我推測是體系更加單一比較利于PCR 的進(jìn)行一定要做參的，每一次，我想。不作參的結(jié)果是不可信的電泳可以不一起跑，沒有關(guān)系，計算的是相對表達(dá)程度，半定量和定1 RT-PCR做的都是基因相 對表達(dá)量，不是絕對表達(dá)雖mRNA的分離與純化中步驟(4)中將RNA溶液置65弋中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的 二級結(jié)構(gòu)，尤其是mRNA Poly (A )尾處的二級結(jié)構(gòu)，使Poly(A)尾充分暴露，從而提高Poly(A)RN

15、A 的回收率；另一個目的是能解藹mRNA與rRNA的結(jié)合，否則會導(dǎo)致rRNA的污染。所以此步驟不 能省略。下面，我們介紹一個可以確認(rèn)RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。3)保溫試驗方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管 中.并且用PH7.0的Tris緩沖液補(bǔ)充到10 ul的總體積，然后密閉管蓋。把其中一份放入7(TC 的恒溫水浴中保溫1 ho另一份放置在-20它冰箱中保存1 h。時間到了之后，取出兩份樣本進(jìn)行電泳。電泳完成后，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一 致或者無明顯差別(當(dāng)然，它們的條帶也要符合方法2中的條件)，則說明R

16、NA溶液中沒有殘 留的RNA酶污染，RNA的質(zhì)雖很好。相反的，如果70保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA 溶液中有RNA酶污染。PCR污染與對策)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染.這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題，所以，擴(kuò)增區(qū)的儀器什么如槍頭 等要注意。還有一種容易忽視，最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦?xí)r就可 形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地?fù)u動反應(yīng)管，開蓋時、吸樣時及污染進(jìn)樣槍的反復(fù)吸樣都可形 成氣溶膠而污染.據(jù)計算一個氣溶膠顆?？珊?8000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別 重視的問題.I標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)増摸板的制備；2. PCR擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PC

17、R擴(kuò)增；3. 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備一PCR擴(kuò)增一產(chǎn)物 分析產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶 膠的污染；操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將(1NTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即 可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度反應(yīng)液污染可采用下列方法之一處理：1. DNase I法：PCR混合液(未加模板和Taq聚合酶)加入0. 5U DNase I,室溫反應(yīng)30 min后 加熱滅活，然后加入模板和Taq聚合酶進(jìn)行正常PCR擴(kuò)增。該方