神經(jīng)導管修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損實驗研究

1、神經(jīng)導管修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損實驗研究                            作者：張鳳久 趙志英 劉啟 黃麗華 【摘要】  目的：采用一種自行研制的具有良好生物相容性的殼聚糖構建人工神經(jīng)來修復大鼠坐骨神經(jīng)缺損,研究證實其修復效果。方法：選用30只健康雄性Wistar大鼠,隨機分為正常對照組（A

2、組）、原位神經(jīng)移植組（B組）、殼聚糖神經(jīng)導管橋接組（C組)3組，分別切斷坐骨神經(jīng)后做相應處理，12周后進行神經(jīng)電生理檢測。結果：C組12周后神經(jīng)已經(jīng)長過缺損段,神經(jīng)傳導功能恢復。結論：這種套管能夠有效的橋接10 mm長的大鼠坐骨神經(jīng)缺損，可應用于周圍神經(jīng)缺損的，同時可以作為進一步開發(fā)組織工程化的人工神經(jīng)的良好載體。 【關鍵詞】  神經(jīng)導管；周圍神經(jīng)；缺損；殼聚糖    Abstract  Objective: Using a self-developed chitosan with good biocompatibility to build

3、artificial nerves to repair defects in rat's sciatic nerve and a study was made to confirm the repair effect.  Methods: 30 healthy male Wistar rats were randomly divided into 3 groups (A: normal control group, B: in situ nerve graft group, C: Artificial neural bridge group). Sciatic nerve w

4、ere cut off with the deal accordingly, 12 weeks later, the nerve electrophysiological testing was performed.  Results:12 weeks later,  the nerve has been a long paragraph defect, the function of nerve conduction recovered. Conclusion: This casing can  effectively bridge the Sciatic Ne

5、rve defect of 10mm in rats  and can be used in the treatment of peripheral nerve defects. At the same time it can serve as a good carrier for the further development of tissue-engineered artificial nerves.    Key words  Nerve conduit; Peripheral nerve; Defect; Chitosan 

6、   周圍神經(jīng)損傷在臨床中非常多見,在很多情況下,易導致長期且嚴重的功能障礙。目前臨床上最常見的治療方法是自體皮神經(jīng)移植。但是,由于自體供移植的神經(jīng)來源有限及供區(qū)的失神經(jīng)損害,其應用受到很大限制。為解決周圍神經(jīng)缺損這一難題,人們曾先后嘗試使用包括靜脈、去除內(nèi)膜的靜脈、動脈、肌肉、膠原等為代表的生物性材料1-2以及硅膠、聚四氟乙烯、多聚乳酸/聚己內(nèi)酰酮復合物、甲殼素、多聚左旋乳酸、聚乙醇酸等非生物性材料制成的神經(jīng)導管3-6替代自體神經(jīng)移植物，但均未取得令人滿意的效果。我們采用一種自行開發(fā)的、具有良好生物相容性的殼聚糖構建人工神經(jīng)導管來修復大鼠坐骨神經(jīng)10 mm長的缺損,并通過

7、電生理檢查，與大鼠自體神經(jīng)移植比較研究其修復效果。1  材料與方法1.1  殼聚糖導管的制備 取6 g殼聚糖粉，放入燒杯內(nèi)，用量杯導入蒸餾水到100 mL，滴入冰醋酸2 mL，輕攪拌幾下后放置0.5 h后再次攪拌，再放0.5 h，再攪拌，如此數(shù)次，直到完全溶解，放置1 d后待用，以便除去內(nèi)部氣泡,此時溶液呈現(xiàn)金黃色，溶膠膠狀，均勻粘著。將硬塑料管浸入溶膠，迅速取出垂直放入-80 冰箱中冷凍過夜，然后放入冷凍干燥機中(ALPHA-1-4,Martin Christ公司,德國)干燥。接著，將干燥完全的殼聚糖導管脫模，浸入75 %酒精中脫酸，最后將導管用三蒸水洗，干燥后

8、即成為殼聚糖導管，長4 cm，內(nèi)徑1.5 mm，管壁厚0.2 mm，見圖1。殼聚糖本身分布均勻，質(zhì)地韌，有一定黏性。厚度與濃度有一定正向關系。采用以下方法滅菌：先加入75 %(v/v)的乙醇浸泡30 min，然后加入無菌的PBS液洗滌3次。1.2  動物分組與橋接手術選用  30只Wistar大鼠(內(nèi)蒙古大學動物實驗中心提供)雌雄不拘，200250 g,隨機分為正常對照組（A組）、原位神經(jīng)移植組（B組）、殼聚糖神經(jīng)導管橋接組（C組)3組，采用10 %水合氯醛(3 mL/kg體重)腹腔注射麻醉。A組只暴露雙側坐骨神經(jīng)；B組在坐骨神經(jīng)分叉處上方5 mm以及10 mm處切斷坐骨神

9、經(jīng)(兩側斷端回縮后缺損約10 mm作為神經(jīng)缺損模型),并分別原位用9-0尼龍線3針外膜縫合。C組在坐骨神經(jīng)分叉處上方5 mm以及10 mm處切斷坐骨神經(jīng),移除神經(jīng)游離段，采用長12.0 mm、內(nèi)徑1.5 mm的人工神經(jīng)橋接神經(jīng)缺損,兩端分別套入2 mm,9-0尼龍線34針固定，見圖2。1.3  電生理檢測 術后12周,同上法麻醉大鼠并固定后,游離雙側坐骨神經(jīng),采用成都泰盟科技有限公司BL-420F電生理儀檢測。刺激電極先后置于移植物或吻合處的遠近端,記錄電極置于腓腸肌中段,電極置于肌肉。方波、恒壓3.0 V刺激、波寬0.1 ms、10 Hz,記錄肌肉復合動作電位、運動神經(jīng)傳

10、導速度。1.4  組織學檢測 術后12周取各組動物坐骨神經(jīng)的橋接部分，經(jīng)4 %多聚甲醛固定、石蠟包埋后行縱切面H-E染色，光鏡觀察再生神經(jīng)纖維生長情況。1.5  統(tǒng)計學方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進行分析,實驗數(shù)據(jù)以x±s表示。組間比較采用計量資料的t檢驗,P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2  結果2.1  大體觀察 術后B、C組動物均行動困難,后肢拖曳行走,針扎足底均無痛覺反應。術后1周,大鼠的后肢功能無恢復,足底水腫。術后2周,B、C組大鼠均出現(xiàn)不同程度的足部潰瘍,以C組為重。術后8周,B組大鼠6只足部潰

11、瘍已愈合,2只殘存潰瘍；C組大鼠足部潰瘍大部分愈合,1只足部潰瘍加重,足趾潰爛。術后12周,B、C各組雙側肢體足部潰瘍已經(jīng)基本恢復。暴露坐骨神經(jīng)后發(fā)現(xiàn),導管結構完整,周圍沒有明顯炎癥反應,亦未見神經(jīng)瘤形成。1         2.2  電生理檢查 12周后A、B組雙側坐骨神經(jīng)以及C組遠近端均能誘發(fā)肌肉的復合動作電位,將有效數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,首先進行組內(nèi)以及組間方差齊性檢驗,各組之間方差平齊(P0.05),因此進行單因素方差分析。結果A組與B、C各組之間最大神經(jīng)傳導速度和最大波幅比較差異均有統(tǒng)計學

12、意義(P0.05)，B、C兩組之間差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表1。表1  術后12周各組最大神經(jīng)傳導速度和最大波幅(略)2.3  組織學檢測 術后12周再生神經(jīng)H-E染色顯示，B、C組大鼠的再生神經(jīng)均已從近端長入遠端，施萬細胞增生明顯。B組的再生神經(jīng)纖維密集，排列整齊；C組再生神經(jīng)纖維較稀疏，有結締組織增生。見圖3。3  討論    組織工程學的為解決周圍神經(jīng)缺損這一難題提供了機會,但組織工程對支架材料有著較高的要求,如生物可降解性、組織相容性、無不良反應、來源廣泛等。綜合比較分析上述各種神經(jīng)導管,甲殼素、殼

13、聚糖可能是較為理想的組織工程材料。殼聚糖為甲殼素脫乙?；?溶解性明顯高于天然甲殼素,較易加工成形,也已被研究用于制作多種醫(yī)學生物材料。我們采用殼聚糖構建人工周圍神經(jīng)。前期研究已經(jīng)證實殼聚糖具有良好的生物相容性7-8,而且其物理性質(zhì)以及吸收周期可以調(diào)節(jié)控制。殼聚糖導管在大鼠體內(nèi)逐步降解,在神經(jīng)修復的早期能夠提供支架以及導向作用,并形成局部相對穩(wěn)定的再生微環(huán)境；在神經(jīng)再生的晚期逐漸吸收降解,并能夠根據(jù)需要來控制其吸收周期。    周圍神經(jīng)損傷后,功能是否恢復是判斷神經(jīng)再生效果的關鍵。神經(jīng)的傳導性是周圍神經(jīng)的基本功能,且神經(jīng)干電活動的傳導速度能直接反映神經(jīng)的傳導性。

14、周圍神經(jīng)離斷后,神經(jīng)傳導性消失,因此神經(jīng)傳導功能可作為判斷神經(jīng)損傷和修復的一項可靠指標。本研究發(fā)現(xiàn)，術后12周神經(jīng)肌肉復合動作電位的產(chǎn)生，說明再生的神經(jīng)纖維已經(jīng)長過缺損段,神經(jīng)傳導功能已經(jīng)恢復，表明這種導管能夠有效地橋接10 mm以內(nèi)的大鼠坐骨神經(jīng)缺損,同時經(jīng)過統(tǒng)計學分析以及電生理結果提示對于10 mm缺損,此種人工神經(jīng)的修復效果與自體神經(jīng)移植類似,可以替代自體神經(jīng)移植。    我們開發(fā)的這種神經(jīng)導管已經(jīng)證實其修復效果，同時,體外培養(yǎng)結果表明這種導管能使施萬細胞粘附于其上生長9,因此它可以作為進一步開發(fā)組織工程化的人工神經(jīng)的良好載體,我們將進一步通過在導管內(nèi)添加雪

15、旺細胞和神經(jīng)營養(yǎng)因子來改善神經(jīng)修復效果,以期尋找到一種更為有效的神經(jīng)移植代用品?！尽?#160; 1 廖文,劉淑紅,劉紅,等.自體成肌細胞修復周圍神經(jīng)缺損J.臨床康復,2006,10（33）:23-26.2 Barcelos AS,Rodrigues AC,Silva MD,et al.Inside-out vein graft and inside-out artery graft in rat sciatic nerve repairJ.Microsurgery，2003,23:66-71.3 張勇杰,金巖,聶鑫,等.組織工程周圍神經(jīng)修復坐骨神經(jīng)缺損應用研究J.中華神經(jīng)外科疾病研究雜志，2

16、004，3（2）：141-144.4 Wang XD,Hu W,Cao Y,et al.Dog sciatic nerve regeneration across a 30mm defect bridged by a chitosan/PGA artificial nerve graftJ.Brain,2005,128(8):1897-1910.5 Bini TB,Gao SJ,Xu XY,et al.Peripheral nerve regeneration by microbraided poly ( L-lactide-co-glycolide ) biodegradable polymer fibersJ.J Biomed Mater Res A,2004,68(2):286-295.6 Stang F,FansaH,Wolf G,et al.Structural parameters of collagen nerve grafts influence peri