westernblot原理及步驟

1、westernblot原理及步驟Western blot基本原理：在電場的作用下將電泳分離的多肽從SDS-PAGE凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體, 然后用這種多肽的特異抗體來檢測。Western blot 應(yīng)用：目的蛋白的表達(dá)特性分析；目的蛋白與其他蛋白的互作；目的蛋白的組織定位；目的蛋白的表達(dá)量分析；蛋白樣品的制備：1水溶液提取法：稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大,是提取蛋白質(zhì)最常用的的溶劑，操作相對麻煩，重復(fù)性一般；2有機(jī)溶劑提取法；3離心管柱提取法：超快速,易用,高產(chǎn)及重復(fù)性強(qiáng)；4通過層析或電洗脫法制備目的蛋白。Western blot注意事頂和常見問題：1我的細(xì)胞提取液有的有

2、沉淀，有的很清亮，為什么呢？答：有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性完全，可以適當(dāng)提高SDS濃度,同時將 樣品煮沸時間延長；也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液 即可。2我做的蛋白質(zhì)分子量很小(10 KD ),請問怎么做WB ?答：可以選擇0.2 pm的膜，同時縮短轉(zhuǎn)移時間。也可以將兩張膜疊在一起，再 轉(zhuǎn)移。3最后顯色時用DAB好還是ECM好？答：DAB有毒，但是比較靈敏，是HRP最敏感的底物;ECM結(jié)果容易控制， 但被催化時靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg級蛋白， 具體可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)的情況。4要驗(yàn)證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在需要做免疫組化和western blo

3、t試驗(yàn) 嗎？做這兩個試驗(yàn)時的一抗和二抗可以共用嗎？答：免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能精確定量,而且有時會有假陽性， 不易與背景區(qū)分；Westernblot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子,進(jìn)行定量,但是不能定位。兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進(jìn)行什么 實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。5細(xì)胞水平要做western blot r多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot ?答：一般5x106就足夠了。6同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？答：能，沒有問題。7同一蛋白樣品能同時逬行兩種因子的Western Blo

4、t檢測嗎？答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。8蛋白變性后可以存放多久？答：-80°C ,兩年沒有問題。最關(guān)鍵兩條：不要被蛋白酶水解掉；不要被細(xì) 菌消化掉（也是被酶水解了）。9二抗是生物素化的抗體,三抗是親和素生物素體系,不知采用這樣的方案后, 封閉液是否要作調(diào)整,能否再用5%的脫脂奶粉呢？答：不能使用脫脂奶粉,因?yàn)槊撝谭壑泻锼?，用B S A代替應(yīng)該好一點(diǎn)。10做組織樣品的western的時候,怎樣處理樣品？ 答：必須進(jìn)行硏磨、勻漿、超聲處理，蛋白質(zhì)溶解度會更好，離心要充分，膜蛋 白需用更劇烈的方法抽提，低豐度膜蛋白可能還要分步抽提（超速離心）。還有一 點(diǎn)就是組織中的蛋

5、白酶活性更強(qiáng)，需要注意抑制蛋白酶的活性。11免疫組化和Western Blot可以用同一種抗體嗎？答：免疫組化時抗體識別的是未經(jīng)變性處理的抗原決定簇（又稱表位），有些表 位是線性的，而有的屬于構(gòu)象型；線性表位不受蛋白變性的影響，天然蛋白和煮 后的蛋白都含有；構(gòu)象型表位由于受蛋白空間結(jié)構(gòu)限制，煮后變性會消失。如果 你所用的抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是線性表位，那么這種抗 體可同時用于免疫組化和Western z而如果抗體識別構(gòu)象形表位，則只能用于 免疫組化。12在做Western Blot時.PVDF膜用甲醇浸泡的目的？答：PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團(tuán)

6、，使它更容易 跟帶負(fù)電的蛋白質(zhì)結(jié)合,做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。13檢測同一抗體的磷酸化和非磷酸化的抗原可以在同一張膜上嗎？答：可以。14蛋白質(zhì)的分子量跨度很大,如要分離小21KD ,中至66KD ,大至170KD ,可以一次做好嗎？答：這么廣的分布不好轉(zhuǎn)移,般建議：21kd和66kd可以一起轉(zhuǎn)，12%SDS-PAGE z濕轉(zhuǎn)120mA z 45-60min就可以了 z可以根據(jù)你實(shí)驗(yàn)室的經(jīng)驗(yàn)調(diào)節(jié)；170kd 用 7% SDS - PAGE , 200mA 90-120mino15細(xì)胞裂解液選擇蛋白酶抑制劑時有什么原則嗎？受不受組織來源的影響？ 胞膜和胞漿有區(qū)別嗎？答：一般來說提取

7、時加入廣譜的蛋白酶抑制劑就可以了，操作時保持低溫。若有 特殊要求可以選擇相應(yīng)的蛋白酶抑制劑。16 PVDF膜和硝酸膜結(jié)合蛋白的原理是什么？答：一般而言，硝酸纖維素膜是通過疏水作用來和蛋白質(zhì)相聯(lián)，這樣的話,反復(fù) 洗幾次后，蛋白容易掉下來，結(jié)果較差。PVDF膜主要通過它膜上的正電荷和蛋 白接合，同時也有疏水作用，但相對較弱。這樣的話，PVDF膜和蛋白接合較牢, 不易脫落，結(jié)果較好。17 westernblot內(nèi)參選擇什么合適？答:這與目標(biāo)抗原的表達(dá)位置有關(guān)，對于胞漿和全細(xì)胞蛋白，可選擇內(nèi)參P-actin. GAPDH和Tubulin ;線粒體蛋白則可選擇內(nèi)參VCDAl/Porin和COXIV ;核

8、內(nèi) 抗原可以選擇內(nèi)參Lamin Bl、TBP和histoneo18不能很好地將大分子量蛋白轉(zhuǎn)移到膜上，轉(zhuǎn)移效率低？答：轉(zhuǎn)移緩沖液中加入20%甲醇（終濃度），因?yàn)榧状伎山档偷鞍踪|(zhì)洗脫效率z 但可增加蛋白質(zhì)和NC膜的結(jié)合能力，甲醇可以防止凝膠變形，甲醇對高分子量 蛋白質(zhì)可延長轉(zhuǎn)移時間；轉(zhuǎn)移緩沖液加入終濃度0.1%SDS，也能增加轉(zhuǎn)移效率;使用戊二醛交聯(lián)；降低凝膠濃度，如低至6-7%或提高轉(zhuǎn)膜電壓/電流，增加轉(zhuǎn) 移時間。19轉(zhuǎn)膜時凝膠腫脹或卷曲？答：可將凝膠在轉(zhuǎn)膜前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡5-10mino20跑膠的條帶歪斜或者漂移？答：電轉(zhuǎn)儀長期使用導(dǎo)致海綿變薄，"三明治"結(jié)構(gòu)不緊湊

9、導(dǎo)致，可更換或者在 兩塊海綿之間墊上少許普通的草紙。21轉(zhuǎn)膜后膜上有單個或多個白點(diǎn)？答：轉(zhuǎn)膜時確保膜和膠塊之間沒有氣泡。轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱？答：緩沖液中離子濃度太低，電流或者電壓過高，轉(zhuǎn)膜過程中注意降溫。顯影后膠片背景太高？答：轉(zhuǎn)膜前PVDF膜沒有用100%甲醇完全浸濕;洗膜不充分，可以增加膜洗滌 次數(shù)；封閉不完全,選擇合適的封閉液和提高封閉時間；二抗?jié)舛冗^高，降低二 抗?jié)舛?；_抗特異性不強(qiáng),換用特異性較強(qiáng)的單克隆抗體；曝光時間過長,減少 曝光時間。24結(jié)果沒有條帶或者條帶很淺，雜交信號很弱？答：樣品中不含靶蛋白或者含量太低，可増加蛋白上樣量，設(shè)置已知標(biāo)準(zhǔn)量蛋白 的對照；抗體稀釋比例太低,孵育時間不夠；轉(zhuǎn)膜不好,轉(zhuǎn)膜后可先用麗春紅染 色觀看染色效果；曝光時間過短，增加曝光時間；抗體保存不當(dāng)，效價降低。25目的條帶位置偏低或者偏高？答：膠濃度不適合Z高分子量要用低濃度膠，小分子蛋白要用高濃度膠。26有非特異性條帶？ 答：目的蛋白有多個修飾位點(diǎn)（磷酸化位點(diǎn)、糖基化位點(diǎn)、乙酰化位點(diǎn)等），本 身可以呈現(xiàn)多條帶；一抗特異性不好，換用特異性較好的單克隆抗體；二抗非特 異性弓I起的結(jié)果,可設(shè)立一組不加一抗只加二抗的平行對照來檢測二抗是否有非 特異性結(jié)合;樣品蛋白質(zhì)可能降解，提取蛋白時注意冰上操作，加入適當(dāng)?shù)牡鞍?酶抑制劑，避免樣品反復(fù)凍融；抗體濃度過高，降低一抗和二抗的