7例水痘患者水痘帶狀皰疹病毒的分離與鑒定分析.docx

1、.論著.7例水痘患者水痘帶狀皰疹病毒的分離與鑒定分析張夫坤李三景2，赫寶雙I,戴龍I,盧佳3,王香娜2,唐靜2,郁春要2,霍玉奇2,沈紅杰I1.長春祈健生物制品有限公司研究室，吉林長春130000；2.鄭州市第六人民醫(yī)院感染三科，河南鄭州450000；3.武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司疫苗研究一室，湖北武漢430000摘要：目的對7例臨床水痘患者的皰疹液樣本，進(jìn)行水痘帶狀皰疹病毒(varicella-herpeszostervirus,VZV)的分離及鑒定分析。方法對7例臨床水痘患者的皰疹液，用2BS細(xì)胞進(jìn)行病毒分離及病毒滴度檢測;用特異性引物分別對病毒分離株及疫苗株(Oka株)的ORF68、

2、ORF54、ORF38進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PolymeraseChainReaction,PCR)擴(kuò)增及測序，用DNAMAN軟件對病毒分離株的ORF68序列與Dumas株序列進(jìn)行比對鑒定，并對病毒分離株和Oka株的0RF54、ORF38進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)分析。結(jié)果從7例臨床水痘患者的皰疹液樣本中，分離到4株VZV病毒株;病毒分高株的細(xì)胞病變(cytopathiceffect,CPE)及病毒滴度隨傳代次數(shù)的增加而增強(qiáng);4株病毒分離株的ORF68序列與Dumas株完全一致；ORF54、ORF38的RFLP結(jié)

3、果顯示.4株病毒分離株均為Bgll'Pstl'型,Oka株為BglI*PstI一型。結(jié)論成功分離的4株病毒分離株均為VZV野生毒株。關(guān)鍵詞:水痘帶狀皰疹病毒;野生毒株;疫苗株;糖蛋白E；限制性片段長度多態(tài)性中圖分類號：R373.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1005-5673(2017)03-0019-05DOI：10.13309/j.enki.pmi.2017.03.004IsolationandidentificationofVZVstrainfromsevenpatientssufferedfromvaricellaZHANGFu-kun*,LISan-jing,HEBao-

4、shuang,DAIIx>ng,LUJia,WANGXiang-na,TANGJing,YUChun-yao,HUOYu-qi,SHENHong項e*ResearchDepartmentofChangchunKeygeneBiologicalProductsCo.,Ltd.,Changchun130000,JilinProvince,ChinaCorrespondingauthor：SHENHong-jie,E-mail:446ll483Abstract：ObjectiveToisolateandidentifythevaricella-herpeszostervirus(VZV)str

5、ainfromtheblisterfluidofsevenpatientssufferedfromvericella.MethodsTheblisterfluidofsevenpatientswithvericellawerecollectedandculturedon2BScellssoastoisolateVZVstrainandtodeterminethevirustiter.DNAwasextracted,theopenreadingframes(ORF)68,54,38fromtheisolatedstrainsandvaccinestrain(Okastrain)wereampli

6、fiedbyPCRintnxlecedintothesequencespecificprimer.ThenucleicacidsequencesofORF68fromtheisolatedstrainsweresequencedandcomparedwithDumasstrainbyusingsoftwareDNAMAN.ORF54andORF38fromtheisolatedstrainsandOkastrainwereanalyzedwithrestrictionfragmentlengthpolymorphism(RFLP).ResultsFourVZVstrainsweresucces

7、sfullyisolatedformtheblisterfluidofsevenpatientswithvericella.TheCPEandtheviraltitersofthefourisolatedstrainsincreasedgraduallyalongwithpassages.ThenucleicacidsequencesofORF68forthefourisolatedstrainswereinconformitycompletelywithDumasstrain.TheRFLPdetectionforORF54andORF38showedthatallfourisolateds

8、trainshadBglI+PstI*,butOkastraincon-tainedBglI+PstIConclusionThefourisolatedtainedBglI+PstIConclusionThefourisolated作者簡介:張夫坤(1979-),男，助理研究員，主要從事病毒性疫苗研究；李三景(1976-)，女，主任醫(yī)師，主要從事傳染病防治。通信作者:沈紅杰，研究員，E-mail：44611483:共享第一作者strainsattributedtoVZVwildstrains.Keywords:Varicella-herpeszostervirus;Wildstrains;Va

9、ccinestrain;GlycoproteinE(gE);Restrictionfragmentlengthpolymorphism!RFLP)水痘帶狀皰疹病毒(varicella-herpeszostervirus,VZV)屬皰疹病毒科a皰疹病亞科，首次感染可引起水痘，再次復(fù)發(fā)可引起帶狀皰疹J1o1974年,TAKAHASHI等從一個3歲水痘臨床病人成功采集VZV樣本，通過不同細(xì)胞系連續(xù)傳代22次，成功篩選出一株VZV減毒病毒Oka株，用以制造水痘減毒活疫苗，并于1976年在日本被批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床。以（）如株作為毒種的水痘減毒活疫苗在全世界范圍內(nèi)得到了廣泛的應(yīng)用，并顯示了很好的免疫保護(hù)效果。

10、然而，其引起的水痘帶狀皰疹發(fā)病的散發(fā)病例報告或讓研究者擔(dān)憂Oka株是否會像野生型VZV-樣在人群中傳播，從而引起水痘。故病毒分離株的鑒定十分必要。VZV基因組為線性雙鏈DNA,長度約為125kb,含71個開放讀碼框架（openreadingframe,ORF）。其中,VZVORF68編碼的糖蛋白E（glycoproteinE,gE）是VZV感染細(xì)胞的必需蛋白，同時也是VZV的主要免疫保護(hù)蛋白（,°-,o而VZV野生毒株與疫苗株的鑒別，主要通過ORF38與ORF54的限制性片段長度多態(tài)性（restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP）分析。本研究

11、主要通過對7例臨床水痘患者的皰疹液臨床樣本，進(jìn)行VZV的分離及鑒定，并對病毒分離株和疫苗株的ORF54、ORF38進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析，確定病毒分離株為野毒株還是疫苗株,為當(dāng)?shù)厮坏牧餍胁W(xué)及水痘減毒活疫苗的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。1材料與方法1.1毒種和細(xì)胞VZV疫苗株（VZV-（）ka,簡稱Oka株）和2BS細(xì)胞株均由長春祈健生物制品有限公司保存并提供；VZVDumas株核酸序列來源于GenBank（X04370）o1.2臨床樣本的來源及采集樣本均來自鄭州市第六人民醫(yī)院感染三科7例水痘患者，用無菌注射器直接抽取皰疹液或用無菌棉簽藤取皰疹液，放置于3mL病毒保護(hù)液（含1%人血白蛋白的199

12、培養(yǎng)基）中，置于-80龍保存，臨床樣本來源信息見表1。表1水痘臨床樣本來源信息Tab.1Informationfromclinicalvericellasamples樣本編號性別年齡（歲）采樣方式臨床診斷疫苗接種史接觸史備注DXY男7無菌棉簽水痘無有腸梗阻SJR女6無菌棉簽水痘無無無HMF女4注射器水痘無不詳無ZH男24無菌棉簽水痘無無無WXL女25注射器水痘無有孕28周LAH女40注射器水痘無無無DMY男14注射器水痘無無細(xì)前性肺炎1.3 主要試劑及儀器MEM培養(yǎng)基購自日本日水制藥株式會社;新生牛血清購自浙江天杭生物科技股份有限公司；VZV兔多抗、辣根過氧化物酶（horseradishper

13、oxidase,HRP）標(biāo)記的VZVgE單克隆抗體均由長春祈健生物制品有限公司制備；限制性核酸內(nèi)切酶PstI、BglI均購自NewEnglandBio-labs公司；預(yù)混LATaq酶、病毒核酸純化試劑盒均購自寶生物工程（大連）有限公司。T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶購自美國Coming公司；2401型CO?培養(yǎng)箱、Fresco21型臺式離心機(jī)均購自Therm。公司。1.4病毒分離用MEM培養(yǎng)液（含10%新生牛血清）復(fù)蘇2BS細(xì)胞至T25細(xì)胞培養(yǎng)瓶,6h后換液。2BS細(xì)胞生長為致密單層后，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化，按照1:4比例進(jìn)行傳代。2BS細(xì)胞生長至致密單層后，取-80乞保存的臨床樣本室溫夏融后接種,

14、37T吸附2h后，棄上清，補(bǔ)加含2%新生牛血清的MEM培養(yǎng)基8mL,37X.,5%C02培養(yǎng)。每天觀察細(xì)胞病變（cylopathiceffect,CPE）,連續(xù)培養(yǎng)7do連續(xù)盲傳5代（P1P5代），如無CPE,則判為分離陰性;出現(xiàn)CPE,棄上清，補(bǔ)加含20%新生牛血清、10%二甲基亞硯的MEM培養(yǎng)基，-20Y/室溫凍融破碎細(xì)胞,細(xì)胞凍融液于液氮保存?zhèn)溆谩?.5病毒滴度的檢測采用蝕斑法檢測P2P5代臨床樣本的病毒滴度。將P2-P5代臨床樣本分別10倍系列稀釋(1：1。開始)后，接種于6孔板2BS細(xì)胞,37勾、5%C02培養(yǎng)7d后，以考馬斯亮藍(lán)染色并計算蝕斑數(shù)。以O(shè)ka株為陽性對照，并設(shè)置細(xì)胞對照

15、組。陽性對照組結(jié)果(4.6±0.2)也PFU/mL,空白對照組細(xì)胞無病變，試驗方可判為成立。1.6病毒鑒定1.6.1病毒基因組DNA的提取取臨床樣本CPE及VZV病毒滴度均陽性的病毒分離株及Oka株的病毒收獲液,3000g離心，收獲沉淀,用注射用水復(fù)融，采用病毒核酸純化試劑盒，按照使用說明書，提取病毒基因組DNA。1.6.2引物的設(shè)計與合成以Dumas株為模板設(shè)計引物Primer-2F/Primer-2R,根據(jù)文獻(xiàn)13設(shè)計引物Nla/Fok與PstA/PstB,引物由吉林省庫美生物有限科技公司合成，見表2。表2引物序列Tab.2Primersequences引物序列擴(kuò)增片段大小(bp

16、)primer-2-Fgattacgcgttgtgatatg3884primer-2-Raacatacaccggataaaag3884Nlaggaacccctgcaccattaaa222Foktcccttcatgcccgttacat222PstAttgaacaatcacgaaccgtt350PstBcgggtgaaccgtattctgag350PCR擴(kuò)增用引物Primer-2F/Primer-2R擴(kuò)增病毒分離株的ORF68,用引物Nla/Fox.PstA/PstB分別擴(kuò)增病毒分離株及Oka株的ORF54、ORF38。反應(yīng)體系為：模板1皿，引物各1|xL,PremixTaq25皿，滅菌蒸館水22

17、jiL；反應(yīng)條件為：98Y10s,55T；30s,72X.4min,共35個循環(huán)，72X.5mino1.6.3 ORF68的測序?qū)RF68PCK擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖電泳檢測，檢測到約3900bp目標(biāo)條帶后,使用膠網(wǎng)收試劑盒，按照使用說明書對其進(jìn)行切膠回收，回收后的PCR產(chǎn)物送吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行測序。用ONAMAN軟件對病毒分離株的ORF68序列與Dumas株序列進(jìn)行比對分析。1.6.5ORF54、ORF38的限制性片段長度多態(tài)性分析對病毒分離株及Oka株的ORF54、ORF38進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,

18、RFLP)分析，鑒定病毒分離株是疫苗株還是野毒株。分別采用BglI、PstI限制酶對()RF54、ORF38PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖電泳檢測。1.7統(tǒng)計學(xué)分析采用GraphPadPrism5軟件進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1病毒分離7份臨床樣本，在2BS細(xì)胞連續(xù)盲傳5代(PlP5代)后，其中4份樣本在各代中均出現(xiàn)CPE,旦CPE程度隨傳代次數(shù)的增加而增強(qiáng);3份樣本在各代均未觀察到CPE,見表3。表3臨床樣本VZV分離結(jié)果Tab.3AdaptationresultsofclinicalsamplesCPE樣本編號PlP2P3P5DXY

19、-SJR-HMF+ZH-WXL+LAH+DMY+注：-：2BS細(xì)胞無CPE；+:CPE為5%10%；+:CPE為】0%-30%;+:CPE為30%-60%;+:CPEN70%c2.2病毒滴度結(jié)果顯示,4份在連續(xù)盲傳5代中出現(xiàn)CPE的樣本，其P2P5代的VZV病毒滴度均為陽性，且滴度隨傳代次數(shù)的增加而增加；其中WXL樣本在P2P5代的滴度均高于其他3個樣本的相應(yīng)代次(F均為5.32；P均<0.05)。3份在各代均未觀察到CPE的樣本其VZV病毒滴度也均為陰性，見表4。2.3ORF68的測序結(jié)果顯示,4株病毒分離株的ORF68核酸序列與來源于GenBank的Dumas株ORF68核酸序列完全

20、一致，見表5。表4臨床樣本l>2P5代病毒滴廈Tab.4inisliterofisolatedstrainsin1*2P5病祚滴度(IgPHJ/rnL)P2P3P4P5DMY5.25±0.135.33M.135.62±0.055.87±(),14HME5.45±().125.62±0.085.78±0.035.93±0.1()I.AH5.40±0.065.34±0.105.52±0.2()5.78±0.14WXL5.55±0.025.72±0.155.82&#

21、177;0,136.10±0.12DXY陰性陰性/SJR陰性陰性/ZH陰性陰性/注:/為未進(jìn)行滴度檢測樣本編2合成序列長度(bp)核日酸突變數(shù)DMY38840HMF38840LAH38840WXL38840222bp137bpB5hp3()()hp2(X>hp1(M)bpMarkerDMYHMI;I.AHWXLOka350bp250bpItMIbp表5VZV病毒分離株與Dumas株ORE68核酸序列的比較Tab.5ComparisonofOKE68nucleicacidsequenceofisolatedstrainsan<iDumasstrain2.4 ORF54的RF

22、LPOKF54偷切產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示,4株病毒分高株與Oka株均為Bgl1型，皆可見3條核酸條帶，分別位于約222bPJ37bp與85bp處，見圖1。DMYHMFLAHWXLOkaMarkerI7(M>hp5()0bpl(Hlbp圖1VZV病嵌分離株ORF54的BEI.P結(jié)果Fig.1RFLPresultofORF54fromisolartcdstrains2.5 ORF38的RFLPORF38酶切產(chǎn)物的電泳結(jié)果顯示,4株病荏分離株為PsiI型，可見3條核酸條帶，分別位于約350bp.250bp與100bp處；而Oka株為PsiI-型，僅在35()1)|)處見一條核酸條帶,見圖2。I(M

23、M)bp7«iobp5(M)bp1(MJbp3(Mlbp2<Mlbpl<M>bp圖2VZV病保分離株ORF38的KELP結(jié)果Fig.2RFLPresultof()lE38fn>misolatedstrains3討論結(jié)果顯示,7份皰疹液臨床樣本中，在2BS細(xì)胞上連續(xù)育傳5代后，其中3份臨床樣本各代均未觀察到CPE,IL病席滴度均為陰性，可能是因為無御棉簽他取皰疹液所取的樣本bt少,病碇無法在2BS細(xì)胞中增殖但44份臨床樣本各代均觀察到CPE.fi病程滴度均為陽性，經(jīng)對4株病毒分離株的ORF68進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測序，發(fā)現(xiàn)4株病毒分離株的ORF68核酸序列與來源于G

24、enBank的Dumas株ORF68核酸序列完全一致，證實其均為VZV。在病毒分離過程中，病毒分離株的CPE及病毒滴度隨傳代次數(shù)的增加呈增強(qiáng)趨勢，說明隨著傳代次數(shù)的增加，病毒分離株已逐漸適應(yīng)了2BS細(xì)胞環(huán)境。在4株病毒分離株中，WXL株各代(P2P5代)病毒滴度均明顯高于其他3株分離株相應(yīng)代次，可能與WXL株來源的病例曾有水痘接觸史有關(guān)。VZV野生毒株與疫苗株的鑒別主要通過ORF38與ORF54的RFLP分析其中，在ORF54、38酶切位點分析，野毒株則為BgirPst1+,疫苗株為BglI+Pst1-。RFLP結(jié)果顯示，成功分離的4株病毒分離株均為野生毒株，結(jié)合7例臨床水痘患者的皰疹液臨床樣

25、本均全部來源于未接種水痘減毒活疫苗的水痘患者，同時未發(fā)現(xiàn)疫苗株所導(dǎo)致的水痘突破性病例，說明在樣本來源地區(qū)水痘減毒活疫苗具有較好的保護(hù)效果。后續(xù)將對病毒分離株的基因分型做進(jìn)一步研究。綜上所述，成功分離的4株病毒分離株均為VZV野生毒株。本研究結(jié)果為當(dāng)?shù)厮坏牧餍胁W(xué)及水痘減毒活疫苗的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)參考。參考文獻(xiàn)'1WOODMJ.HistoryofvaricellazostervirusJ.Herpes,2000,7(3)：60-65.2TAKAHASHIM,OTSLKAT,OKUNOY,etal.Livevaccineusedtopreventthespreadofvaricellainc

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