第十七章 PCR基因擴(kuò)增儀習(xí)題

1、第十七章 PCR基因擴(kuò)增儀習(xí)題參考答案一、名詞解釋1PCR技術(shù)：通過(guò)加熱使雙鏈DNA解開(kāi)螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)上述過(guò)程至25-40個(gè)循環(huán)，達(dá)到體外擴(kuò)增核酸序列的目的。2TaqDNA聚合酶：一種從嗜熱水生菌（Thermus aquaticus）分離得到的熱穩(wěn)定DNA依賴(lài)的DNA聚合酶。3水浴鍋PCR基因擴(kuò)增儀：屬于第一代PCR基因擴(kuò)增儀，以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個(gè)控溫體系。4壓縮機(jī)PCR基因擴(kuò)增儀：屬于第二代PCR基因擴(kuò)增儀，由壓縮機(jī)自動(dòng)控溫，金屬導(dǎo)熱。5Overshooting：指升溫過(guò)

2、程中，由于一些加熱元件，比如半導(dǎo)體、金屬塊本身會(huì)積蓄能量，雖然溫度探頭探測(cè)到溫度到達(dá)了設(shè)定溫度，但半導(dǎo)體、金屬塊上積蓄的能量仍然會(huì)傳給PCR體系，造成實(shí)際的溫度高于設(shè)定的溫度。6Undershooting：在降溫過(guò)程中出現(xiàn)一個(gè)降溫慣性，從而造成實(shí)際溫度會(huì)短時(shí)間的低于設(shè)定的溫度。7半導(dǎo)體PCR基因擴(kuò)增儀：屬于第三代PCR基因擴(kuò)增儀，由半導(dǎo)體自動(dòng)控溫，金屬導(dǎo)熱。8離心式空氣加熱PCR基因擴(kuò)增儀：屬于第三代PCR基因擴(kuò)增儀，由金屬線(xiàn)圈加熱，采用空氣作為導(dǎo)熱媒介。9梯度PCR儀：帶梯度PCR功能的基因擴(kuò)增儀，在反應(yīng)過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合

3、的反應(yīng)條件。10原位PCR儀：帶原位擴(kuò)增功能的基因擴(kuò)增儀。11原位PCR技術(shù)：即在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，組織細(xì)胞的形態(tài)不被破壞，是原位雜交與PCR技術(shù)結(jié)合而形成的新技術(shù)。12熒光實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析。13位置的邊緣效應(yīng)：指PCR基因擴(kuò)增儀最外周的樣品孔溫度與中間的樣品孔有差異，不均一，從而導(dǎo)致外周樣品孔的PCR擴(kuò)增效率不佳，該效應(yīng)稱(chēng)為“位置的邊緣效應(yīng)”。14模塊溫控模式：儀器根據(jù)探測(cè)器直接探測(cè)承載樣品金屬基座的溫度進(jìn)行控制，該模式適用于長(zhǎng)時(shí)間的靜態(tài)孵育，如連接、酶切

4、、去磷酸化等。15反應(yīng)管溫控模式：儀器根據(jù)探測(cè)器所探測(cè)到的溫控模塊的溫度由計(jì)算機(jī)計(jì)算出樣品管內(nèi)或PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來(lái)進(jìn)行控制。二、選擇題【A型題】1D 2A 3B 4C 5C 6E 7B 8C 9A 10B 11D 12A 13C 14C 15C 16D 17D 18B 19A 20B 21C 22E 23A 【X型題】1BCD 2AC 3CD 4BC 5ADE 6ADE 7BCD 8AE 9ABD 10BC 11ABE 三、簡(jiǎn)答題1什么是聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）技術(shù)？答：PCR技術(shù)的本質(zhì)是核酸擴(kuò)增技術(shù)，通過(guò)加熱使雙鏈DNA解開(kāi)螺旋，在退火溫度條件下引物同模板DNA雜交，在Taq DNA聚

5、合酶，dNTPs，Mg2+和合適pH緩沖液存在條件下延伸引物，重復(fù)上述“變性退火引物延伸”過(guò)程至25-40個(gè)循環(huán)，呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)大待測(cè)樣本中的核酸拷貝數(shù)，可以在體外對(duì)目的核酸進(jìn)行大量復(fù)制。2PCR基因擴(kuò)增儀的工作關(guān)鍵是什么？經(jīng)歷了怎樣一個(gè)發(fā)展過(guò)程？答：PCR基因擴(kuò)增儀工作關(guān)鍵是溫度控制。其發(fā)展過(guò)程為：水浴鍋PCR儀屬于第一代PCR基因擴(kuò)增儀，以不同溫度的水浴鍋串聯(lián)成一個(gè)控溫體系；壓縮機(jī)PCR儀屬于第二代PCR基因擴(kuò)增儀，由壓縮機(jī)自動(dòng)控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫較第一代PCR基因擴(kuò)增儀方便；半導(dǎo)體PCR儀屬于第三代PCR基因擴(kuò)增儀，由半導(dǎo)體自動(dòng)控溫，金屬導(dǎo)熱，控溫方便，體積小，相對(duì)穩(wěn)定性好；離心式空氣加熱P

6、CR儀屬于第三代PCR基因擴(kuò)增儀，由金屬線(xiàn)圈加熱，采用空氣作為導(dǎo)熱媒介，溫度均一性好，各孔擴(kuò)增效率高度一致。3PCR基因擴(kuò)增儀按照變溫方式的不同可分哪幾類(lèi)？分別有什么特點(diǎn)。答：PCR基因擴(kuò)增儀按照變溫方式通常有以下三類(lèi)：（1）水浴式PCR儀：變溫快、時(shí)間準(zhǔn)、溫度均一，但體積大，自動(dòng)化程度不高。（2）變溫金屬塊式PCR儀：通過(guò)半導(dǎo)體加熱和冷卻，并由微機(jī)控制恒溫和冷熱處理過(guò)程。裝置比較牢固耐用，溫度變換平穩(wěn)，有利于保持Taq DNA聚合酶的活性。（3）變溫氣流式PCR儀：以空氣作為熱傳播媒介，由大功率風(fēng)扇及制冷設(shè)備提供外部冷空氣而制冷。成本較低；安全程度高。微機(jī)配上軟件，可靈活編程。4什么是梯度P

7、CR儀？它有什么優(yōu)點(diǎn)？答：梯度PCR儀是由普通PCR儀衍生出的帶梯度PCR功能的基因擴(kuò)增儀。在反應(yīng)過(guò)程中每個(gè)孔的溫度控制條件可以在指定范圍內(nèi)按照梯度變化，根據(jù)結(jié)果，一步就可以摸索出最適合的反應(yīng)條件。使用梯度PCR儀，多次實(shí)驗(yàn)可在一臺(tái)儀器上完成，既節(jié)省實(shí)驗(yàn)時(shí)間，提高實(shí)驗(yàn)效率，又節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。5何謂熒光實(shí)時(shí)定量PCR（RQ-PCR）技術(shù)？答：熒光實(shí)時(shí)定量PCR（real-time quantitative PCR,RQ-PCR）技術(shù)即在PCR反應(yīng)體系中加入特異性的熒光染料或探針，熒光信號(hào)的變化真實(shí)的反映了體系中模板的增加，通過(guò)檢測(cè)熒光信號(hào)，從而實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)對(duì)未知模板

8、進(jìn)行定量分析。6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀有哪些種類(lèi)，各有什么特點(diǎn)？答：目前市場(chǎng)上實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀一般可分三類(lèi)。（1）金屬板式實(shí)時(shí)定量PCR儀：可容納的樣本量大，無(wú)需特殊耗材，但溫度均一性欠佳，有邊緣效應(yīng)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的反應(yīng)條件難以做到與樣品完全一致。（2）離心式實(shí)時(shí)定量PCR儀：能保障標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和樣品之間反應(yīng)條件的一致性。但可容納樣品量少，有的需用特殊毛細(xì)管作樣品管，增加了使用成本。（3）各孔獨(dú)立控溫的定量PCR儀：各孔獨(dú)立控溫，適合多指標(biāo)快速檢測(cè)。但是上樣不如傳統(tǒng)方法方便，而且需要獨(dú)特的扁平反應(yīng)管，使用成本較高。7PCR基因擴(kuò)增儀的溫度控制包括哪些方面？答：PCR基因擴(kuò)增儀的溫度控制是決定PCR反

9、應(yīng)能否成功的關(guān)鍵，主要包括溫度的準(zhǔn)確性、均一性以及升降溫速度等方面。（1）溫度的準(zhǔn)確性是指樣品孔溫度與設(shè)定溫度的一致性；（2）溫度的均一性是指樣品孔間的溫度差異，關(guān)系到不同樣品孔之間反應(yīng)結(jié)果的一致性；（3）升降溫的速度：升降溫速度快，可以縮短反應(yīng)進(jìn)行的時(shí)間，提高工作效率，并提高PCR反應(yīng)特異性。對(duì)梯度PCR儀來(lái)說(shuō)，除此以外，還必須考慮儀器在梯度模式和標(biāo)準(zhǔn)模式下是否具有同樣的溫度特性。8為什么反應(yīng)管溫控比模塊溫控更準(zhǔn)確？答：反應(yīng)管溫控模式下，儀器根據(jù)探測(cè)器所探測(cè)到的溫控模塊的溫度由計(jì)算機(jī)計(jì)算出樣品管內(nèi)或PCR板孔內(nèi)樣品液的溫度來(lái)進(jìn)行控制。由于精確的算法能自動(dòng)補(bǔ)償時(shí)間，確保反應(yīng)混合物按照程序設(shè)定的

10、時(shí)間維持預(yù)設(shè)溫度，所以準(zhǔn)確度更高。9實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀的熒光檢測(cè)系統(tǒng)主要由哪兩部分組成？答：實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增儀的熒光檢測(cè)系統(tǒng)主要包括激發(fā)光源和檢測(cè)器。（1）激發(fā)光源：一般為鹵鎢燈光源或發(fā)光二極管（LED）光源。（2）檢測(cè)器：常用的是超低溫CCD成像系統(tǒng)和光電倍增管（PMT）。10PCR擴(kuò)增儀的熱蓋有什么作用？使用時(shí)應(yīng)注意什么？答：目前PCR儀通常都配備熱蓋，可使樣品管頂部溫度達(dá)到150左右，避免蒸發(fā)的反應(yīng)液凝集于管蓋而改變PCR反應(yīng)體積。無(wú)需加石蠟油，減少了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的麻煩。旋轉(zhuǎn)加壓的熱蓋需注意旋轉(zhuǎn)壓力的控制，過(guò)松則使熱蓋沒(méi)有充分接觸反應(yīng)管而影響結(jié)果；過(guò)緊則會(huì)導(dǎo)致反應(yīng)管變形，甚至可能

11、造成熱蓋的機(jī)械故障。11簡(jiǎn)述PCR擴(kuò)增儀的操作規(guī)程。答：普通PCR擴(kuò)增儀的操作通常為打開(kāi)電源，儀器自檢，設(shè)置溫度程序或調(diào)出儲(chǔ)存的程序，運(yùn)行即可。定量PCR擴(kuò)增儀的操作一般都是先打開(kāi)PCR儀電源，再打開(kāi)相連電腦中的相應(yīng)軟件，分別設(shè)置溫度程序、采集通道，并可根據(jù)不同儀器的要求進(jìn)行一些特殊設(shè)置，在儀器中放好PCR管，蓋好儀器，運(yùn)行設(shè)置好的反應(yīng)程序。關(guān)機(jī)時(shí)通常先關(guān)軟件，再關(guān)PCR儀，最后關(guān)電腦。12定量PCR擴(kuò)增儀常見(jiàn)故障有哪些，如何解決？答：定量PCR擴(kuò)增儀常見(jiàn)故障及解決方法為：（1）熒光染料污染樣品孔，解決方法是請(qǐng)工程師清潔樣品孔；（2）PCR管融化，原因可能是溫度傳感器出問(wèn)題或是熱蓋出問(wèn)題，需工程師檢修；（3）個(gè)別孔擴(kuò)增效率差異很大，需工程師檢修；（4）熒光強(qiáng)度減弱或不穩(wěn)定。需更換光源；或需工程師調(diào)試檢修；（5）儀器工作時(shí)噪音不正常，可自行檢查PCR管是否放好；或請(qǐng)工程師檢修；（6）儀器采集熒光時(shí)噪音不正常。需工程師檢修，