富硒雞腿菇深層發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

1、Process Tech no logy52 / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPIN# / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPINdoi：10.16736/41-1434/ts.2019.11.018富硒雞腿菇深層發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化Copri nus Comatus崔鵬舉，劉占，尹智美(廣東美味鮮調(diào)味食品有限公司，廣東？ 中山？ 528437Cui Pengju, Liu Zhan, Yin Zhimei(Gua ngdo ng Meiweixia n Flavouri ng Food Co., Ltd., Zhon gsha528437, China)摘 要：采用Plackett-Burma

2、n法、最陡爬坡實驗和響應(yīng)面實驗(Box-Behnken)相結(jié)合的方法對雞腿菇 深層發(fā)酵的培養(yǎng)條件進行優(yōu)化。結(jié)果表明，發(fā)酵條件中的種齡、裝液量、初始pH值是主要影響因素。優(yōu)化后的發(fā)酵條件為溫度25 C、轉(zhuǎn)速100 r min、250 mL搖瓶的裝液量70 mL、種齡133 h、接種量3%初始pH 值為5.8及發(fā)酵周期5 d。在此條件下，菌絲體生物量為24.51 g L，富硒率為81.03%，較優(yōu)化前分別提高了 35.12% 和 43.80%。關(guān)鍵詞：雞腿菇；富硒；響應(yīng)面；深層培養(yǎng)Abstract : Plackett-Burman design combined with the path of

3、 steepest ascent method and responses surface methodology was adopted to optimization of fermentation conditions for the se-accumulation of coprinus comatus.The results indicated that fungus age, initial pH and the filling volume of shaking flask were the major factors.The optimized fermentation con

4、ditions are filling volume 70 mL in 250 mL shaking flask, fungus age 133 h, inoculum 3%, initial pH at 5.8, 25 C , shake at 100 rpm for 5 days. Un der the optimized con diti ons the product ion of mycelia biomass and the ratio of Se-1accumulation was 24.51 g L and 81.03% respectively衛(wèi)5.12% and 43.80

5、% higher than the control one respectively.Key words : Coprinus comatus; Se-accumulation; Responses surface; Submerged culture中圖分類號：S646雞腿菇(Coprinus comatus)學(xué)名毛頭鬼傘，屬 真菌門擔子菌亞門層菌綱傘菌目鬼傘科鬼傘屬。因其形狀如雞腿，味道類似雞絲而得名，是近年來人工開 發(fā)生產(chǎn)的一種珍稀食用菌1,被世界衛(wèi)生組織及聯(lián)合 國糧農(nóng)組織確定為集“天然、營養(yǎng)、保健”三種功能于一體的16種珍稀食用菌之一，被大力推廣2 o雞腿 菇不僅色、香、味俱佳，而且具

6、有益胃、清神、降血糖等功效實驗表明，雞腿菇還有提高機體免疫功能， 抑制腫瘤生長，改善血液循環(huán)等效果口。響應(yīng)面分析方法是一種采用多元二次回歸方程來擬合各因素與響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系的分析方法，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)的工藝參數(shù)，解決多 變量問題的一種統(tǒng)計方法，它已廣泛地應(yīng)用于生物、 食品等領(lǐng)域4 本研究運用Mini tab軟件，采用PB實# / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPIN# / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPIN作者簡介：崔鵬舉(1983-)，男，碩士，食品工程師、釀酒師；研究方向為微生物發(fā)酵。# / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPINProcessTech no logy工藝

7、技術(shù)空按術(shù)XIANDAISHIPIN 現(xiàn)代食 r辺/ 53帀ProcessTech no logy工藝技術(shù)空按術(shù)驗設(shè)計、最陡爬坡試驗設(shè)計和RSM對影響雞腿菇深層 富硒發(fā)酵的培養(yǎng)條件進行考察和評價，確定了最優(yōu)的 發(fā)酵培養(yǎng)條件。1材料與方法1.1?材料1.1.1菌株雞腿菇（Cc川），由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物實驗室 提供。1.1.2 培養(yǎng)基1（1） 斜面培養(yǎng)基（g L）o 土豆200；葡萄糖 20;蛋白胨 2; KH2PO4 2; MgS4 7H2O 1; VB1 0.01; 瓊脂20; pH自然。（保藏、活化、平板培養(yǎng)基配方與 斜面培養(yǎng)基相同）。1（2）種子培 養(yǎng)基葡萄糖30;蛋白胨 4; KH2PO

8、4 2; MgS4 7巴0 1; VB! 0.01; pH自然。1（3） 發(fā)酵培養(yǎng)基（g L）o玉米粉40；葡萄糖 20;花生粕 4; KH2PO4 2; MgSO4 7巴0 1; VB1 0.01; Na2SeQ4.4X 10-3, pH 自然。1.2?方法1.2.1富硒雞腿菇菌絲體粉的制備對經(jīng)添加了亞硒酸鈉的發(fā)酵培養(yǎng)基搖瓶發(fā)酵的雞 腿菇菌絲體進行離心、60 C烘干、粉碎，得富硒雞腿 菇菌絲體干粉。1.2.2生物量測定采用干重法測定將菌絲體于60C下烘干至恒重，稱量。1.2.3雞腿菇菌絲體培養(yǎng)條件從活化培養(yǎng)基上取面積為0.5 cm2的菌落的菌絲體，接種到種子培養(yǎng)基上，在搖床轉(zhuǎn)速為100 r

9、min 25 C,每250 mL培養(yǎng)瓶的裝液量為100 mL的條件下， 培養(yǎng)4 d,然后打散至均勻，得種子培養(yǎng)液。種子培養(yǎng) 液以5%的接種量接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，上述條件下培養(yǎng)5 d,得發(fā)酵培養(yǎng)液。1.2.4硒測定方法將發(fā)酵液以8 000 r mi離心20 min,傾出上清液,采用3, 3-二氨基聯(lián)苯胺比色法5測定硒含量。 富硒率=發(fā)酵液菌絲體中的硒含量/定量發(fā)酵液中所添加的硒總量 x 100%。2結(jié)果與討論2.1?主要因素篩選1本文選用試驗次數(shù) N=8的Plackett-Burman （PB） 設(shè)計法進行試驗設(shè)計，對種齡（A）、裝液量（B）、 初始pH值（C）、轉(zhuǎn)速（D）、溫度（E）及接種量（

10、F） 6個因素進行考察，每個因素分別取2個水平（見表2）, 高水平（用1表示）取低水平（用-1表示）的1.25倍,響應(yīng)值為綜合評分（Zi），試驗設(shè)計及結(jié)果（見表1）o采用Min itab13.0軟件進行各因素主效應(yīng)分析(見表2)o表 1 Plackett-Burman1111-1-1121.1359.98110.462-1-11-11120.7861.52111.333-11-111120.9676.85128.0541-1-11-1123.4874.56131.16511-1-11-123.1160.33115.2061-1111-120.3480.43130.497-1-1-1-1-1-1

11、21.2765.22116.358-1111-1-121.7175.43128.19試驗 A B C D E試驗設(shè)計與結(jié)果表生物量富硒F /g -）率 /%zZi的計算公式如式（1）所示:(1)Zi =100 Xi18.14X0.4+100y56.35X0.6式（1）中：Zi表示綜合評分，Xi表示生物量，yi 表示富硒率）。從表2可知，6個因素中對綜合評分（Zi）影響的顯著性為：種齡 裝液量 初始pH值 轉(zhuǎn)速溫度 接種量。而且，種齡、裝液量、初始pH值及轉(zhuǎn)速這4 個因素的可信度都在95%以上，另外2個因素的可信 度低于95%o在4個顯著因素中，轉(zhuǎn)速的影響相對小 一些，因此把轉(zhuǎn)速、溫度及接種量固

12、定在較好水平上， 即分別為100r min 25 C、3%o選擇其他3個因素 作進一步優(yōu)化。XIANDAISHIPIN 現(xiàn)代食 r辺/ 53帀Process Tech no logy54 / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPIN# / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPIN為了簡化分析工作，對實驗結(jié)果進行加權(quán)處理分別列于表4、表5和表6。# / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPIN18.14、56.35分別表示優(yōu)化前Cc川的生物量和富硒率， 它們的引入一方面為消除量綱的影響，另一方面便于與 優(yōu)化前進行比較。表2各因素的主要效應(yīng)表因素水平t值Pr | t|重要性-11A溫度/C24306.400.

13、0995B 轉(zhuǎn)速 /r ni1in 120150-14.020.0454C裝液量/mL80100-19.420.0332D種齡/h96120121.790.0051E接種量/%56.25-2.060.2886F初始pH值6.07.5-17.420.03732.2?利用最陡爬坡法確定因素水平最陡爬坡法是以試驗值變化的梯度方向為爬坡方 向，依據(jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，以快速、 經(jīng)濟地逼近最佳區(qū)域7。由Plackett-Burman實驗可知，在雞腿菇的富硒液 體發(fā)酵中，種齡、裝液量、初始pH值這3個因素對綜 合評分(Zi)有重要影響，其中種齡有顯著的正效應(yīng)， 應(yīng)增加；裝液量和初始pH值有顯著

14、的負效應(yīng)，應(yīng)降低。 根據(jù)這3個因素的效應(yīng)大小比例設(shè)定其變化方向及步 長，并進行實驗，設(shè)計及結(jié)果如表3所示?？梢?，最 優(yōu)發(fā)酵條件在處理 3與處理4之間，故以處理3的條表4 Box-Behnken設(shè)計的變量及水平取值表因素代碼編碼水平-101裝液量/mLX1657075種齡/hX2126132138初始pH值X35.25.55.8表5 Box-Behnken實驗設(shè)計及結(jié)果表實驗號變量(編碼水平)生物量富硒率ZX1X2X3/g -L/%Zi1-1-1018.4261.30105.892-11017.3967.70110.4331-1019.2462.04108.48411021.7565.72117

15、.9450-1-117.0264.33106.0360-1121.4167.72119.32701-120.1558.63106.86801123.8880.61138.499-10-121.0470.87121.861010-121.3475.87127.8411-10122.7576.96132.111210123.5772.91129.611300023.3381.08137.781400023.1580.98137.271500023.0579.98135.99注：Zi與表1中定義一致。# / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPIN件為響應(yīng)面實驗的中心點。表3最陡爬坡實驗設(shè)計及其實驗結(jié)果

16、表實驗 號裝液量/mL種齡/h初始pH值生物量/g -L富硒率/% Z1901086.518.0551.6394.782801206.020.7471.19121.533701325.523.2580.74137.244601445.022.1471.52124.97注：Zi 與表1中定義一致。表6 方差分析表變異來源自由度平方和均方F值Prob F模型92 078.88230.9877.860.018一次項3572.82190.9416.500.035二次項31 397.94465.98115.850.005交互項3108.1236.0391.230.392誤差5146.9829.396失擬

17、項3145.2848.42656.940.017純誤差21.700.850# / 現(xiàn)代食品 XIANDAISHIPIN2.3?采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)條件本試驗采用Box-Behnken ( BB)設(shè)計對裝液量、 種齡和初始pH值進行進一步優(yōu)化。BB設(shè)計的變量及 水平值，BB設(shè)計及結(jié)果、綜合評分(Zi)的方差分析表6的方差分析表明，該模型的擬合度較好 (P=0.018)。只爲=81.5%,表明綜合評分(Zi) 81.5% 的變異分布在方程的9個因子中，其總變異中僅有18.5%不能由該模型解釋R2=93.4%，表明綜合評分(Zi) 實際值與預(yù)測值之間有較好的擬合度，該模型可用于 # / 現(xiàn)代食品

18、 XIANDAISHIPINProcessTech no logy 工藝技木燈術(shù)預(yù)測綜合評分（乙）的實際情況。由回歸方程系數(shù)顯著性檢驗 （表7）可知，因素 X3對綜合評分（乙）線性的效應(yīng)顯著，而因素Xi和X2 對綜合評分（Z）的線性效應(yīng)不顯著；因素X22對綜合 評分（Z）的曲面效應(yīng)高度顯著，因素Xi2對綜合評分（Zi）曲面效應(yīng)顯著，而因素X32對綜合評分（Zi）曲 面效應(yīng)不顯著；因素X1X2、X1X3和X2X3對綜合評分（Z） 的交互效應(yīng)不顯著。各因素經(jīng)回歸擬合后，得到對編 碼自變量（裝液量、種齡和初始pH值）的二次多元回 歸方程：2 2Zi=137.01 + 1.7Xi+4.25X2+7.1

19、2X3-8.07Xi -18.25X2 -1.08X32+1.23X1X2-2.12X1X3+4.59X2X3。粽合評分Zr）1-1144f/ / /-1- /-101固住因素：蠱.=0XIANDAISHIPIN 現(xiàn)代食食品衛(wèi)廬55ProcessTech no logy 工藝技木燈術(shù)表7回歸方程系數(shù)顯著性檢驗表模型項回歸系數(shù)標準誤差t值P值常量137.013.13043.770V 0.000 1X11.701.9170.8860.416X24.251.9172.2170.077X37.121.9173.7130.014X12-8.072.822-2.8620.035X-18.252.822-6

20、.4690.001X-1.082.822-0.3840.717X1X21.232.7110.4540.669X1X3-2.122.711-0.7820.470X2X34.592.7111.6910.152根據(jù)回歸分析結(jié)果（表7）,作響應(yīng)曲面圖和等 值線圖，如圖13所示。從圖中可以看出，擬合曲面有最大值，對擬合方程求偏導(dǎo)，可以得到模型的最 大值，即當裝液量為70 mL ,種齡為133h ,初始pH 為5.8時，綜合評分（Zi）為144.12。固亡因盍：龍（a）圖1 Zi=f（ X2, X3）的響應(yīng)面與等值線圖固定區(qū)素：禺=D（a）1 _ 143/ 、/ / 一丿 /0-、1汕 汽f/Z-/123

21、、y-I-11r-101A周定為素匚兀=0圖2 Zi=f （X1, X3）的響應(yīng)面與等值線圖XIANDAISHIPIN 現(xiàn)代食食品衛(wèi)廬55ProcessTech no logy 工藝技木燈術(shù)XIANDAISHIPIN 現(xiàn)代食食品衛(wèi)廬55ProcessTech no logy 工藝技木燈術(shù)7 55XIANDAISHIPIN 現(xiàn)代食食品衛(wèi)廬55Process Tech no logy2.5?生長曲線實驗在上述優(yōu)化培養(yǎng)條件下，進行發(fā)酵曲線的測定實驗，結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，富硒雞腿菇在培養(yǎng)5 d時, 達到最大生物量和較高富硒率，15 d之內(nèi)雞腿菇菌 絲體生物量和富硒率逐步提高，5 d之后的菌絲體出現(xiàn)

22、明顯的老化現(xiàn)象。30固定醫(yī)素：z=o3b)圖3 Zi=f (Xi, X2)的響應(yīng)面與等值線圖1050251-L 20 g重15培養(yǎng)時間/d優(yōu)化培養(yǎng)條件下的發(fā)酵曲線圖2.4?驗證實驗在優(yōu)化的培養(yǎng)條件下，進行了平行實驗，結(jié)果 見表&回歸方程所得的綜合評分(乙)的預(yù)測值為144.12，驗證實驗的平均值為140.33,結(jié)果比較接近， 回歸方程能夠真實地反映各篩選因素對綜合評分(乙) 的影響，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化雞腿菇深層富硒發(fā)酵培養(yǎng) 條件可行，回歸模型較可靠。實驗編號生物量/g -L富硒率/%zi124.3180.43139.25225.2679.34140.18323.7782.61140.38424.7480.98140.78524.4881.80141.08平均值(X)24.518