CAR-T細胞制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范

1、CAR-T細胞制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范嵌合抗原受體修飾T細胞(CAR-T細胞)制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范CodeofmanufacturingqualitymanagementforClimericAntigenReceptorTCells(CAR-Tcells)based-medicinalproduct目次前言11引言ii1范圍i2術語和定義13基本要求23.1基本原則23.2人員的要求23.3場所和設施23.4物料24載體制備34.1 質(zhì)粒制備34.2 非病毒載體制備的基本要求34.3 病毒載體制備的基本要求35細胞制備過程中的要求35.1 樣本的要求35.2 T細胞的采集和分離45.3 操作的要

2、求45.4 細胞轉(zhuǎn)導及擴增的要求45.5 安全性及有效性檢測55.6 CAR-T細胞制劑的質(zhì)量要求55.7 CAR-T細胞凍存、運輸與復蘇的要求56CAR-T制劑的質(zhì)量控制與放行57追溯58保密原則69附則6參考文獻7前言本標準按照GB/T1.1-2009標準化工作導則第1部分：標準的結(jié)構和編寫給出的規(guī)則起草。請注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機構不承擔識別這些專利的責任。本標準由中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會制定，由中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會實施。本標準起草單位：中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會醫(yī)藥生物技術臨床應用專業(yè)委員會。本標準主要起草人：。本標準為首次發(fā)布。引言近年來，免疫治療經(jīng)歷了一系列突飛猛進的

3、發(fā)展，以特異性過繼免疫細胞療法及免疫檢查點抗體療法為代表的新型免疫治療技術因其在臨床研究中取得的顯著療效而成為學術界和產(chǎn)業(yè)界共同關注的焦點。其中，嵌合抗原受體T細胞免疫療法(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy,CAR-T療法)因其在白血病、淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤的治療中展現(xiàn)出顯著的治療效果而成為國內(nèi)外研究的熱點。隨著我國對CAR-T技術的研究不斷深入，國內(nèi)企業(yè)的積極布局和產(chǎn)業(yè)鏈的延伸，我國的CAR-T細胞治療技術也在緊隨國際趨勢的發(fā)展。然而，目前國內(nèi)關于CAR-T細胞的制備和質(zhì)量控制缺乏統(tǒng)一的標準和管理規(guī)范，各制備機構或應用機構之間無法進行正常的

4、評估和交流，一定程度上不利于細胞治療產(chǎn)業(yè)的專業(yè)化發(fā)展。只有確立了安全、規(guī)范、穩(wěn)定、可追溯的行業(yè)規(guī)范，才能從源頭保證整個CAR-T細胞治療產(chǎn)業(yè)的規(guī)范性和安全性。為了適應我國CAR-T細胞治療產(chǎn)業(yè)的需要，加強CAR-T細胞治療的管理，規(guī)范細胞制備過程，保證CAR-T細胞制品在臨床應用的安全性，促進國際間同行的交流，有必要制定中國醫(yī)藥生物技術行業(yè)的CAR-T細胞制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范。嵌合抗原受體修飾T細胞（CAR-T細胞）制劑制備質(zhì)量管理規(guī)范1 范圍為協(xié)助CAR-T細胞制劑制備機構（以下簡稱機構）在制備過程中避免污染、交叉污染、混淆及差錯，且保證CAR-T細胞制劑的安全性、生物學效應，參照免疫細胞制

5、劑制備質(zhì)量管理自律規(guī)范等相關規(guī)定和指導原則，制定本規(guī)范。1.1 本規(guī)范所稱的CAR-T指用于治療的、經(jīng)體外基因?qū)牒蟊磉_嵌合型抗原受體的人源T細胞，T細胞來源于患者自體或異體外周血淋巴細胞。1.2 本規(guī)范適用于CAR-T細胞制劑制備的所有階段。2 術語和定義下列術語和定義適用于本文件。2.1 嵌合抗原受體T細胞（CAR-T細胞）ChimericAntigenReceptorTCell,CAR-Tcell經(jīng)過基因工程修飾的，可表達被導入的含有抗原識別片段、T細胞受體活化分子、共刺激信號等信號分子的CAR基因的T細胞。2.2外周血單個核細胞PeripheralBloodMononuclearCel

6、l,PBMC血液中具有單個核的細胞，主要包括淋巴細胞，單核細胞，巨噬細胞，樹突狀細胞和少量其他細胞類型。2.3質(zhì)粒Plasmid是一類存在于細菌和真菌細胞中獨立于染色體DNA而自主復制的共價、閉合、環(huán)狀DNA分子，是基因工程最常見的運載體。2.4目的基因TargetGene人工構建的具有明確功能的基因或基因片段。2.5 載體Vector在基因工程重組DNA技術中將DNA片段（目的基因）轉(zhuǎn)移至受體細胞中進行復制和表達的工具。常用的載體包括質(zhì)粒、慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒等。2.6 轉(zhuǎn)導Transduction借助病毒等方法將外源性遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）導入細胞進行穩(wěn)定表達的過程。2.7 凍存液Cry

7、oprotectant當與活細胞相結(jié)合時，能保護細胞在冷凍和復蘇過程不受損害的溶液或試劑。2.8 標識Label粘貼或附著在對象上的用于區(qū)分不同對象的標記、注釋或條碼細胞批次CellBatch指取自個體的一次采集的細胞，經(jīng)生產(chǎn)全過程制成的終末細胞培養(yǎng)物或收獲物。3基本要求基本原則CAR-T細胞制劑的制備包括質(zhì)粒的制備、病毒的制備、樣本的接收和處理、細胞刺激、轉(zhuǎn)導、擴增、收獲、質(zhì)量檢測以及凍存、運輸?shù)热^程。對各個操作環(huán)節(jié)以及環(huán)境和人員等都有嚴格的要求以確保最終產(chǎn)品符合標準。3.1 人員的要求3.2.1機構應配備與其規(guī)模相適應的專門的CAR-T細胞制劑制備人員和質(zhì)量檢測人員，操作人員應具備基本的

8、專業(yè)知識，并接受特定的專業(yè)技術培訓后方可上崗。病毒構建和細胞制備技術人員身體健康無傳染性疾病，能熟練掌握無菌操作技能，并具備GMP級病毒構建或人T細胞培養(yǎng)經(jīng)驗。3. 2.2建立人員衛(wèi)生操作規(guī)程和自我防護規(guī)程，最大限度地降低人員對細胞制備造成污染以及操作人員自我感染的風險。操作規(guī)程應當包括與健康、衛(wèi)生習慣及人員著裝相關的內(nèi)容，以及操作過程中避免交叉感染和污物正確處理方法等內(nèi)容。參觀人員和未經(jīng)培訓的人員不得進入制備區(qū)和質(zhì)控區(qū)。3.3 場所和設施3.1CAR-T細胞制劑制備場所分為潔凈區(qū)及非潔凈區(qū)。潔凈區(qū)各功能區(qū)包括細胞制備區(qū)、細胞儲存區(qū)、病毒制備區(qū)、病毒儲存區(qū)、中控區(qū)、部分質(zhì)控區(qū)（無菌檢測室、微生

9、物限度室、陽性對照室、細胞操作室等）等，各個區(qū)域相互獨立，病毒制備區(qū)、病毒儲存區(qū)、陽性對照室應具有獨立的空調(diào)系統(tǒng)。非潔凈區(qū)包括部分質(zhì)控區(qū)（革蘭氏染色、內(nèi)毒素測定、流式細胞儀檢測等）、留樣室、辦公室、資料檔案室、物料儲存室、氣體儲存室等，不應與潔凈區(qū)交叉過往。機構可根據(jù)實際情況合理分配各區(qū)。3. 3.2潔凈區(qū)應當根據(jù)制備流程及相應的潔凈度級別要求合理設計、布局和使用。潔凈區(qū)應以溫濕度、微粒、微生物、壓差為主要控制參數(shù)。3.4 物料4.1CAR-T細胞制劑制備所用的物料是指制備中所使用的試劑耗材、生物活性分子以及與細胞制劑直接接觸的包裝材料及外包裝材料等。3. 4.2CAR-T細胞制劑制備所用的樣

10、本及物料應當符合相應的質(zhì)量標準。進口物料應當符合國家相關的進口管理規(guī)定。細胞制劑制備中使用的物料管理應參照細胞治療產(chǎn)品研究與評價技術指導原則。4. 載體制備質(zhì)粒制備4.1. 1質(zhì)粒應序列信息明確，并得到準確的鑒定和確認。4.1 .2質(zhì)粒的質(zhì)量應經(jīng)過檢測，包括但不限于：a）純度：超螺旋型的含量，細菌基因組DNA、RNA和蛋白殘留量；b）無菌試驗；c）熱原質(zhì)試驗；d）過敏試驗；e）異常毒性試驗；f）介導目的基因的活性檢測；g）有害物質(zhì)殘余量的測定。4.2 非病毒載體制備的基本要求非病毒載體（包括但不限于DNA、RNA,蛋白質(zhì)）應有明確的來源、結(jié)構和遺傳特性，制備過程應符合GMP標準，達到相應質(zhì)量標

11、準的要求。應不含有支原體、細菌及病毒，內(nèi)毒素等其他外源因子應控制在限定范圍內(nèi)；根據(jù)所選擇載體類型不同，可綜合參考細胞制品研究與評價技術指導原則（試行）并分別參考人基因治療研究和制劑質(zhì)量控制技術指導原則、人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術指導原則、人用單克隆抗體質(zhì)量控制技術指導原則等相關指導原則開展相關技術研究。4.3 病毒載體制備的基本要求4.3.1病毒包裝所使用的細胞系應有明確來源和批次信息，并有詳細記錄；應不含有支原體、細菌及病毒，內(nèi)毒素等其他外源因子應控制在限定范圍內(nèi)；應通過表型或生物化學等方法進行檢測來確保其性質(zhì)和均一性。4.3.2應提供病毒包裝所用細胞系的細胞培養(yǎng)液的詳細成分并應具有溯源

12、性，如使用人或動物源性成分，如血清、胰蛋白酶或其他生物學活性的物質(zhì)，應具有這些成分的來源、批號、質(zhì)量控制、檢測結(jié)果和質(zhì)量保證的相關信息，并確保其不含有特定動物源性病毒成分。4.3.3每一批用于轉(zhuǎn)導的病毒應經(jīng)過檢測，包括但不限于：鑒別試驗。根據(jù)生產(chǎn)過程中引入的風險，進行與其他病毒的交叉檢測，如腺病毒、EBV、CMV、HAV、HBV、HIV、HTLV等；病毒復制能力（RCR）檢測（生產(chǎn)時的批次和凍存復蘇時的批次）；無菌試驗；內(nèi)毒素檢測；支原體檢測；殘留量測定：應根據(jù)生產(chǎn)工藝及成品的添加成份，對有潛在危險性的成份進行殘留量檢測。如病毒生產(chǎn)工藝中使用牛血清則需檢測牛血清白蛋白殘留量；制劑需檢測總DNA

13、殘留；對于使用轉(zhuǎn)入SV40基因的293T細胞進行病毒生產(chǎn)的，需檢測SV40序列的殘留等；病毒滴度測定；效力試驗：插入基因的蛋白表達水平測定及生物學活性測定。4. 3.4病毒應進行有效期研究，并在有效期內(nèi)使用。病毒應儲存于合適的環(huán)境中，確保病毒的無菌性以及效價的持久性。5細胞制備過程中的要求樣本的要求5.1. 1樣本送達時應附細胞制備申請單，內(nèi)容包括但不限于：患者基本信息：姓名、性別、年齡、身份證號等必要信息；患者的臨床醫(yī)學信息：既往史、現(xiàn)病史、臨床診斷、病理診斷、月中瘤特異性靶點信息；實驗室檢測的結(jié)果：血常規(guī)及分類、病毒四項檢查（HIV、HCV、HBV、梅毒）、肝腎功能；治療方案：細胞的種類、

14、治療次數(shù)、回輸方式等；知情同意書。5.1 T細胞的采集和分離2.1應在國家衛(wèi)生部門認可的采血科室，應用全自動血細胞分離機，按單核細胞分離程序，采集外周單個核細胞富集血，或應用合格的醫(yī)療器材通過靜脈采取患者外周血。根據(jù)制備要求對采集的外周血進行單個核細胞的分離及T細胞的分選，并對所分選出的T細胞進行刺激和活化。5. 2.2應對患者進行血常規(guī)及乙型肝炎病毒（HBV）檢測，乙型肝炎病毒陽性患者的T細胞需在專用細胞處理間進行細胞分離、培養(yǎng)、收集，完成制備過程。5. 2.3采集管路需使用一次性消耗品，血細胞分離機定期進行清潔和檢測。5. 2.4在符合潔凈要求的操作間分離PBMC,根據(jù)病人情況或?qū)嶒炓笤?/p>

15、進一步確定是否分選特定細胞亞群進行轉(zhuǎn)導，轉(zhuǎn)導前進行細胞計數(shù)及細胞存活率測定。活化T細胞所采用的刺激抗體或磁珠抗體應符合相關質(zhì)量要求。5. 2.5培養(yǎng)過程中對培養(yǎng)基、活性因子等外源蛋白的要求如下：a）所有使用的培養(yǎng)基、活性因子等外源蛋白應有明確的來源及批號，應有質(zhì)量檢定合格報告。b)CAR-T細胞體外擴增培養(yǎng)應避免使用異種、異體血清或血漿所有成分應明確并符合無菌、低內(nèi)毒素的質(zhì)量標準，制劑中殘留的培養(yǎng)基成分應對回輸者無不良影響。5.3 操作的要求3.1CAR-T細胞制劑的制備應當按照經(jīng)過驗證后批準的操作規(guī)程的要求進行，并有相關記錄，以確保CAR-T細胞制劑達到規(guī)定的質(zhì)量標準。5. 3.2在感染性樣

16、本操作區(qū)以及病毒的制備區(qū)內(nèi)，操作人員應當穿戴該區(qū)域?qū)Ｓ玫姆雷o服。6. 3.3同一個培養(yǎng)箱內(nèi)不得同時存放兩個不同批次的細胞培養(yǎng)產(chǎn)品，以免混淆造成嚴重后果。應在細胞培養(yǎng)耗材及培養(yǎng)箱上進行標識。7. 3.4應當建立CAR-T細胞制劑以及病毒的批號編制規(guī)程和確定收獲日期的操作規(guī)程。收獲日期應明確日期及時間。每批細胞制劑以及病毒均應當編制唯一的批號，并建立細胞制劑以及病毒的出入登記記錄制度。8. 3.5操作前還應當檢查所領用的包裝材料正確無誤，核對待包裝產(chǎn)品和所用包裝材料的名稱、規(guī)格、數(shù)量、質(zhì)量狀態(tài)，且與操作規(guī)程相符。5.4 細胞轉(zhuǎn)導及擴增的要求5.4.1細胞轉(zhuǎn)導主要包括非病毒轉(zhuǎn)導和病毒轉(zhuǎn)導2種方式，應

17、確認基因?qū)胂到y(tǒng)并對其進行驗證，每一操作步驟必須鑒定其結(jié)果，轉(zhuǎn)導過程及結(jié)果應有記錄。5.4.2應注意安全操作，轉(zhuǎn)導過程中所使用的培養(yǎng)皿或培養(yǎng)袋等耗材和細胞因子等均需符合臨床應用標準。5. 4.3細胞擴增過程中每一步應準確計數(shù)并注意細胞濃度調(diào)整及培養(yǎng)時間以保證擴增后數(shù)量達到臨床要求。5.5 安全性及有效性檢測5.1體外試驗：應檢驗該CAR-T細胞目的基因的表達情況，及其對目標抗原陽性月中瘤細胞特異性殺傷作用的情況。5. 5.2體內(nèi)試驗：應至少有一批動物實驗結(jié)果，證明該CAR-T細胞在動物體內(nèi)的安全性和有效性。導入的途徑應盡可能接近于臨床試驗的途徑或條件。5.6 CAR-T細胞制劑的質(zhì)量要求5.6

18、.1應進行無菌試驗和支原體檢測。5.6.2應進行內(nèi)毒素檢測。5.6.3如果細胞培養(yǎng)基內(nèi)添加成分可能會對細胞制劑質(zhì)量或安全性產(chǎn)生影響，應對培養(yǎng)基及其他添加成分殘余量進行檢測，如細胞因子等。5.6.4使用磁珠抗體刺激T細胞的，應檢測細胞中的殘余磁珠鼻里05.6.5應對細胞存活率和回輸數(shù)量進行檢測。5.6.6應對終產(chǎn)品中CAR-T細胞轉(zhuǎn)導率、免疫表型進行檢測。5.6.7應檢測CAR-T細胞制劑對特異性月中瘤細胞的殺傷作用。如果制備的是異體CAR-T細胞，還應檢測CAR-T細胞對正常細胞的殺傷。5.6.8用病毒轉(zhuǎn)導細胞并對病毒RCR完成檢測之后，應留取部分CAR-T細胞以備將來需要時對RCR的檢測。應進行RCR的長期隨訪檢測。5.7CAR-T細胞凍存、運輸與復蘇的要求.7.1CAR-T產(chǎn)品應用之前可先凍存，待質(zhì)控試驗結(jié)束證實結(jié)果無問題后再復蘇并進行回輸。5 .7.2凍存、運輸與復蘇的方法、凍存液以及凍存容器等應經(jīng)過驗證，保證細胞質(zhì)量和安全性。6 CAR-T制劑的質(zhì)量控制與放行機構應具有CAR-T細胞制劑的檢測能力，并配備相關專業(yè)技術人員和設備，建立制劑質(zhì)量控制檢測標準和操作規(guī)程，確立制劑質(zhì)量檢驗和放行的操作規(guī)程，所有的檢測方法應經(jīng)過驗證。對整個制備過程中各個環(huán)節(jié)的質(zhì)量控制均符合標準方可進行臨