λ噬菌體的綜述

1、生命科學(xué)學(xué)院病毒生物學(xué)噬菌體綜述摘要：噬菌體是一類溫和噬菌體，它們感染大腸桿菌后能進(jìn)行溶菌性生長(zhǎng)(Lytic growth)和溶源性生長(zhǎng)(Lysogenic growth)。其溶源特性對(duì)基因重組與遺傳工程研究有很大幫助。本文就噬菌體的基因組結(jié)構(gòu)、溶源化狀態(tài)的建立 和基因工程應(yīng)用做簡(jiǎn)要的綜述，分析存在的問(wèn)題，并對(duì)研究方向進(jìn)行了展望。關(guān)鍵詞：噬菌體 溶原性 溶菌性 基因克隆引言：大腸桿菌噬菌體為長(zhǎng)尾噬菌體科，是一類中等大小的大腸桿菌病毒，其基因組為雙鏈線狀DNA，由48502對(duì)堿基組成，分子量3.2×107 ，約50個(gè)基因，特點(diǎn)是相關(guān)基因成簇排列，形成若干個(gè)操縱子?；蚪M兩端為粘性末端，

2、中間有相當(dāng)長(zhǎng)的DNA片段是裂解生長(zhǎng)非必需的，這就為其作為外源基因的克隆載體提供了方便。噬菌體由頭和尾構(gòu)成，其基因組組裝在頭部蛋白質(zhì)外殼內(nèi)部，其序列已被全部測(cè)出。感染時(shí)吸附位點(diǎn)為細(xì)胞壁。屬溫和性感染；感染的DNA環(huán)化并整合于宿主基因組中。以環(huán)雙向復(fù)制，然后通過(guò)滾環(huán)機(jī)制單向復(fù)制。用于感染大腸桿菌的噬菌體改造成的載體應(yīng)用最為廣泛。1、The discovery of bacteriophage lambda1951年J. Lederberg的妻子Esther Lederberg第一個(gè)證明了 J. Lederberg和Tatum用來(lái)雜交的K-12中有原噬菌體，并命名為，經(jīng)10年的研究搞清了溶原化的實(shí)質(zhì)

3、。從此之后，噬菌體被廣泛用于模式物種；1962年Esther Lederberg的同事并且還是她最好的朋友Allan Campbell首次發(fā)現(xiàn)了DNA整合到細(xì)菌DN A的機(jī)制；之后由噬菌體改造后的載體廣泛的用于基因工程。2、The characteristics of bacteriophage lambda2.1、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：為大腸桿菌溫和性噬菌體，屬長(zhǎng)尾噬菌體科，頭殼為直徑約50nm的二十面體，其內(nèi)包裹一長(zhǎng)線狀雙鏈DNA分子（46500bp），因分子兩端各有一含12個(gè)核苷酸的黏性末端，故又可黏合成環(huán)狀分子。有柔韌的管狀長(zhǎng)尾，無(wú)收縮尾鞘，長(zhǎng)約150nm，末端有一根尾絲，蝌蚪狀。病毒毒粒的基本結(jié)

4、構(gòu)是包圍著病毒核酸的蛋白質(zhì)外殼，即殼體（capsid）或稱衣殼。殼體是由大量同一的殼體蛋白單體分子，即蛋白質(zhì)亞基（protein subunit）以次級(jí)鍵結(jié)合形成的?；谖锢韺W(xué)原因和相對(duì)簡(jiǎn)單的幾何學(xué)原理，由蛋白質(zhì)亞基構(gòu)成的病毒殼體主要取螺旋對(duì)稱和二十面體對(duì)稱兩種結(jié)構(gòu)形式。如圖1，噬菌體頭部為二十面體對(duì)稱結(jié)構(gòu)，而柄部為螺旋對(duì)稱結(jié)構(gòu)。由噬菌體結(jié)構(gòu)可以看出，其屬于復(fù)合對(duì)稱結(jié)構(gòu)，即具有二十面體對(duì)稱的頭部和螺旋對(duì)稱的柄部。圖1: 噬菌體的結(jié)構(gòu) 圖2 噬菌體電鏡照片2.2、基因組特征：噬菌體的基因組，為兩端不閉合的線型雙鏈DNA，約占粒子重的54%，分子量為30.8×106道爾頓，48502核苷

5、酸對(duì)，長(zhǎng)度為17m，DNA分子兩末端的5端稱為成熟末端，粘性末端由噬菌體顆粒提取的DNA，其線性分子與兩端連接呈環(huán)狀的分子，可成一平衡狀態(tài)，但環(huán)狀分子兩條鏈各有一缺口。在DNA分子濃聚的情況，分子末端之間連接，可以發(fā)生聚集現(xiàn)象。由于DNA兩條鏈的堿基差異，得到的分開(kāi)的兩條單鏈，分別稱為l和r鏈（左和右鏈）。l鏈的走向是從53的方向，所以是左向或反時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄，5末端稱為m末端，末端堿基為鳥(niǎo)嘌呤（G）。r鏈的53走向與l鏈相反為右向或順時(shí)針?lè)较蜣D(zhuǎn)錄，鏈的5末端稱為m末端，其末端堿基為腺嘌呤（A）。感染進(jìn)入菌細(xì)胞的DNA兩互補(bǔ)端聯(lián)結(jié)，成為環(huán)狀DNA分子，并由宿主細(xì)胞的連接酶將兩端的缺口封閉成環(huán)狀D

6、NA分子，噬菌體進(jìn)行復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和整合。如在離體的條件下，用DNA聚合酶將此單鏈的黏性末端補(bǔ)平成雙鏈，DNA就失去其生物活性，不再能有復(fù)制和溶原化的能力。圖3: 噬菌體的DNA線狀圖譜基因組可分為四大簇，它們分別是調(diào)節(jié)區(qū)、重組區(qū)、復(fù)制區(qū)和結(jié)構(gòu)基因區(qū)(包括與頭、尾部合成及組裝、裂解有關(guān)的基因) .整個(gè)基因組如圖所示，可分為三個(gè)部分，左臂：長(zhǎng)約20kb，其中的基因編碼構(gòu)成頭部、尾部、尾絲對(duì)組裝完整噬菌體所需要的蛋白質(zhì)。中段：長(zhǎng)約20kb，是DNA整合和切出，溶原生長(zhǎng)所需的序列。右臂：長(zhǎng)約10kb，是調(diào)控區(qū)，控制溶菌和溶原生長(zhǎng)最重要的調(diào)控基因和序列、以及DNA復(fù)制起始均在這區(qū)域內(nèi)。左右臂包含DNA復(fù)制

7、、噬菌體結(jié)構(gòu)蛋白合成、組裝成熟噬菌體、溶菌生長(zhǎng)所需全部序列；對(duì)溶菌生長(zhǎng)來(lái)說(shuō)，中段是非必需的。根據(jù)DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可將66個(gè)可編碼的基因分成3個(gè)功能區(qū)（function block）： 右邊的功能區(qū)參與衣殼形成和DNA的復(fù)制，稱為右操縱子區(qū)； 左邊的功能區(qū)與裂解生長(zhǎng)和溶源化功能有關(guān)，稱為左操縱子區(qū)；中央功能區(qū)是基因組調(diào)控操縱子區(qū)，也稱為免疫操縱子區(qū)。圖4：基因組環(huán)狀圖譜及主要的基因噬菌體基因組的最大特點(diǎn)是在雙鏈線狀DNA兩端各有12bp的粘性末端，可以環(huán)化，該粘性末端形成的雙鏈區(qū)域稱為cos位點(diǎn)（cohensive-end site）。如果將左右臂和中段都去除，僅留下DNA而端包裝噬菌體所必需

8、的cos序列，再加上質(zhì)粒的復(fù)制序列、標(biāo)志基因、多克隆位點(diǎn)等，就可構(gòu)成cos質(zhì)?；蚍Q為粘粒的載體。粘?？刹迦?5kb長(zhǎng)的外源DNA，然后用噬菌體外殼蛋白包裝成噬菌體，感染大腸桿菌后，粘粒的DNA能以質(zhì)粒的形式在細(xì)菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文庫(kù)的構(gòu)建。圖5:通過(guò)cos位點(diǎn)，可形成雙鏈環(huán)狀復(fù)制型DNA（RF DNA）2.3、噬菌體的侵染過(guò)程（1）吸附吸附是病毒表面蛋白與細(xì)胞受體特異性的結(jié)合，導(dǎo)致病毒附著于細(xì)胞表面，這是啟動(dòng)病毒感染的第一階段。病毒吸附蛋白病毒吸附蛋白（viral attachment protein, VAP）是病毒毒粒表面能夠特異性地識(shí)別細(xì)胞受體并與之結(jié)合的結(jié)構(gòu)蛋白分

9、子，亦稱作反受體（antireceptor）。無(wú)包膜毒粒的反受體往往是殼體的組成部分，有包膜病毒的反受體為包膜糖蛋白。編碼反受體的基因的突變、能夠滅活或破壞反受體的蛋白水解酶、-糖苷酶及中和抗體等均可導(dǎo)致反受體與受體相互作用能力的喪失，進(jìn)而影響病毒的感染性。細(xì)胞受體病毒的細(xì)胞受體亦稱病毒受體，是指能被病毒吸附蛋白特異性地識(shí)別并與之結(jié)合，介導(dǎo)病毒進(jìn)入細(xì)胞，啟動(dòng)感染發(fā)生的一組細(xì)胞膜表面分子，其大多數(shù)為蛋白質(zhì)，亦可能是糖蛋白或磷脂。不同種系的細(xì)胞具有不同病毒的細(xì)胞受體，病毒受體的細(xì)胞種系特異性決定了病毒的宿主范圍。病毒的吸附過(guò)程病毒毒粒與宿主細(xì)胞的初始結(jié)合往往涉及一個(gè)VAP分子于一個(gè)受體蛋白分子的結(jié)

10、合，這種結(jié)合并不緊密，是一可逆過(guò)程。當(dāng)毒粒上的多個(gè)位點(diǎn)與多個(gè)受體結(jié)合時(shí)就可能發(fā)生不可逆的結(jié)合，即發(fā)生吸附增強(qiáng)作用，這種增強(qiáng)作用使得毒粒與細(xì)胞的結(jié)合更加穩(wěn)定、牢固。病毒吸附蛋白與細(xì)胞受體間的結(jié)合力來(lái)源于空間結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)性，相互間的電荷、氫鍵、疏水性作用及范德華力。（2）侵入侵入又稱病毒的內(nèi)化，這是一個(gè)病毒吸附后幾乎立即發(fā)生，依賴于能量的感染步驟。噬菌體采取注射的方式將噬菌體核酸注入宿主細(xì)胞。（3）脫殼脫殼是病毒侵入后，噬菌體的殼體除去而釋放出病毒基因組的過(guò)程，它是病毒基因組進(jìn)行復(fù)制和功能表達(dá)所必需的感染事件。噬菌體脫殼與侵入是一起發(fā)生的，僅有病毒核酸及結(jié)合蛋白進(jìn)入細(xì)胞，殼體留在細(xì)胞外。（4）病毒大

11、分子的合成噬菌體多數(shù)情況下進(jìn)行溶源型感染，因此原噬菌體整合至宿主細(xì)胞染色體上，隨其進(jìn)行復(fù)制和轉(zhuǎn)錄。在這一過(guò)程中多發(fā)生的各種病毒復(fù)制事件存在著強(qiáng)烈的時(shí)序性。病毒復(fù)制的時(shí)序性主要表現(xiàn)為基因組轉(zhuǎn)錄的時(shí)間組織，即病毒基因組的轉(zhuǎn)錄是分期進(jìn)行的。根據(jù)病毒大分子合成過(guò)程中所發(fā)生事件的時(shí)間順序，可以將此過(guò)程劃分為3個(gè)連續(xù)的階段：病毒早期基因的表達(dá)；病毒基因組的復(fù)制；病毒晚期基因的表達(dá)。噬菌體DNA合成后腺嘌呤和胞嘧啶被甲基化，或形成由數(shù)個(gè)單位長(zhǎng)度DNA以相同方向連接形成的DNA復(fù)制分子，即多連體（concatemers），以保護(hù)噬菌體DNA免遭宿主細(xì)胞核酸酶降解。整合有原噬菌體的宿主細(xì)胞不能夠再次接受同源噬菌

12、體的感染。（5）裝配與釋放特定情況下，整合于宿主細(xì)胞染色體上的原噬菌體會(huì)從上面分離下來(lái)，表達(dá)出噬菌體必需的結(jié)構(gòu)蛋白以及多種物質(zhì)后，裝配成為完整的噬菌體病毒毒粒，進(jìn)入溶菌階段，將宿主細(xì)胞裂解開(kāi)而釋放出來(lái)，再次侵染其他正常的宿主細(xì)胞。3、Lysogenic and lytic process of -phage當(dāng) DNA侵入宿主細(xì)胞后。溶原和裂解途徑的最初過(guò)程是相同的。兩者均要求前早期和晚早期基因的表達(dá)。然后發(fā)生歧化前早期和晚早期基因表達(dá)最終產(chǎn)生cI蛋白，使 進(jìn)入溶原狀態(tài)，而晚期基因表達(dá)使進(jìn)入裂解循環(huán)。兩個(gè)途徑不是截然分開(kāi)的溶原化循環(huán)包括3個(gè)階段：溶原的建立、保持和噬菌體的釋放第一個(gè)階段是 DNA

13、整合到宿主染色體上。成為前噬菌體狀態(tài)第二個(gè)階段是阻遏白操縱子的表達(dá)。其產(chǎn)物cI蛋白與cI基因左、右兩邊操縱子(即早左操縱子和早右操縱子)的操縱基因(OL和OR)結(jié)合，抑制它們的轉(zhuǎn)錄。阻斷整個(gè)溶菌途徑。溶原狀態(tài)得以保持但在紫外線等因素作用下，CI蛋白被鈍化，前噬菌體又被切割下來(lái)，進(jìn)入裂解途徑的基因調(diào)控程序圖6: 噬菌體的溶菌和溶原繁殖方式溶菌途徑的建立過(guò)程按時(shí)間順序可劃分為3個(gè)階段，前早期，晚早期和晚期這三個(gè)階段實(shí)質(zhì)是由三個(gè)操縱子，即早左、早右操縱子和晚期操縱子的相繼激活，合成了三種重要的調(diào)節(jié)蛋白，即N蛋白、Cro蛋白和Q蛋白當(dāng)溶原化細(xì)菌進(jìn)入溶菌狀態(tài)時(shí)，c I基因即行關(guān)閉，CI蛋白不再合成，解除

14、了CI蛋白對(duì)早左、早右兩個(gè)操縱子的控制，這就是前早期基因的表達(dá)前早期基因表達(dá)產(chǎn)物為N蛋白和Cro蛋白Cro蛋白阻遏CI蛋白的合成，從而使 得以進(jìn)入裂解循環(huán)，而N蛋白使前早期基因的轉(zhuǎn)錄越過(guò)終止信號(hào)而進(jìn)入晚早期基因，為溶原和裂解的歧化做好準(zhǔn)備圖7：噬菌體的調(diào)節(jié)基因和轉(zhuǎn)錄次序圖晚早期主要是使早左與早右操縱子表達(dá)完全，包括早左操縱子的整合基因、割離基因和重組基因的表達(dá)，以及早右操縱子的調(diào)節(jié)蛋白基因Q、Cro、cII、cm和復(fù)制基因0、P的表達(dá)，這些基因的完全表達(dá)即為溶原和溶菌的歧化做好了準(zhǔn)備噬菌體對(duì)兩個(gè)生活史周期的選擇取決于CI蛋白和Cro蛋白兩者相拮抗的結(jié)果前早期和晚早期基因的表達(dá)使Cro蛋白和CI

15、蛋白均積累起來(lái)，CI蛋白抑制除自身外的一切基因的轉(zhuǎn)錄如果CI蛋白占優(yōu)勢(shì)，它就阻止的復(fù)制，促進(jìn)整合作用的發(fā)生，使溶原狀態(tài)得以建立和維持Cro蛋白則抑制c I基因的轉(zhuǎn)錄，因此是一種抗阻遏物如果Cro蛋白占優(yōu)勢(shì)，CI蛋白不能合成，噬菌體即進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)繁殖周期晚早期的Q基因產(chǎn)物是晚期基因表達(dá)的激活蛋白，Q蛋白積累到一定程度，基因表達(dá)便進(jìn)入晚期階段，這個(gè)階段已不再需要早期基因表達(dá)，這時(shí)由于Cro蛋白的積累而將之關(guān)閉晚期表達(dá)的基因主要是晚期操縱子基因這個(gè)操縱子上有20個(gè)結(jié)構(gòu)基因，它們占DNA基因的一半左右因此，晚期操縱子作為一個(gè)獨(dú)立的操縱子十分重要，這些基因的獨(dú)立開(kāi)啟和調(diào)節(jié)，更有利于這些蛋白的合成，使整個(gè)溶菌

16、過(guò)程得以完全實(shí)現(xiàn)因此，的溶原和溶菌途徑是在 的四個(gè)操縱子控制下依次完成的在這四個(gè)操縱子中，阻遏蛋白操縱子是一個(gè)起總控制作用的操縱子，是基因組的總開(kāi)關(guān)，它決定噬菌體潛伏或裂解的命運(yùn)有人把的四個(gè)操縱子的這種活像接力賽似的，單線聯(lián)系的調(diào)控程序又比喻為瀑布式調(diào)控，既形象又客觀。每一個(gè)操縱子就像一個(gè)臺(tái)階，的遺傳信息流就是這樣一瀉到底，蛋白質(zhì)合成了，成熟的噬菌體裝配好了，裂解途徑也就結(jié)束了因而，基因調(diào)控的線性規(guī)則，既簡(jiǎn)單又科學(xué)4、噬菌體在生物學(xué)中的應(yīng)用4.1、DNA作為外源基因的克隆載體基因組中間部分占30% 的DNA(包括重組和溶源化基因)并不是噬菌體裂解生長(zhǎng)所必需的，裂解生長(zhǎng)所需的基因都在基因組的左側(cè)

17、和右側(cè)，而典型的克隆載體在部分或全部非必需基因的兩側(cè)含有限制酶位點(diǎn)，這就賦予了載體克隆大片段的能力，外源基因插入到限制酶位點(diǎn)之間，在體外包裝成噬菌體，雖然包裝效率僅達(dá)10%，但一經(jīng)包裝，在大腸桿菌中形成噬菌斑的效率可達(dá)100% 。目前由衍生的許多載體被廣泛地應(yīng)用于基因克隆中，尤其是在構(gòu)建基因文庫(kù)中的應(yīng)用產(chǎn)生了非常好的效果。4.2、類噬菌體載體構(gòu)建構(gòu)建噬菌體載體的基本原理是多余限制位點(diǎn)的刪除。按照這一基本原理構(gòu)建的噬菌體的派生載體，可以歸納成兩種不同的類型： 一種是插入型載體（insertionvectors），只具有一個(gè)可供外源DNA插入的克隆位點(diǎn)。 另一種是替換型載體（replacement

18、vectors），具有成對(duì)的克隆位點(diǎn)，在這兩個(gè)位點(diǎn)之間的人DNA區(qū)段可以被外源插入的DNA片段所取代。在基因克隆中的二者的用途不盡相同。插入型載體只能承受較小分子量（一般在10kb以內(nèi)）的外源DNA片段的插入，廣泛應(yīng)用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替換型載體則可承受較大分子量的外源DNA片段的插入，所以適用于克隆高等真核生物的染色體DNA。（i）插入型載體外源的DNA克隆到插入型的載體分子上，會(huì)使噬菌體的某種生物功能喪失效力，即所謂的插入失活效應(yīng)。插入型的載體又可以分為免疫功能失活的（inactivatiortofimmunityfunction）和大腸桿菌-半乳糖苷酶失活的（inactl

19、vatlonofEcoli-galactosidase）兩種亞型。免疫功能失活的插入型載體：在這類插入型載體的基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種核酸內(nèi)切限制酶的單切割位點(diǎn)。當(dāng)外源DNA片段插入到這種位點(diǎn)上時(shí)，就會(huì)使載體所具有的合成活性阻遏物的功能遭受破壞，而不能進(jìn)入溶源周期。因此，凡帶有外源DNA插入的重組體都只能形成清晰的噬菌斑，而沒(méi)有外源DNA插入的親本噬菌體就會(huì)形成混濁的噬菌斑。-半乳糖苷酶失活的插入型載體：它們的基因組中含有一個(gè)大腸桿菌的lac5區(qū)段，其中編碼著半乳糖著酶基因lacZ。由這種載體感染的大腸桿菌lac-指示菌，涂布在補(bǔ)加有IPTG和Xgal的培養(yǎng)基平板上，會(huì)形成藍(lán)色的噬

20、菌斑。如果外源DNA插入到lac5區(qū)段上，阻斷了-半乳糖著酶基因lacZ的編碼序列，不能合成-半乳糖昔酶，只能形成無(wú)色的噬菌斑。（ii）替換型載體替換型載體又叫做取代型載體（substitutionvector），是一類在噬菌體基礎(chǔ)上改建的、在其中央部分有一個(gè)可以被外源插入的DNA分子所取代的DNA片段的克隆載體。NM781便是其中的一個(gè)代表。在這個(gè)替換型載體中，可取代的EcoRI片段，編碼有一個(gè)supE基因（大腸桿菌突變體tRNA基因）,由于這種NM781噬菌體的感染，寄主細(xì)胞lacZ基因的琥珀突變更被抑制了，能在乳糖麥康基氏（MacConkey）瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出紅色的噬菌斑，或是在Xga

21、l瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍(lán)色的噬菌斑。如果這個(gè)具有supE基因的EcoRI片段被外源DNA取代了，那么所形成的重組體噬菌體，在上述這兩種指示培養(yǎng)基上都只能產(chǎn)生出無(wú)色的噬菌斑。用替換型載體克隆外源DNA包括三個(gè)步驟：第一，應(yīng)用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切限制酶消化載體，除去基因組中可取代的DNA區(qū)段。第二，將上述所得的人DNA臂同外源DNA片段連接。第三，對(duì)重組體的DNA分子進(jìn)行包裝和增殖，以得到有感染性的重組噬菌體。圖8：cosmid克隆的一般過(guò)程5、小結(jié)噬菌體對(duì)分子生物學(xué)的發(fā)展起到了重要的作用。很多噬菌體是目前了解最清楚的，研究最深入的有機(jī)體。自從1974年第一次證明噬菌體作為克隆載體的可能性以來(lái)，載體已在分子克隆中扮演重要角色，現(xiàn)在已有各種用途的復(fù)雜載體可供選用，它的發(fā)展是由于對(duì)這個(gè)噬菌體的生理和遺傳