低頻噪音對大鼠胃組織一氧化氮合酶表達的影響

1、低頻噪音對大鼠胃組織一氧化氮合酶表達的影響作者：王進海，郭曉燕，羅金燕，陳景藻【摘要】 目的 探討低頻噪音(次聲)對大鼠胃組織一氧化氮合酶表達的影響。方法 210只SD大鼠，其中140只隨機分為8Hz90dB、8Hz130dB、16Hz130dB實驗組及對照A組,按組別暴露于上述參數(shù)的次聲艙中，2h/d；于次聲作用1、7、14、21、28d隨機取出7只檢測其胃組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)的表達。另外70只大鼠隨機分為暴露組和對照B組，暴露組作用參數(shù)為8Hz130dB，2h/d，連續(xù)暴露14d；于停止次聲作用后1、7、14、21、28d隨機取出7只進行上述

2、指標(biāo)檢查。結(jié)果 8Hz90dB次聲作用14、21d，8Hz130dB次聲作用7、14、21、28d，16Hz130dB次聲作用7、14d，大鼠胃組織iNOS的表達均明顯高于對照A組(P<0.05,P<0.01)，各組均以14d最為明顯，且8Hz130dB組iNOS的表達明顯高于其他實驗組(P<0.05，P<0.01)；8Hz130dB次聲作用14d停止暴露后胃組織iNOS表達陽性率逐漸下降，但仍高于對照B組(P<0.05, P<0.01)；上述參數(shù)的次聲作用后胃組織eNOS表達與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論

3、 不同頻率和強度的低頻噪音均可引起大鼠胃組織iNOS表達增加，其表達的水平與作用次聲的頻率、強度和作用時間有關(guān)；大鼠對次聲的多次作用可產(chǎn)生一定適應(yīng)性，停止次聲作用后，胃組織iNOS表達有自我恢復(fù)趨勢；同樣參數(shù)的次聲對胃組織eNOS的表達無明顯影響。 【關(guān)鍵詞】 次聲；大鼠；胃組織；誘導(dǎo)型一氧化氮合酶；內(nèi)皮型一氧化氮合酶 ABSTRACT: Objective To observe the effects of infrasound on the expression of inducible nitric oxide synthase (iNOS) and endothelial nitric

4、 oxide synthase (eNOS) in gastric tissues in rats. Methods The study consisted of a total of 210 SD rats. Of them, 140 rats were randomly divided into 8Hz90dB, 8Hz130dB and 16Hz130dB experimental groups and a control group A. The experimental groups were exposed to infrasound with different frequenc

5、ies and intensities, 2h/d. After exposure for 1, 7, 14, 21 and 28 days, 7 rats randomly selected from each group underwent an examination of the expression of iNOS and eNOS in gastric tissues. The other 70 rats were randomly divided into a control group B and an exposure group continuously stimulate

6、d by infrasound with 8Hz130dB for 14 days, 2h/d, and after stopping exposure for 1, 7, 14, 21 and 28 days; the same indexes were detected in 7 rats randomly selected from each group. Results Compared with that in the control group A, the expression of iNOS in gastric tissues significantly increased

7、in 8Hz90dB group after exposure for 14 and 21 days, in 8Hz130dB group after exposure for 7, 14, 21 and 28 days and in 16Hz130dB group after exposure for 7 and 14 days (P<0.05, P<0.01). The peaks in all groups were at 14th day, and the expression of iNOS in 8Hz130dB group significantly

8、increased compared with that in the other two experimental groups (P<0.05, P<0.01). The expression of iNOS in gastric tissues tended to decrease when stopping 14 days Continuous exposure with 8Hz130dB, but it was still higher than that in control group B (P<0.05, P<0.01).

9、 Compared with that in the control group, the expression of eNOS in gastric tissues was not significant after exposure with the same parametric infrasound. Conclusion The expression of iNOS in gastric tissues in rats was increased after exposure to infrasound with different frequencies and intensiti

10、es and the level was closely related to the frequency, intensity and action time. Rats had adaptability to multiexposure to infrasound, and the expression of iNOS in gastric tissues tended to recover when the exposure was stopped. The expression of eNOS in gastric tissues was not affected by infraso

11、und under the same conditions. KEY WORDS: infrasound; rat; gastric tissue; inducible nitric oxide synthase; endothelial nitric oxide synthase 次聲廣泛地存在于自然界、生產(chǎn)勞動及交通運輸環(huán)境中，是目前國際上已公認的生產(chǎn)和生活噪聲的重要組成部分。次聲是頻率范圍在0.000120Hz的機械振動波,具有傳播遠、衰減少、穿透力強等物理學(xué)特性,由于其頻率低于可聽聲頻率的范圍，所以一般不被人耳聽到。我們已研究證實，一定聲壓和頻率的次聲可引起胃運動功能障礙和組織結(jié)構(gòu)的損

12、傷12，但是，目前還不清楚上述改變的分子生物學(xué)基礎(chǔ)。一氧化氮(nitric oxide, NO)對胃腸道的作用具有雙重性，生理范圍內(nèi)的NO對胃腸道黏膜具有重要保護功能，而過量的NO不但可引起胃腸黏膜的炎性損傷、黏膜的異常增生，也可引起胃腸運動功能的異常。一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)是NO合成的關(guān)鍵限速酶，其表達直接影響NO的生成和NO的生理病理功能。因此，本研究觀察不同頻率和聲壓級水平的次聲作用于大鼠后胃組織中誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS)和內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial ni

13、tric oxide synthase, eNOS)的表達變化，探討次聲引起胃腸運動和形態(tài)學(xué)改變的分子生物學(xué)機制，擬為胃腸道疾病的防治提供新的理論依據(jù)。 1 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 實驗動物 一級雄性SpragueDawley大鼠210只，(6.4±0.5)周齡，體重(189±8.9)g，由第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行實驗。所有大鼠都在安靜、室溫2024、自然光線條件下飼養(yǎng)。 1.1.2 主要實驗儀器 次聲聲源和檢查系統(tǒng)：采用第四軍醫(yī)大學(xué)研制的次聲壓力倉系統(tǒng)和檢查系統(tǒng)。次聲壓力倉系統(tǒng)由低頻信號發(fā)生器、功率放大器及電動揚聲器組成；檢查系統(tǒng)主

14、要包括次聲傳聲器和次聲信號數(shù)據(jù)采集分析系統(tǒng)。陣列儀(Beecher Instruments MicroArray Technology，美國)；組織處理機(Leica TP1050，德國)；雙筒顯微鏡及照相系統(tǒng)(BHZ型Olympus，日本)。 1.1.3 主要實驗試劑 SP免疫組織化學(xué)染色試劑盒、兔抗鼠iNOS和eNOS多克隆抗體及eNOS和eNOS一抗多克隆抗體(Neomarkers公司)；生物素標(biāo)記的山羊抗兔、鼠IgG、封閉用正常山羊血清工作液及辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液(北京中杉橋生物有限公司)；DAB和APES防脫片劑(武漢博士德生物工程有限公司)；速眠新(保定安、氟哌啶醇等復(fù)方制劑

15、，長春農(nóng)牧大學(xué)獸醫(yī)研究所)。 1.2 方法 1.2.1 次聲暴露的方法 210只雄性SD大鼠，其中140只隨機分成對照A組、8Hz90dB組、8Hz130dB組及16Hz130dB組4組，每組35只。實驗組動物于每天上午8301030置于次聲艙中，按分組次聲的頻率和強度每天暴露2h；對照A組動物每天于相同時間置于次聲艙中2h，但無次聲作用。每組分別于1、7、14、21、28d后隨機取出7只進行組織學(xué)準(zhǔn)備。另外70只大鼠隨機分為暴露組和對照B組，每組35只。暴露組動物于上午8301030置于次聲艙中，給予8Hz130dB的次聲作用，2h/d，連續(xù)暴露14d后停止，分別于停止作用后1、7、14、2

16、1、28d隨機取出7只進行胃組織學(xué)準(zhǔn)備；對照組B每天于相同時間點置于次聲艙中2h，不進行次聲作用，余同暴露組。 1.2.2 胃組織學(xué)的準(zhǔn)備 大鼠于最后1次次聲作用完后1h內(nèi)，用速眠新0.5mL/kg體重肌肉注射麻醉，迅速剖腹取胃，在裝有Kerbs液的燒杯內(nèi)清洗后，取胃組織(距幽門上0.5cm)一塊，置于40g/L多聚甲醛磷酸緩沖液中固定24h，常規(guī)脫水、石蠟包埋。 1.2.3 陣列的設(shè)計 本研究共210只大鼠，取210個標(biāo)本，制作成3個陣列，每個陣列點樣為70個。故實驗設(shè)計點陣排列為7×10(70個點樣)，點樣直徑1.5mm。 1.2.4 組織芯片的制作 包括受體蠟塊的制作、目標(biāo)組織

17、定位、選定組織的挖取、挖取組織植于受體蠟塊中及微陣列蠟塊的切片(厚度為4m)等，裱片后將其貼在涂有APES切片黏合劑的載玻片上，涼干，60中烤片3min，58繼續(xù)烤片18h，-20保存?zhèn)溆谩?1.2.5 免疫組織化學(xué)染色 常規(guī)脫蠟水化，微波修復(fù)抗原；封閉內(nèi)源性過氧化物酶；滴加正常兔血清封閉液，滴加一抗；滴加生物素標(biāo)記羊抗兔二抗工作液；滴加HRP標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，DAB顯色；充分水洗、滴蘇木素復(fù)染；分化后充分水洗返藍；常規(guī)脫水透明，中性樹膠封片。實驗中以睪丸母細胞瘤標(biāo)本作為陽性對照，用PBS緩沖液分別代替一抗和二抗作為陰性對照。 1.2.6 結(jié)果判定 采用雙盲法閱片，由兩位不同的觀察者進行

18、評價。對芯片的每一點樣中每一觀察區(qū)的細胞胞漿的染色結(jié)果根據(jù)染色強度進行評判：不著色為陰性(-)，著淺棕色為弱陽性(+)，著棕色為陽性()，著棕褐色為強陽性()，弱陽性+陽性+強陽性統(tǒng)計為總陽性數(shù)。由于NOS在胃壁分布不均，每一點樣分3個觀察區(qū)，即黏膜上皮區(qū)、黏膜下層區(qū)和肌層區(qū)。每一組7只大鼠，21個觀察區(qū)(n)，分別統(tǒng)計每一觀察區(qū)iNOS和eNOS的 染色強度的例數(shù)。 1.2.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)用百分率(%)或等級計數(shù)資料表示，采用SPSS11.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。組間百分率比較采用2檢驗或直接概率法檢驗，等級計數(shù)資料比較采用Ridit法檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意

19、義。 2 結(jié) 果 2.1 次聲作用對胃組織iNOS表達的影響 2.1.1 8Hz90dB次聲對胃組織iNOS的影響 8Hz90dB組次聲作用后14、21d胃組織iNOS的表達明顯高于對照A組(P<0.05)，作用1、7、28d后胃組織iNOS的表達與對照A組比較無統(tǒng)計學(xué)意義(表1)。表1 8Hz90dB的次聲作用對胃組織iNOS表達的影響 2.1.2 8Hz130dB的次聲作用對胃組織iNOS表達的影響 8Hz130dB的次聲作用后1d胃組織iNOS的表達與對照A組比較無統(tǒng)計學(xué)意義，但7、14、21、28d則明顯高于對照A組(P<0.05，P<0.01

20、，表2)。8Hz130dB次聲作用后1、7、14、21、28d胃組織iNOS的表達見圖1。表2 8Hz130dB的次聲作用對胃組織iNOS表達的影響 2.1.3 16Hz130dB次聲作用對胃組織iNOS表達的影響 16Hz130dB的次聲作用后7、14d胃組織iNOS的表達明顯高于對照A組(P<0.05)，而作用后1、21、28d與對照組比較則無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。表3 16Hz130dB的次聲作用對胃組織iNOS表達的影響 2.1.4 8Hz130dB的次聲作用2周停止暴露后胃組織iNOS表達的變化 8Hz130dB的次聲作用2周停止暴露后1、7、14、21、28d胃組織iN

21、OS表達陽性率分別為100%、84.2%、52.4%、40.0%和38.1%，均高于對照B組的4.8%、5.0%、5.0%、5.3%和4.8%(P<0.05，P<0.01)。8Hz130dB次聲作用2周停止暴露后胃組織iNOS的表達有恢復(fù)的趨勢，但在觀察的28d內(nèi)，胃組織iNOS陽性表達率仍然高于對照B組(圖2)。 2.1.5 相同頻率(8Hz)不同強度次聲對胃組織iNOS表達的影響 8Hz130dB次聲作用1、7、14、21、28d后胃組織iNOS陽性表達率均高于8Hz90dB組，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，只有14d組有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，表4)。 2.

22、1.6 相同強度不同頻率的次聲對胃組織iNOS表達的影響 8Hz130dB次聲作用7、14、21、28d后胃組織iNOS陽性表達率均高于16Hz130dB組，但經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，只有14d組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，表5)。表4 8Hz130dB與8Hz90dB次聲對胃組織iNOS表達的影響表5 8Hz130dB與16Hz130dB次聲對胃組織iNOS表達的影響2.2 次聲對胃組織eNOS表達的影響 eNOS在正常胃組織的陽性表達率為100%。8Hz90dB、8Hz130dB及16Hz130dB次聲作用1、7、14、21、28d后胃組織eNOS表達與對照組A比較均無統(tǒng)計學(xué)意義。

23、 3 討 論 目前，認為次聲主要通過生物共振的直接損傷和間接的應(yīng)激反應(yīng)影響機體的生理功能35。有研究者發(fā)現(xiàn)，15Hz以下的頻率、135dB的次聲作用于人體時，受試者出現(xiàn)乏力、惡心、嘔吐及食欲減退等癥狀。暴露于16Hz、120dB次聲中的大鼠，10min內(nèi)出現(xiàn)胃黏膜血流量減少，10min后更為明顯，20min后大鼠胃黏膜血流量減少19.1%。我們的研究也發(fā)現(xiàn)，8Hz90dB、8Hz130dB及16Hz130dB的次聲作用一定時間可引起大鼠胃排空功能障礙和胃組織形態(tài)與細胞超微結(jié)構(gòu)的損害12，但其作用的分子機制還不清楚。 NOS是NO合成中關(guān)鍵的限速酶，其分布和表達直接影響著NO的功能。NOS廣泛分

24、布于哺乳動物和人的胃腸道組織中，但不同的部位和層次中分布的密度不同67。目前，發(fā)現(xiàn)有兩類3種NOS同工酶：一類是原生型一氧化氮合酶(cNOS)，包括鈣離子依賴的神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)和eNOS；另一類是鈣離子非依賴的因外界刺激由炎性細胞產(chǎn)生的iNOS。nNOS和eNOS呈基礎(chǔ)性表達，需要有鈣離子、鈣調(diào)素和還原型輔酶的參與，合成的NO量少，且維持時間短，參與正常的機體免疫功能和神經(jīng)信息傳遞，調(diào)節(jié)黏膜血流。iNOS需要有細胞因子或內(nèi)毒素的誘導(dǎo)才能產(chǎn)生，它不依賴于鈣離子、鈣調(diào)素和還原型輔酶，催化合成的NO量多且持續(xù)時間長。NO對胃腸道有雙重作用，如在基礎(chǔ)狀態(tài)下可起到一種抗炎癥的作用，但NO

25、的過度產(chǎn)成則加重這種炎癥損傷。到目前為止，認為NO在胃腸道可能參與的生理病理功能有：胃腸黏膜血流調(diào)節(jié)；胃腸道分泌功能調(diào)節(jié)；胃腸黏膜免疫防護屏障；胃腸黏膜炎癥；胃腸動力調(diào)節(jié)；與腫瘤的關(guān)系811。 目前，對于iNOS與急慢性胃黏膜損傷的關(guān)系研究較多。已證實水浸、冷刺激、鹽酸、燒傷及幽門螺桿菌感染等與胃腸黏膜iNOS表達關(guān)系密切1214。但次聲作用(物理應(yīng)急)與胃腸黏膜iNOS表達關(guān)系的研究未見文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)，8Hz130dB、8Hz90dB及16Hz130dB次聲作用一定時間均可引起胃黏膜iNOS表達的增高，且次聲對胃黏膜的作用與次聲本身的物理學(xué)特性有關(guān)，即與作用次聲的聲壓級水平(強度)、頻

26、率和作用時間有密切的關(guān)系。8Hz130dB的次聲對胃竇黏膜的iNOS表達的影響明顯強于8Hz、90dB的次聲，提示次聲對胃黏膜的生物學(xué)效應(yīng)與次聲的強度呈正相關(guān)；8Hz130dB的次聲對胃黏膜iNOS表達影響強于16Hz130dB，提示次聲對胃腸道的生物學(xué)效應(yīng)不但與作用次聲本身的頻率有關(guān)外，而且與組織對次聲的敏感性有很大關(guān)系。由于腹腔臟器的固有頻率是69Hz 15 ，所以8Hz作用較16Hz次聲更易引起生物共振，產(chǎn)生更強生物學(xué)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)次聲作用的時間與胃黏膜iNOS表達并非呈平行的線性關(guān)系，8Hz次聲作用后21d，16Hz次聲以14d最為顯著，之后胃黏膜iNOS表達降低，提示大鼠對多次次

27、聲的作用有一定的適應(yīng)性。這與許多的研究結(jié)果一致1617。這是因為次聲作用于人體后，機體會發(fā)生一系列全身性代償性反應(yīng)，減輕次聲對組織細胞的損傷，以保護自己。 次聲對機體的作用是多樣的。低強度的次聲對機體有治療作用，高強度的次聲對機體有損傷效應(yīng)；次聲的損傷有些是可恢復(fù)的18，有些是不可恢復(fù)的19；輕度的損傷多是一過性的，大部分是可逆的；嚴(yán)重的損傷多是彌漫性、多器官損傷，部分是不可逆的，有的甚至是致命的。本研究發(fā)現(xiàn)，8Hz130dB次聲作用2周后，停止暴露，動態(tài)觀察4周，發(fā)現(xiàn)胃組織iNOS的表達有恢復(fù)的趨勢，但在觀察時間內(nèi)(28d)其損傷仍未恢復(fù)至正常。次聲對胃黏膜iNOS的表達遠期后效應(yīng)有待較長時

28、間的觀察研究。另外，本研究還發(fā)現(xiàn)，8Hz130dB、8Hz90dB及16Hz130dB的次聲作用28d對胃黏膜eNOS的表達無明顯影響，進一步證實eNOS激活與體內(nèi)環(huán)境，尤其是血流因素有關(guān)，而與炎性環(huán)境無關(guān)。 總之，低頻噪音(次聲)作用可引起胃黏膜iNOS表達的增加，且表達的高低與次聲的頻率、強度及作用時間有關(guān)；大鼠胃黏膜iNOS表達對次聲的作用有一定的適應(yīng)性，次聲作用停止后大鼠胃竇黏膜iNOS表達有恢復(fù)趨勢；次聲對胃體粘膜eNOS的表達無明顯影響。上述結(jié)論進一步證實和支持了我們以前的研究。其機制可能是：次聲引起機械振動造成胃黏膜的損傷，損傷導(dǎo)致組織炎性細胞的浸潤，炎性細胞產(chǎn)生iNOS，一旦i

29、NOS被激活，可產(chǎn)生大量的NO，引起機體一系列病理生理改變20，可導(dǎo)致和進一步加重次聲對胃組織結(jié)構(gòu)和功能的影響?！緟⒖嘉墨I】 1王進海，羅金燕，陳景藻，等. 不同頻率、強度次聲作用對大鼠胃排空功能的影響 J. 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志, 2006, 28(5):312315.2王進海，郭曉燕，羅金燕，等. 次聲對大鼠胃竇黏膜形態(tài)學(xué)的影響 J. 中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志, 2006, 28(10):676680.3HARDIN GW, BOHNE BA, LEE SC. Effect of infrasound on cochlear damage from exposure to a 4kHz o

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