分光光度法測定蛋白酶酶活

1、 分光光度法測定蛋白酶酶活1 適用范圍本方法適用于中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活的測定。2 測定原理蛋白酶在肯定的溫度與pH條件下，水解酪素（酪蛋白）底物，產(chǎn)生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在堿性條件下，將福林試劑（Folin）還原，生產(chǎn)鉬藍和鎢藍，用分光光度計于波長680nm下測定溶液吸光度。酶活力與吸光度成正比，由此可以計算產(chǎn)品的酶活力。酶活單位的定義：每1mL粗酶液，在肯定溫度和pH值條件下，10min水解酪素產(chǎn)生1g酪氨酸為一個酶活力單位，以（u/mL）表示。3 儀器和設(shè)備3.1 分析天平：精度為0.0001g。3.2 紫外分光光度計。3.3 恒溫水浴鍋：精度±0.2

2、。3.4 PH計：精度為0.01PH單位。4 試劑和溶液除非另有說明，在分析中僅使用分析純試劑和蒸餾水。4.1 福林（Folin）試劑市售分析純福林試劑。4.2 福林使用溶液 一份福林試劑與兩份水混合，搖勻。4.3 碳酸鈉溶液（42.4g/L） 稱取無水碳酸鈉（Na2CO3）42.4g，用水溶解并定容至1000ml。4.4 三氯乙酸c（CCl3COOH）=0.4mol/L 稱取三氯乙酸65.4g，用水溶解并定容至1000 mL。4.5 氫氧化鈉溶液c（NaOH）=0.5mol/L 稱取氫氧化鈉片劑20.0g，加水900ml并攪拌溶解，待溶液到室溫后加水定容至1000ml，搖勻。4.6 鹽酸溶液

3、c（HCL）1 mol/L及0.1 mol/L 1 mol/L HCL:取90mL濃鹽酸溶解于蒸餾水中，定容至1000mL。0.1 mol/L HCL：取9mL濃鹽酸溶解于蒸餾水中，定容至1000mL。4.7 緩沖溶液4.7.1 磷酸緩沖液（pH7.5，適用于中性蛋白酶） 稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO412H2O）6.02g和磷酸二氫鈉（NaH2PO412H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。4.7.2 乳酸緩沖液（pH3.0，適用于酸性蛋白酶） 甲液：稱取乳酸（8090）10.6g，加水溶解并定容至1000 mL。乙液：稱取乳酸鈉（70）16g，加水溶解并定容至1000 mL。使用

4、溶液：取甲液8 mL，加乙液1 mL，混勻，稀釋一倍，即成0.05mol/L乳酸緩沖溶液。4.8 10g/L酪素溶液 稱取酪素（固定廠家生產(chǎn)，不同廠家產(chǎn)品對試驗結(jié)果有影響）1.000g，精確至0.001g，用少量0.5mol/L氫氧化鈉溶液（若酸性蛋白酶則用濃乳酸23滴）潮濕后，加入適量的緩沖溶液（測中性蛋白酶加磷酸緩沖液，測酸性蛋白酶加乳酸緩沖液）約80 mL，在沸水浴中邊加熱邊攪拌，直到完全溶解，冷卻后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，用適宜的H緩沖溶液稀釋至刻度。此溶液在冰箱內(nèi)貯存，有效期為三天。4.9 L酪氨酸標準溶液（100g/mL） 稱取預(yù)先于105干燥至恒重的L酪氨酸0.1000g，精

5、確至0.0002g，用1mol/L鹽酸60 mL溶解后再用蒸餾水定容至100 mL，即為1mg/mL酪氨酸標準溶液。吸取1mg/ mL酪氨酸標準溶液10.00 mL，用0.1mol/L鹽酸定容至100 mL，即得到100ug/ mL L酪氨酸標準溶液。此溶液在冰箱內(nèi)貯存或馬上使用。5 分析步驟5.1 標準曲線的繪制5.1.1 L酪氨酸標準溶液：按表1配置。L酪氨酸稀釋液應(yīng)在稀釋后馬上進行測定。表1管 號酪氨酸標準溶液的濃度（g/mL）取100ug/mL酪氨酸標準溶液的體積 mL取水的體積mL吸光值A(chǔ)bs.000101101922028330374404655055分別取上述溶液各3.

6、00ml，各加碳酸鈉溶液（4.3）15.00ml、福林試劑使用溶液（4.2）3.00ml，振蕩均勻，置于40±0.2水浴中顯色20min，取出冷卻至常溫，用分光光度計于波長680nm測定其吸光度（A），以吸光度A為縱坐標，酪氨酸的濃度c為橫坐標，繪制標準曲線（此線應(yīng)通過零點）。依據(jù)作圖或用回歸方程，計算出當吸光度為1時的酪氨酸的量（g），即為吸光常數(shù)K值;（其K值應(yīng)在（95100）范圍內(nèi)）。如不符合，需重新配制試劑，進行試驗。5.2 樣品測定5.2.1 待測酶液的制備液體酶樣：精確吸取樣品10.0ml于100ml容量瓶中，用適宜溶劑（蒸餾水或者緩沖溶液）定容至刻度。把握稀釋樣品酶活力

7、在100u/ml1000 u/ml范圍內(nèi)。固體酶樣：精確稱取樣品4.0g，精確至0.0002g。用適量適宜溶劑（蒸餾水或者緩沖溶液）溶解后，定容至100ml。再將定容溶液用定性濾紙過濾后，精確吸取10.0ml，用相應(yīng)溶劑定容至100ml。把握稀釋樣品酶活力在100u/ml1000 u/ml范圍內(nèi)。5.2.2 測定a、先將酪素溶液放入40±0.2恒溫水浴中，預(yù)熱5min；b、按下列程序操作：試管A（空白） 試管B（酶試樣，需作三個平行試樣）加酶液4.00 mL 加酶液4.00 mL 40±0.2保溫，2min 40±0.2保溫，2min 加三氯乙酸8.00 mL（搖

8、勻） 加酪素4.00mL(已預(yù)熱)（搖勻） 沸水煮沸，10min（精確計時） 40±0.2保溫，30min（精確計時） 加酪素4.00mL(已預(yù)熱)（搖勻） 加三氯乙酸8.00mL（搖勻） 40±0.2保溫，30min，過濾（定性濾紙） 沸水煮沸，10min，過濾（定性濾紙） 取3.00ml濾液 取3.00ml濾液 加碳酸鈉溶液15.0ml 加碳酸鈉溶液15.0ml 加福林試劑使用溶液3.00ml 加福林試劑使用溶液3.00ml 40±0.2，顯色20min 40±0.2，顯色20min 冷卻至常溫 冷卻于680nm波長，測定樣品酪氨酸濃度6 結(jié)果計算6

9、.1 液體樣品酶活力的計算從標準曲線上讀出樣品最終稀釋液的酶活力，單位為u/ml。樣品的酶活力按式（1）計算： （1）式中：X樣品的酶活力，(u/mL)； C由標準曲線得出的檢測試液的酶活力，(u/mL)；21檢測試液的體積，ml；16反應(yīng)試液的總體積，mL；n所測樣品的稀釋倍數(shù)；3反應(yīng)時間為10min的倍數(shù)；3吸取濾液的體積，ml；4加入酶液的體積，mL；所得結(jié)果表示至整數(shù)。6.2 固體樣品酶活力的計算固體樣品的酶活力換算按式（2）計算： （2）式中：固體樣品的酶活力，(u/g)；固體樣品溶解定容后的酶活力，(u/mL)；樣品定容體積，ml；稱取樣品的質(zhì)量，g；所得結(jié)果表示至整數(shù)。7 檢驗留意事項7.1 緩沖溶液配制留意事項 緩沖溶液配制完成后，用PH計測定其PH值，若PH值不在規(guī)定范圍內(nèi)，需用相應(yīng)的試劑調(diào)PH值至規(guī)定