國產球囊導管制作大鼠主動脈損傷血管內膜增生模型及特性的研究

1、國產球囊導管制作大鼠主動脈損傷血管內膜增生模型及特性的研究         09-01-30 09:27:00     作者：吳露，張偉，鄧常青    編輯：studa20【摘要】  目的 探討國產2.0 F球囊導管取代進口球囊導管致大鼠主動脈損傷血管內膜增生模型的特點及可行性。方法 采用國產2.0 F球囊導管建立大鼠主動脈內皮剝脫模型，分別采用組織形態(tài)學和免疫組織化學方法，觀察大鼠血管內皮剝脫后內膜增生情況及血管平滑肌細胞(

2、VSMC)表型標志基因SM-肌動蛋白(SM-actin)、增殖細胞核抗原(PCNA)及型膠原(collagenI)的表達活性。結果 采用國產球囊導管反復3次剝脫大鼠胸腹主動脈，與假手術組作比較，術后7 d模型組血管內膜增生不明顯，SM-actin及PCNA表達也均不明顯；術后14 d內膜增生較明顯，SM-actin及PCNA表達均明顯增強；術后21 d內膜呈進行性彌漫性增生，SM-actin表達仍明顯增高，但PCNA表達不明顯。模型組7、14、21 d collagen表達與假手術組比較，差異均無顯著性意義(P0.05)。結論 國產2.0 F球囊導管致大鼠主動脈損傷后，術后1421 d出現明顯

3、的血管內膜增生引起血管再狹窄，其內膜增生主要是由于血管平滑肌細胞增殖所致。表明國產2.0 F球囊導管損傷血管后可取得與進口2F Fogarty球囊導管同樣的效果。 【關鍵詞】  球囊導管；血管平滑肌細胞；形態(tài)計量學；SM-肌動蛋白；增殖細胞核抗原；型膠原；大鼠    To investigate the characteristics and feasibilities of intimal hyperplasia model induced by domestic-made 2.0 balloon catheter in place of import

4、ed balloon catheter in rats with aortal lesion. Methods The rat model of aortal endothelial denudation was established with domestic balloon catheter; and the intimal hyperplasia after vessel endothelial denudation and the active expression of SM-actin, PCNA and Collagen were analyzed with immunohis

5、tochemistry and histomophorlogical methods respectively. Results Compared with sham operated group, the intimal hyperplasia in the group redenuded arterial endothelium by domestic balloon catheter was not obvious and the expressions of SM-actin and PCNA were also not obvious after 7 days; then, hype

6、rplasia began to be observed obviously, and the expression of both SM-actin and PCNA were obvious very much after 14 days; and the diffuse hyperplasia was progressive but the expression of SM-actin was still not obvious after 21 daysThe difference of Collagenexpression between model group and sham o

7、perated group was not statistic significance（P>0.05）. Conclusions The vessel restenosis is caused after de-endothelialization from 14 to 21 days, in which the hyperplasia is mainly resulted by proliferation of vascular     經皮冠狀動脈成形術(percutaneous transluminal coronary angioplas

8、ty, PTCA)能明顯減輕心血管疾病的癥狀，給患者帶來福音。但術后的再狹窄(restenosis, RS)發(fā)生率仍然居高不下，影響了PTCA的遠期療效。球囊擴張后再狹窄的發(fā)生機制包括血管彈性回縮，損傷部位血栓形成，血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell, VSMC)增殖、遷移和細胞外基質積聚等1，這些都是PTCA后再狹窄重要的病理生理學基礎。目前，有關防治PTCA后再狹窄的發(fā)生發(fā)展是心血管疾病領域的熱點問題。由于進口的球囊導管價格十分昂貴，且很難匹配應用于小動物模型，為建立可靠、價廉的方法，我們采用國產2.0 F球囊導管取代進口的球囊導管，建立大鼠主動脈損傷血

9、管內膜增生模型，并對該模型的特點及可行性進行了研究。    1 材料與方法    11  材料    111  動物  健康雄性SD大鼠18只，體質量300350 g，由湖南省衛(wèi)生防疫站實驗動物中心提供，合格證號：醫(yī)動字第20010號；    112  球囊導管  球囊由天津中拓乳膠科技發(fā)展有限公司提供；導管（51/2注射針改裝）由河北醫(yī)科大學基礎醫(yī)學研究所生物化學室溫進坤教授、韓梅教授惠贈。國產2.0 F球囊導管由球囊和導管

10、組裝而成：將2 cm長的球囊套在導管一端，在導管出水孔的上下兩個楔形槽分別用細絲線扎緊；導管另一端連接16號注射針并固定好。球囊導管準備好后，在尾端注入生理鹽水充盈球囊(黃豆大小)，回縮自如即可(見圖1)。    113  試劑  增殖細胞核抗原(The proliferating cell nuclear antigen，PCNA)免疫組化染色試劑盒、兔抗大鼠型膠原多克隆抗體、兔抗大鼠SM-actin多克隆抗體、DAB顯色試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供， SP-9001免疫組化染色試劑盒、多聚賴氨酸由北京中杉金橋生物技術有限公司提供，

11、其他試劑為進口或國產分析純。    1.2  方法    12.1  動物模型的建立方法及分組  SD大鼠以水合氯醛麻醉后，作頸部正中切口，手術暴露及游離左頸總動脈11.5 cm，遠心端結扎，在左頸總動脈近心端用動脈夾阻斷后，于頸總動脈遠心端剪一“V”形切口，插入國產2.0 F球囊導管，仔細操縱導管越過主動脈弓入胸，下至腹主動脈，深度約為67 cm。自導管尾端注入生理鹽水0.40.6 mL充盈球囊，使球囊膨脹至回拉時有較明顯的阻力感，保持阻力一致回拉導管至主動脈弓處，如此重復3次，旋轉180°使

12、球囊轉至血管腔的另一面，依上法再重復3次，充分剝脫內皮。完成后撤出導管，結扎左頸總動脈近心端血管以止血，逐層縫合肌肉、皮下層及皮膚層。術后腹腔注射青霉素(PNC)20萬單位消炎抗菌，連用3 d。將動物隨機分為假手術組、模型7 d組、模型14 d組和模型21 d組。假手術組只進行手術操作，不插入球囊損傷。分別于術后不同時間點取損傷部位胸主動脈段進行形態(tài)學觀察及SM-actin、PCNA及collagen免疫組化檢測。    1.22  形態(tài)學及血管形態(tài)學計量指標的測定  大鼠麻醉后，放血處死，打開胸腔，在內皮剝脫段相同部位取血管1 cm，4多聚甲

13、醛固定24 h，乙醇梯度脫水，石蠟垂直定向包埋，每段血管間斷均勻切片810張后，常規(guī)HE染色。每只大鼠標本不同時間點各隨機取3片進行光鏡觀察、照相和圖像分析。按組織學劃分，內彈力膜以內為內膜，內彈力膜與外彈力膜之間為中膜。以MIAS醫(yī)學圖像分析系統分別測量外彈力膜內面積、內彈力膜內面積、管腔面積、外彈力膜周徑、內彈力膜周徑以及管腔周徑。并在此基礎上計算出中膜面積(外彈力膜內面積-內彈力膜內面積)、內膜面積(內彈力膜內面積-管腔面積)、中膜厚度(外彈力膜周徑-內彈力膜周徑)/2、內膜厚度(內彈力膜周徑-管腔周徑)/2、內膜面積增生比率內膜面積/(內膜面積+中膜面積)×100、內膜厚度增生比率內膜厚度/(內膜厚度+中膜厚度)×100、內膜中膜面積比、內膜中膜厚度比。    12.3  免疫組織化學檢測  分別對SM-actin、 PCNA及collagen進行免疫組織化學染色，鏡下觀察相關抗原的表達變化，以細胞內出現棕黃色顆粒為陽性表達信號。每個指標在假手術組、模型7 d組、模型14 d組和模型21 d組都設立一個陰性對照