唾液富組蛋白5表達載體的構(gòu)建

1、唾液富組蛋白5表達載體的構(gòu)建【摘要】 目的 將唾液富組蛋白5 cDNA克隆至表達載體pGEX4T1。方法 EcoR+ Sal雙酶切克隆載體pMD19Thrp5及pGEX4T1，回收目的片段hrp5及雙酶切載體pGEX4T1，將二者連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5，氨芐青霉素篩選陽性菌落，PCR、酶切、測序鑒定重組質(zhì)粒。結(jié)果 唾液富組蛋白5的cDNA正確克隆至表達載體pGEX4T1，無突變。 結(jié)論 重組載體pGEX4T1hrp5構(gòu)建成功。 【關鍵詞】 唾液富組蛋白5 克隆 表達載體 Construction of Expression Vector of Salivary Histatin 5 ZHOU

2、 Qi，JIN Kehua，LUO Desheng，et al (Students of Grade 2004, Xianning University Medical School，Xianning Hubei 437100，China) ABSTRACT：Objective To clone the cDNA of salivary histatin 5 to expression vector pGEX4T1.Methods pMD19Thrp5 and pGEX4T1 were digested by Sal+ EcoR.The digested hrp5 and pGEX4T1 we

3、re linked and transformed to E.coli DH5，and the positive colonies were screened by ampicillin, and identified by PCR，digestion and sequencing. Results The cDNA of hitatin 5 was correctly inserted into expression vector pGEX4T1 without mutation. Conclusion Recombinant vector pGEX4T1hrp5 was construct

4、ed successfully. KEY WORDS:Salivavry Histatin 5；Clone；Expression vector 唾液富組蛋白5（HRP5）為富含組氨酸的陽離子多肽，存在于人類和靈長類動物腮腺唾液分泌物中。研究表明HRP5能有效殺滅耐藥的白色念珠菌，且具有抗細菌、抗腫瘤及治療關節(jié)炎的作用，作用機理獨特，未發(fā)現(xiàn)毒副作用，不易誘導抗藥菌株的產(chǎn)生，作為多肽類藥物防治口腔等疾病潛力巨大1。唾液中HRP5含量低，采集唾液極為不便，提取過程繁瑣，產(chǎn)率低；化學合成成本高；我們構(gòu)建了含HRP5基因的原核表達載體，以望表達具有生物活性的HRP5。 1 材料與方法 1.1 材料 克隆

5、載體pMD19Thrp5為前期構(gòu)建2，原核表達載體pGEX4T1、大腸桿菌DH5購自invitrogen公司，限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、質(zhì)粒小提試劑盒、凝膠回收試劑盒、酶購自寶生物（大連）公司。氨芐青霉素（Amp）、瓊脂糖、Yeast Extract、Tryptone、DNA Marker購自武漢凌飛科技公司，引物由上海英駿公司合成。 1.2 提取質(zhì)粒pGEX4T1 將含pGEX4T1的菌株于含 Amp（100g/ml）的固體LB培養(yǎng)基上劃線，37倒置培養(yǎng)過夜。 選擇生長良好的單菌落，接種至4ml含Amp（100g/ml）的LB培養(yǎng)基，37 200轉(zhuǎn)/min（rpm）振蕩培養(yǎng)12h。

6、 取1.5 ml×2菌液，按試劑盒抽提質(zhì)粒。 1.3 目的片段的酶切和回收 按文獻2體系，酶切5份克隆載體，合并反應液，沉淀后進行2瓊脂糖凝膠電泳分離，切取目的片段，按試劑盒回收。 1.4 酶切表達載體并回收 酶切體系如下： pGEX4T1 6l 10×H Buffer 6l EcoR 2l Sal2l dH2O 44l 溫和混勻，37水浴4h；加入120l無水乙醇，6l 3mol/L 醋酸鈉，混勻，-80沉淀1h；12000 rpm離心5min，棄乙醇，600l 70乙醇洗滌沉淀，12000 rpm離心5min，棄乙醇，室溫風干，加入20l dH2O溶解沉淀，0.8瓊脂糖

7、凝膠電泳分離，按試劑盒回收表達載體。 1.5 表達載體構(gòu)建 取目的片段及酶切載體各4l，10×ligation buffer 1l，T4 DNA ligase 1l，混勻，16連接過夜。轉(zhuǎn)化DH5感受細胞，于含Amp（100g/ml）的LB培養(yǎng)基篩選陽性菌落。 1.6 重組表達載體的鑒定 1.6.1 PCR鑒定 挑取陽性菌落，用鑒定引物P1: 5GTGAATTCGACTCTCATGCG 3,P2: 5ATGTCGACATAACCGCGATG 3 PCR鑒定，反應體系：dNTPs（10mmol/L）1l，10×buffer 5l， MgCl2（25mmol/L）3l，P1(5

8、pmol/L) 2l，P2(5pmol/L) 2l，Taq DNA聚合酶(5U/l) 0.25l，ddH2O 36.5l。循環(huán)參數(shù)：始變性 95 3min；94 30s，54 30s，72 30s 30個循環(huán)；72延伸10min。擴增后電泳檢測。 1.6.2 酶切鑒定 培養(yǎng)PCR鑒定的陽性菌落，抽提質(zhì)粒，酶切鑒定。酶切體系： pGEX4T1 20l 10×H Buffer 10l EcoR 3l Sal3l dH2O 64l 溫和混勻，37水浴4h；按1.4方法沉淀、洗滌、溶解，2.0%瓊脂糖凝膠鑒定。 1.6.3 測序鑒定 將1.6.2酶切鑒定的陽性質(zhì)粒送寶生物（大連）公司進行DN

9、A序列測定。 2 結(jié) 果 2.1 質(zhì)粒pGEX4T1的提取 電泳后可見1、2泳道抽提片段大小位于43676557bp，與質(zhì)粒pGEX4T1（4900bp）相符，即為所需質(zhì)粒（圖1）。 2.2 重組表達載體的鑒定 2.2.1 PCR鑒定 由圖2可知，重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物略小于100bp，與目的片段（92 bp）長度相符。 2.2.2 酶切鑒定 酶切后鑒定結(jié)果如圖3，重組載體雙酶切（1、2泳道）后出現(xiàn)略小于100bp片段，與插入目的基因大小一致。 2.2.3 重組載體序列測定 將PCR、酶切鑒定的陽性重組載體送寶生物（大連）公司進行序列測定，結(jié)果表明，目的基因正確重組至表達載體pGEX4T1，無點突

10、變、移碼突變。 圖 1 質(zhì)粒pGEX4T1的提取 M：DNA Marker；12：pGEX4T1 圖2 重組載體PCR鑒定 M：DNA Marker；1：PCR鑒定產(chǎn)物；2：陰性對照 圖 3 重組載體酶切鑒定 M：DNA Marker；12： 重組載體 EcoR I+Bam H I雙酶切 3 討 論 HRP5是一種具有細菌毒性的蛋白，對大腸桿菌有一定殺傷作用，不宜選擇組成性表達的原核載體。本實驗選用的表達載體pGEX4T1在酶切位點的5 端帶有編碼谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶（GST）基因，將目的片段插入其下游，可與其融合表達。由于GST可干擾HRP5的空間結(jié)構(gòu)的形成，屏蔽或降低HRP5對大腸桿菌的細胞毒作用，以利其在細胞中高效表達，同時利用GST與標記有谷胱甘肽的的凝膠進行親和層析，便于融合蛋白表達后分離純化。 HRP5基因不足100bp，只占重組載體分子量的極小部分，酶切后電泳條帶不明顯，應增加酶切體系中重組載體量，保證有足量的酶切片段，增強鑒定目的片段亮度，以便確認重組與否。 pGEX4T1載體在GST近BamH I位點處有凝血酶（Thrombin）水解位點，可水解融合蛋白，獲取重組HRP5?！緟⒖嘉墨I】 1Oppenheim FG，Xu T，McMillian FM,et alHistatins，a novel family of