基因工程之微生物知識競賽

1、基因工程之基因工程之 微生物知識競賽微生物知識競賽為了治理石油泄漏，美國科學(xué)部門利用基因工程技為了治理石油泄漏，美國科學(xué)部門利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)了一種能分解大部分烴類的微生物，他們是術(shù)生產(chǎn)了一種能分解大部分烴類的微生物，他們是怎么做到的？怎么做到的？答:將能分解己烷，辛烷和癸烷，降解二甲苯和甲苯，降解萘和分解樟腦的四種假單胞桿菌的不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)入同一假單胞菌種，獲得超級細菌。該細菌能在幾小時內(nèi)降解掉海上溢油中三分之二的烴類。為什么漫畫中的兩個細菌不怕抗生素？他們形成的原理是什么？因為他們具有抗生素抗性。使用大量抗生素進行篩選和基因工程對細菌進行突變是這種細菌產(chǎn)生的原因，而基因突變是產(chǎn)生此類細菌的根

2、本原因。但在自然狀況下，變異菌在不同微生物的生存斗爭中未必處于優(yōu)勢地位，較易被淘汰。抗生素的濫用則是這類細菌今日如此盛行的導(dǎo)火線，由于人類濫用抗生素，使得原平衡中的優(yōu)勢種被淘汰，而這種“抗抗生素”的細菌則順利成長的成為了優(yōu)勢種，取得了生存斗爭的優(yōu)勢地位，從而得以大量繁衍、傳播。世界上存在各式各樣的微生物，在基因世界上存在各式各樣的微生物，在基因工程中常應(yīng)用的工程中常應(yīng)用的微生物微生物有哪些？有哪些？答：大腸桿菌，根瘤農(nóng)桿菌，噬菌體，酵母菌等。答：答： (1) (1)削減分子量削減分子量( (除去非必需區(qū)和整合區(qū)除去非必需區(qū)和整合區(qū)) )； (2) (2)削減酶切位點；削減酶切位點； (3) (

3、3)添加選擇標(biāo)記；添加選擇標(biāo)記； (4) (4)引入終止突變。引入終止突變。 如何將野生型的噬菌體改造成為一個理想如何將野生型的噬菌體改造成為一個理想的載體的載體? 答：為了擴增突變體的答：為了擴增突變體的 thyA thyA基因，先設(shè)計一對引物，其基因，先設(shè)計一對引物，其中一個引物的序列與中一個引物的序列與 thyA thyA基因基因 的的55端相同，另一個引物端相同，另一個引物同該基因的同該基因的 3 3端互補。在引物的端互補。在引物的 5 5端加上合適端加上合適類限類限制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，以便于后來的克隆。將染色制性內(nèi)切核酸酶的識別序列，以便于后來的克隆。將染色體體 DNA DNA

4、同引物混合后，進行同引物混合后，進行 PCR PCR擴增。然后進行瓊脂糖凝擴增。然后進行瓊脂糖凝膠電泳，純化擴增片段，可以直接測序或克隆到合適的載膠電泳，純化擴增片段，可以直接測序或克隆到合適的載體再測序。體再測序。 假定你分離到一個假定你分離到一個 E Ecoli coli 的的 Thy- Thy-突變體，并推測突變體，并推測有可能是有可能是 ThyA ThyA 基因突變。請設(shè)計一個方案用基因突變。請設(shè)計一個方案用 PCR PCR 從從染色體染色體DNADNA擴增突變的擴增突變的 ThyA ThyA 基因，測定突變的序列?；?，測定突變的序列。( (注：注：E Ecoli coli 野生型的

5、野生型的 ThyA ThyA 基因的序列是已知的基因的序列是已知的) )小丁用藍白斑做陽性克隆篩選小丁用藍白斑做陽性克隆篩選, ,因為疏忽沒有在選擇性因為疏忽沒有在選擇性培養(yǎng)基中添加培養(yǎng)基中添加X-gal,X-gal,結(jié)果長出的菌斑全為白色結(jié)果長出的菌斑全為白色試問：試問：（1 1）這些白斑是否全為陽性克隆）這些白斑是否全為陽性克隆, ,形成白斑的原理是形成白斑的原理是什么？什么？（2 2）如果不是）如果不是, ,通過哪些方法可以從這些白斑中選擇通過哪些方法可以從這些白斑中選擇真正陽性克?。空嬲栃钥寺。看穑海ù穑海? 1）不是）不是. .因為沒有生色底物因為沒有生色底物x-gal,x-gal

6、,陰性菌落雖然可以表達陰性菌落雖然可以表達lacZ,lacZ,但無但無法顯色法顯色. .（2 2）A)A)全部影印至含全部影印至含X-galX-gal的新鮮選擇培養(yǎng)基上的新鮮選擇培養(yǎng)基上, ,培養(yǎng)后看是否為白色培養(yǎng)后看是否為白色. . B) B)以以pcrpcr法對所有菌落作鑒定法對所有菌落作鑒定. . C) C)所有菌落轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基擴增后抽質(zhì)粒所有菌落轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基擴增后抽質(zhì)粒, ,看質(zhì)粒大小看質(zhì)粒大小. .小李家的土地由于長期種植小麥，沒進行小李家的土地由于長期種植小麥，沒進行輪作，土地嚴(yán)重缺氮，如何利用基因工程輪作，土地嚴(yán)重缺氮，如何利用基因工程手段在盡量短的時間里讓小李家的土地恢

7、手段在盡量短的時間里讓小李家的土地恢復(fù)正常生產(chǎn)？復(fù)正常生產(chǎn)？答： 利用基因工程手段對根瘤菌進行遺傳改造，如引入多拷貝的固氮酶的正調(diào)控基因nifA基因，或在該基因上游加入增強子和強啟動子。大幅提高根瘤菌的固氮作用。（美國已有在基因組中整合了外源dctABD基因的轉(zhuǎn)基因苜蓿根瘤菌（Sinorhizobium meliloti)能大幅提高固氮能力和大田苜蓿產(chǎn)量，并已通過遺傳工程安全性評價進入商品化生產(chǎn)。）（我國也有重組大豆根瘤菌HN2已通過農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因安全評價審批進行環(huán)境釋放。小李家開的發(fā)酵工廠生產(chǎn)菌株經(jīng)常因噬菌體小李家開的發(fā)酵工廠生產(chǎn)菌株經(jīng)常因噬菌體“感染感染”而不能正常生產(chǎn)，小李很苦惱，頭發(fā)

8、而不能正常生產(chǎn)，小李很苦惱，頭發(fā)都快愁白了。在排除了外部感染的可能性后有都快愁白了。在排除了外部感染的可能性后有人認為是由于溶源性菌裂解所致，小李想問你人認為是由于溶源性菌裂解所致，小李想問你的看法如何？可以幫他設(shè)計個實驗證明一下嗎的看法如何？可以幫他設(shè)計個實驗證明一下嗎? ?答：溶源菌是指在核染色體組上整合有前噬菌體并能正常生長繁殖而不被裂解的細菌（或其他微生物），具有自發(fā)裂解、誘導(dǎo)、免疫性、復(fù)愈、溶源轉(zhuǎn)變等特性。檢驗方法是將適量發(fā)酵液與大量的敏感性指示菌（遇溶源菌裂解后所釋放的溫和噬菌體會發(fā)生裂解性生活周期者）相混合，然后加至瓊脂培養(yǎng)基中倒一平板。過一段時間后溶源菌就長成菌落。由于在溶源菌

9、分裂過程中有極少數(shù)個體會發(fā)生自發(fā)裂解，其釋放的噬菌體可不斷侵染溶源菌菌落周圍的指示菌菌苔，所以會產(chǎn)生一個個中央有溶源菌小菌落、四周有透明圈的特殊噬菌斑。農(nóng)桿菌農(nóng)桿菌LBA4404LBA4404的轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化 凍融法凍融法1)1)將將1l1l構(gòu)建好的植物表達載體質(zhì)粒加入到構(gòu)建好的植物表達載體質(zhì)粒加入到100 l100 l農(nóng)桿菌感農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰上放置受態(tài)細胞中，輕輕混勻，冰上放置30min30min；2)2)于液氮中速凍于液氮中速凍2-3min2-3min，3737溫浴溫浴3min3min；3)3)加入加入500l 500l 無抗生素的無抗生素的YEPYEP液體培養(yǎng)基，液體培養(yǎng)基，

10、2828輕搖輕搖2 24h4h，消除感受態(tài)；消除感受態(tài)；4)4)從該培養(yǎng)物中取從該培養(yǎng)物中取5050200l200l菌液均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的菌液均勻涂布于含適當(dāng)抗生素的YEPYEP選擇平板（選擇平板（Rif R , Str R ,Km RRif R , Str R ,Km R）上，）上，2828倒置培養(yǎng)兩天。倒置培養(yǎng)兩天。上述為小胖同學(xué)做農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟，為什么在第二步中他要放上述為小胖同學(xué)做農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化步驟，為什么在第二步中他要放入液氮中速凍入液氮中速凍2-3min2-3min呢？呢？答：與大腸桿菌轉(zhuǎn)化時熱激原理相同，為轉(zhuǎn)化反應(yīng)提供一個低溫環(huán)境，使轉(zhuǎn)化效率更高。為什么外源為什么外源DNADN

11、A難以轉(zhuǎn)化野生型的微生物難以轉(zhuǎn)化野生型的微生物受體細胞？受體細胞？答：野生型細菌有針對外源DNA的限制和修飾系統(tǒng)，外源DNA會被識別，從而被降解，要選擇限制系統(tǒng)缺陷型的受體細胞（限制缺陷型）；外源基因克隆、擴增以及表達是建立在DNA重組分子自主復(fù)制的基礎(chǔ)上的，受體細胞必須選擇體內(nèi)同源重組缺陷型的受體細胞（重組缺陷型）；用于基因工程的受體細胞必須對重組DNA分子具有較高的可轉(zhuǎn)化性，利用遺傳誘變技術(shù)改變受體細胞壁的通透性，從而提高其轉(zhuǎn)化率（轉(zhuǎn)化親和型）什么叫微生物農(nóng)藥？什么叫微生物農(nóng)藥？微生物農(nóng)藥（microbial pesticide）包括農(nóng)用抗生素和活體微生物農(nóng)藥。為利用微生物或其代謝產(chǎn)物來防治危害農(nóng)作物的病、蟲、草、鼠害及促進作物生長。它包括以菌治蟲、以菌治菌、以菌除草等。這類農(nóng)藥具有選擇性強，對人、畜、農(nóng)作物和自然環(huán)境安全，不傷害天敵，不易產(chǎn)生抗性等特點。這些微生物農(nóng)藥包括細菌、真菌、病毒或其代謝物，例如蘇云金桿菌、白僵菌、核多角體病毒、井岡霉素、C型肉毒梭菌外毒素等。隨著人們對環(huán)境保護越來越高的要求，微生物農(nóng)藥無疑是今后農(nóng)藥的發(fā)展方向之一。近幾年，人體微生物在癌癥治療領(lǐng)域的研究逐漸近幾年，人體微生物在癌癥治療領(lǐng)域的研究逐漸興起。微生物可以通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境、預(yù)測癌興起。微生物可以通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境、預(yù)測癌癥風(fēng)險、引發(fā)癌癥刺激免疫