培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌實驗報告

1、培養(yǎng)基的制備與消毒滅菌實驗報告實驗?zāi)康? .學(xué)習(xí)和掌握配制培養(yǎng)基（以牛肉膏蛋白月東培養(yǎng)基的配制為例）的一般方法和原理。2 .了解消毒和滅菌的原理，掌握常用滅菌方法的操作步驟。實驗原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營養(yǎng)基質(zhì)，用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存 各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。在自然界中.微生物種類繁多，營養(yǎng)類型多樣，加之實驗和研究的目的不同,所以培養(yǎng)基的種類很多。但是，不同種類的培養(yǎng)基中，一般應(yīng)含有水分、碳源、氮源、能源、無機(jī)鹽、生 長因素等。不同微生物對 PH要求不一樣.雷菌和酵母的培養(yǎng)基的pH一般是偏酸性的，而細(xì)菌和放線菌的培養(yǎng)基的pH 一般為中性或微堿性的（嗜堿細(xì)菌

2、和嗜酸細(xì)菌例外）。所以配制培養(yǎng)基時，都要根據(jù)不同微生 物的要求將培養(yǎng)基的 pH調(diào)到合適的范圍。此外，由于配制培養(yǎng)的各類營養(yǎng)物質(zhì)和容器等含有各種微生物， 因此，已配制好的培養(yǎng)基必須立即滅菌.如果來不及滅菌，應(yīng)暫存冰箱內(nèi)，以防止其中的微生物生長繁殖 而消耗養(yǎng)分和改變培養(yǎng)的酸堿度所帶來不利的影響。高壓蒸氣滅菌是將持滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋套間的水沸騰而 產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥.繼續(xù)加熱，此時由于蒸氣 不能道出，而增加了滅菌器內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100c的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。牛肉膏蛋白

3、陳培養(yǎng)基是一種應(yīng)用最廣泛和最普通的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基，有時又稱為普通培養(yǎng)基。由于這 種培養(yǎng)基中含有一般細(xì)菌生長繁殖所需要的最基本的營養(yǎng)物質(zhì)，所以可供作微生物生長繁殖之用。基礎(chǔ)培 養(yǎng)基含有牛肉膏、蛋白月東和 NaCl。其中牛肉膏為微生物提供碳源、能源、磷酸鹽和維生素，蛋白臍主要提 供氮源和維生素，而 NaCl提供無機(jī)鹽。在配制固體培養(yǎng)基時還要加入一定量瓊脂作凝固劑，瓊脂在常用 濃度下96c時溶化，實際應(yīng)用時，一般在沸水浴中或下而墊以石棉網(wǎng)煮沸溶化，以免瓊脂燒焦。瓊脂在 40c時凝固，通常不被微生物分解利用。固體培養(yǎng)基中瓊脂的含量根據(jù)瓊脂的質(zhì)量和氣溫的不同而有所不 同。由于這種培養(yǎng)基多用于培養(yǎng)細(xì)菌，因

4、此要用稀酸或稀堿將其PH調(diào)至中性或微堿性，以利于細(xì)菌的生長繁殖。牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基的配方如下：牛肉膏 3.0g蛋白月東 10.0 gNaCl 5.0g1000mlpH 7.47.6實驗儀器與藥品1 .溶液或試劑：牛肉膏、蛋白月東、 NaCl、瓊脂、1mol/L NaOH 1mol/L HCl。2 .儀器或其他用具：i短管、三角瓶、1000ml燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）、量筒、玻棒、培養(yǎng)基分裝器、天平、牛角匙、高壓蒸汽滅菌鍋、pH試紙（pH 5.5-9.0 ）、普通棉花、牛皮紙、記號筆、麻繩、紗布等。實驗步驟（一）牛肉膏蛋白陳培養(yǎng)基的制備1 .稱量（假定配制1000ml培養(yǎng)基）按培養(yǎng)基配方

5、比例依次準(zhǔn)確地稱取牛肉膏、蛋白月東、NaCl放入燒杯（或1000ml刻度搪瓷杯）中.牛肉膏常用玻棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水溶化后倒入燒杯。也可放在稱量紙上，稱量后直 接放人水中，這時如稍微加熱，牛肉膏便會與稱量紙分離，然后立即取出紙片。2 .溶化在上述燒杯中先加入少于所需要的水量（如約700ml）,用玻棒攪勻，然后，在石棉網(wǎng)上加熱使其溶解，將藥品完全溶解后，補(bǔ)充水到所需的總體積（1000ml）;如果配制固體培養(yǎng)基時，將稱好的瓊脂放人已溶的藥品中，再加熱溶化，最后補(bǔ)足所損失的水分。3 .調(diào) pH在未調(diào)pH前，先用精密pH試紙測量培養(yǎng)基的原始 pH,如果偏酸.用滴管向培養(yǎng)基中逐滴加入

6、1mol/LNaOH邊加邊攪拌，并隨時用pH試紙測其PH,直至pH達(dá)7.4-7.6 。反之，用1mol/LHCl進(jìn)行調(diào)節(jié)。4 .過濾趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利某些實驗結(jié)果的觀察?？梢允∪ィū緦嶒炍鹦柽^濾）。5 .分裝液體分裝分裝高度以試管高度的 1/4左右為宜。分裝三角瓶的雖則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積 的一半為宜，如果是用于振蕩培養(yǎng)用，則根據(jù)通氣量的要求酌情減少；有的液體培養(yǎng)基在滅菌后，需要補(bǔ) 加一定量的其他無菌成分，如抗生素等，則裝量一定要準(zhǔn)確。固體分裝分裝試管，其裝量不超過管高的 1/5,滅菌后制成斜面。分裝三角燒瓶的量以不超過三角燒瓶容積的 一半為宜。半固體分裝一般以試管

7、高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。6 .加塞培養(yǎng)基分裝完畢后，在試管口或三角瓶口上塞上棉塞（或硅膠塞、金屬或高溫塑料試管帽等），以阻止外界微生物進(jìn)入培養(yǎng)基內(nèi)面造成污染，并保證有良好的通氣性能（棉塞制作方法附本實驗后面 ）。7 .包扎加塞后，將全部試管放入鐵絲筐或用麻繩捆好，再在棉塞外包一層牛皮紙，以防止滅菌時冷凝水潤濕 棉塞，其外再用一道麻繩扎好。用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期。三角燒瓶加塞后，外包牛皮紙，用 麻繩以活結(jié)形式扎好，使用時容易解開，同樣用記號筆注明培養(yǎng)基名稱、配制日期。8 .滅菌將上述培養(yǎng)基以 0.103MPa, 121 C, 20min高壓蒸氣滅菌。9 .擺斜面將滅菌的試管培

8、養(yǎng)基冷至 50c左右（以防斜面上冷凝水太多），將試管端擱在玻棒或其他合適高度的 器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長的一半為宜10 .無菌檢查將滅菌培養(yǎng)基放入 37 c的恒溫箱中培養(yǎng) 24-48h.以撿查滅菌是否徹底。注意事項1 .蛋白陳很容易吸濕，在稱取時動作要迅速，另外，稱量時嚴(yán)防藥品混雜.一把牛角匙用于一種藥品. 或 稱取一種藥品后，洗凈一一擦干一一再稱職另一藥品一一瓶蓋也不要蓋錯。2 .在瓊脂溶化過程中.應(yīng)控制火力，以免培養(yǎng)基因沸騰而溢出容器。同時，需不斷攪拌，以防瓊脂糊底燒焦，制培養(yǎng)基時，不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基中，影響細(xì)菌生長。3 .對于有些要求PH較精確的微生

9、物，其 PH的調(diào)節(jié)可用酸度計進(jìn)行（使用方法、可參考有關(guān)說明書 ）。pH不要調(diào)過頭，以避免回調(diào)而影響培養(yǎng)基內(nèi)各離子的濃度。配制pH低的瓊脂培養(yǎng)基時.若預(yù)先記好PH并在高壓蒸汽下滅菌，則瓊脂因水解不能凝固。因此，應(yīng)將培養(yǎng)基的成分和瓊脂分開滅菌后再混合，或在中 性pH條件下滅菌，再調(diào)整 pH4 .分裝過程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污面塞而引起污染。（二）高壓蒸汽滅菌法步驟1 .加水使用前在鍋內(nèi)加入適量的水，加水不可過少，以防將滅菌鍋燒干，引起炸裂事故。加水過多有可能引 起滅菌物積水。水面與三角架相平為宜2 .裝料將滅菌物品放在滅菌桶中，不要裝得過滿。3 .加蓋蓋好鍋蓋，按對稱方法旋

10、緊四周固定螺旋，打開排氣閥。4 .加熱排氣加熱后水蒸氣與空氣一起從排氣孔排出，待鍋內(nèi)沸騰并有大量蒸汽自排氣閥冒出時，排出的氣流很強(qiáng) 并有噓聲時，維持 2 3min以排除冷空氣。如滅菌物品較大或不易透氣，應(yīng)適當(dāng)延長排氣時間，務(wù)必使空 氣充分排除，然后將排氣閥關(guān)閉。5 .加壓將排氣閥關(guān)閉6 .保壓當(dāng)壓力升至0.1MPa時，溫度達(dá)121C,此時應(yīng)注意觀察，控制熱源。保持壓力穩(wěn)定，維持 20-30min 后，切斷熱源。7 .自然降壓當(dāng)壓力表降至“ 0”處，稍停，使溫度繼續(xù)降至 100c以下后，打開排氣閥，旋開固定螺旋，開蓋，取 出滅菌物。注意：切勿在鍋內(nèi)壓力尚在“0”點(diǎn)以上，溫度也在100c以上時開啟排氣閥，否則會因壓力驟然降低，而造成培養(yǎng)基劇烈沸騰沖出管口或瓶口，污染棉塞，以后培養(yǎng)時引起雜菌污染。壓力降到“0”時，方可打開排氣閥。8 .保養(yǎng)滅菌完畢取出物品后，將鍋內(nèi)余水倒出，以保持內(nèi)壁及內(nèi)膽干燥，蓋好鍋蓋。9 .培養(yǎng)基無國檢查五、關(guān)鍵步驟及注意事項1 .要嚴(yán)格按配方配制。2 .調(diào)pH不要過頭。3 .干熱滅菌要注意物品不要堆放過緊，注意溫度的時間控制，70oC以下