產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選及鑒定

1、產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選及鑒定摘 要：采用瓊脂平板擴散實驗，從湖南傳統(tǒng)發(fā)酵臘肉和香腸中篩選出3株對單核增生李斯特菌（Listeria monocytogene54002）具有明顯抑制作用的乳酸菌，排除酸和過氧化氫的干擾后，仍具有抑菌活性，而用胰蛋白酶和胃蛋白酶處理以后，其抑菌活性消失，因此確定該抑菌物質(zhì)為蛋白質(zhì)類物質(zhì)，即細菌素。三株菌所產(chǎn)細菌素具有一定熱穩(wěn)定性，在pH510之間仍具有一定的抑菌活性。通過生理生化實驗和16S rRNA基因序列分析對3株菌進行了鑒定。PCR擴增得到1600bp左右的16S rRNA基因序列，將序列通過BLAST軟件在NCBI網(wǎng)站上進行同源性對比，并通過MEGA5.0軟

2、件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。結(jié)果顯示3株菌的16S rRNA序列和數(shù)據(jù)庫中的屎腸球菌的序列同源性均在99%以上，這與生理生化實驗初步鑒定結(jié)果一致。關(guān)鍵詞：細菌素，篩選，屎腸球菌Identification and screenging of bacteriocin-producing lactic acid bacteriaAbstract：Three lactic acid bacterium were isolated from Hunan traditonal fermented meats，which exhibitedstrong inhibitory activity against Lis

3、teria monocytogenes 54002. After eliminating the interference factors suchas the organic acids，hydrogen peroxides，the inhibitory activity still existed. But inhibitory activity was lost aftertreatment with trypsin and pepsin. Therefore，the inhibiotory substance could be classed as bacteriocin. Theba

4、cteriocin exhibited good thermal stability and its active pH range from 510. The three bacteriocin-producingbacteria were identified on the base of physiological and biochemical characteristics and 16S rRNA genesequence. The sequence fragments around 1600bp 16S ribosomal RNA were amplified from tota

5、l DNA of thethree isolated strains by PCR. The sequence was completed by the application of BLAST on the websites ofNCBI and phylogenetic tree was drawn with MEGA5.0. According to the high homology of 16S rRNA sequence，the three bacteriocin-producing bacteria was identified as Enterococcus faecium.K

6、ey words：bacteriocin；screening；Enterococcus faecium細菌素是由某些細菌產(chǎn)生的一類抑菌物質(zhì)，是由細菌在代謝過程中通過核糖體合成機制產(chǎn)生的一類多肽類物質(zhì)1。細菌素的抑菌范圍一般包括一些親緣關(guān)系相近的細菌，而產(chǎn)生菌對其細菌素具有自身免疫性。目前研究最為深入的細菌素是乳酸鏈球菌肽（Nisin），又稱乳酸鏈球菌素，是由乳酸鏈球菌產(chǎn)生的一種多肽，它于1969年得到FAO和WHO的認可，是唯一允許作為防腐劑在食品中使用的細菌素，雖然細菌素已被許多國家允許作為食品添加劑放入食品中，但是也存在很大的缺陷，比如抑菌譜較窄，抑菌活性在堿性條件下不穩(wěn)定2等，尋找高產(chǎn)細

7、菌素以及更穩(wěn)定的細菌素成為研究的熱點。作為細菌素的主要產(chǎn)生菌，乳酸菌生境廣泛，數(shù)量眾多。近年來，國內(nèi)外學(xué)者為獲得結(jié)構(gòu)新穎、抑菌活性更為穩(wěn)定的細菌素，廣泛地從當?shù)貍鹘y(tǒng)的發(fā)酵食品中，尤其是發(fā)酵肉制品中進行產(chǎn)細菌素乳酸菌的分離篩選。如deCarvalho從意大利salami香腸中3分離到一株能抑制李斯特氏菌的乳酸菌，Noonpakdee4從泰國傳統(tǒng)發(fā)酵香腸nham 中分離到一株產(chǎn) Nisin 的乳酸乳球菌；Martinis5從巴西傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中共分離得到三株產(chǎn)細菌素乳酸菌，抑菌結(jié)果顯示，三株菌都具有較強的抑制李斯特氏菌能力；Todorov6從葡萄牙傳統(tǒng)發(fā)酵豬肉制品中分離到兩株產(chǎn)細菌素的植物乳桿菌，

8、而212生 物 工 程2013年第20期Vol . 34 , No . 20 , 2013菌株 發(fā)酵原液 調(diào)pH調(diào)pH+過氧化氫酶TRS5 13.1 13.0 12.7TRS6 12.7 10.7 10.5HY07 13.7 12.7 11.6表1篩選菌株的抑菌作用（mm）Table 1 Inhibitory activity of the three isolated strains（mm）我國學(xué)者則多從四川臘肉香腸7、宣威火腿8、泡菜9-11、傳統(tǒng)乳制品12-13等發(fā)酵食品中分離得到產(chǎn)細菌素的乳酸菌。本研究旨在從我省傳統(tǒng)的自然發(fā)酵肉制品中（如臘肉、香腸）分離篩選產(chǎn)細菌素的乳酸菌菌株，對充分

9、挖掘本地傳統(tǒng)發(fā)酵食品中的乳酸菌資源具有一定的理論和實踐意義。本文報道了來源于發(fā)酵肉制品中的三株產(chǎn)細菌素的乳酸菌-屎腸球菌的分離和鑒定結(jié)果。1 材料與方法1.1 材料與儀器臘肉、香腸 市售；單增李斯特菌54002、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌 為本實驗室保藏菌種；MRS培養(yǎng)基 胰蛋白胨10.0g、牛肉膏10.0g、酵母浸粉5.0g、檸檬酸三銨2.0g、葡萄糖20.0g、吐溫-801.0mL、乙酸鈉5.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.5g、硫酸錳0.25g、瓊脂15.0g、水1L、pH=6.07.0；BHI培養(yǎng)基 胰蛋白胨17.0g、大豆胨3.0g、酵母浸粉6.0g、氯化鈉5.0g、

10、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g、瓊脂7.5g、水1L。DNP-9272BS-型生化培養(yǎng)箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；SW-CJ-1FD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設(shè)備有限公司；普光HH-8型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海浦東物理光學(xué)儀器廠；LDZX-50FBS型立式壓力蒸汽滅菌器 上海申安醫(yī)療器械廠；TGL-20M型離心機 長沙英泰儀器有限公司；雷磁pHs-3C型pH計 上海精科。1.2 實驗方法1.2.1 初篩1.2.1.1 單核增生李斯特菌菌液制備 將活化過夜的單增李斯特菌按2%接種至BHI培養(yǎng)基中，37培養(yǎng)至穩(wěn)定期，備用。1.2.1.2 產(chǎn)細菌素乳酸菌的初篩 將市售的湖南傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品稱

11、取25g，切碎放置于225mL無菌生理鹽水中，搖勻，制備系列稀釋溶液，選取合適稀釋度的稀釋液，移取0.1mL涂布于MRS固體平皿中，培養(yǎng)（242）h。將單增李斯特菌菌液0.1mL與100mL溶化后并保持在50左右的BHI半固體培養(yǎng)基進行混合，混勻后輕輕倒在長有乳酸菌菌落的MRS培養(yǎng)基上層，待培養(yǎng)基凝固后將平板繼續(xù)培養(yǎng)20h，選取有抑菌圈的菌株，進行菌落的挑取，在MRS培養(yǎng)基平板上劃線純化、保存。1.2.2 復(fù)篩1.2.2.1 瓊脂擴散法 參考OConnor和岳喜慶的方法14-15。將單核增生李斯特菌菌液0.1mL與100mL溶化后并保持在50左右的BHI固體培養(yǎng)基進行混合，傾注平板，待培養(yǎng)基凝

12、固后輕輕放置無菌牛津杯，在牛津杯中加入0.2mL乳酸菌培養(yǎng)液，37培養(yǎng)12h，觀察抑菌圈大小，用測量尺測量抑菌圈直徑。1.2.2.2 有機酸的排除 將純化后的菌株在液體MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)24h，用1mol/L NaOH將培養(yǎng)液的pH調(diào)至6.006.50，1000g 10min離心，取上清液，采用瓊脂擴散法觀察能否產(chǎn)生抑菌圈。1.2.2.3排除過氧化氫的干擾 參考姚麗婭的方法16。將過氧化氫酶溶解于50mmol/L的磷酸鹽緩沖液（pH=7）中，將過氧化氫酶加入以調(diào)pH至7左右的發(fā)酵上清液當中，使終濃度為50mg/L，在37水浴鍋中溫浴2h，然后用瓊脂擴散法觀察加入過氧化氫酶后有無抑菌圈出現(xiàn)。1.

13、2.3抑菌物質(zhì)的初步鑒定 將胃蛋白酶和胰蛋白酶分別溶解于pH=3和pH=6磷酸鹽緩沖液中，加入已經(jīng)調(diào)好相應(yīng)pH的發(fā)酵上清液中，使酶的終濃度為0.5mg/L，37溫浴2h，然后再將處理后的發(fā)酵液上清pH調(diào)至67，做相應(yīng)處理但未加酶的進行對照17。瓊脂擴散法比較抑菌圈的大小。1.2.4 細菌素穩(wěn)定性研究 參考劉國榮的方法181.2.4.1 熱穩(wěn)定性 將活化后的乳酸菌菌液按接種量1%接種至MRS培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h，離心后取上清液，調(diào)節(jié)pH=6，分別取一定量的上清液于40、60、80、100、120條件下處理20min，待冷卻至室溫后，瓊脂擴散法進行抑菌實驗，和未處理的進行比較。1.2.4.2 酸穩(wěn)

14、定性 將活化后的乳酸菌菌液按接種量1%接種至MRS培養(yǎng)液中，培養(yǎng)24h，離心后取上清液，分別取適量上清液，將pH分別調(diào)至5、6、7、8、9、10，以及原液進行抑菌性，觀察抑菌效果有無差別。1.2.5 產(chǎn)細菌素菌株的鑒定1.2.5.1 菌落形態(tài)及生理生化實驗 革蘭氏染色后進行顯微鏡下細胞形態(tài)的觀察。生理生化實驗包括：產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗、精氨酸產(chǎn)氨實驗、淀粉水解實驗、明膠液化實驗、硫化氫實驗等。1.2.5.2 16S rRNA序列鑒定 乳酸菌基因組DNA的提取按照天根生化科技有限（北京）有限公司細菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。16S rRNA基因序列PCR擴增引物分別為：正向引物27F：5-AGA

15、GTTTGATCCTGGCTCAG-3；反向引物 1541R：5-AAGGAGGTGATCCAGCC-3。引物的合成和PCR產(chǎn)物的測序由華大基因完成。PCR反應(yīng)條件：95預(yù)變性5min，94變性30s，55復(fù)性30s，72延伸1min 30s，30次循環(huán)，最后72延伸10min。測定后的16S rRNA基因序列登陸NCBI進行BLAST比對，并利用MEGA 5.0軟件進行進化樹的構(gòu)建。2 結(jié)果與討論2.1 產(chǎn)細菌素乳酸菌的篩選利用雙層瓊脂的方法，共從市售的湘味臘肉和香腸中初篩出8株具有抑菌作用的菌株。2.1.1 有機酸和過氧化氫的排除 將培養(yǎng)過夜后的乳酸菌上清液，用1mol/L NaOH將上清

16、液pH調(diào)整到6.0左右，有三株菌的上清液仍具有抑菌活性，說明發(fā)酵上清液的抑菌效果不是由有機酸引起的。在用過氧化213Science and Technology of Food Industry生 物 工 程2013年第20期圖2 細菌素在pH下的穩(wěn)定性Fig.2 pH sensitivity of bacteriocinpH對照 5 6 7 8 9 1014121086420抑菌圈直徑（mm）TRS5TRS6HY07氫酶處理發(fā)酵上清液后，抑菌效果也未見明顯變化，由此排除過氧化氫的影響。發(fā)酵上清液中存在其他的抑菌活性物質(zhì)（見表1）。將其上清液經(jīng)過胃蛋白酶和胰蛋白酶酶處理后（見表2），抑菌效果消

17、失，證明抑菌物質(zhì)為蛋白類物質(zhì)，初步認為是細菌素。將三株產(chǎn)細菌素的乳酸菌分別命名為HY07、TRS5、TRS6。2.1.2蛋白酶對發(fā)酵上清液的敏感性 將培養(yǎng)過夜后的乳酸菌上清液，經(jīng)過胰蛋白酶、胃蛋白酶處理以后，抑菌活性完全喪失，因此可確定發(fā)酵上清液中的抑菌活性物質(zhì)是蛋白質(zhì)類物質(zhì)，為細菌素（表2）。2.2 細菌素的穩(wěn)定性研究2.2.1 熱穩(wěn)定性 將發(fā)酵上清液分別經(jīng)過40、60、80、100、120處理20min，與原液的抑菌效果相比較，由圖1可知，在4080之間，三株乳酸菌發(fā)酵液均具有抑菌活性。但隨著處理溫度的不斷提高，抑菌圈的直徑逐漸減小，表明抑菌活性降低，在100時，只有HY07對單增李斯特菌

18、具有一定的抑菌活性，120處理三株菌的菌液抑菌活性均喪失，這種抑菌活性的變化規(guī)律與報道過的細菌素一致8。2.2.2 酸堿穩(wěn)定性 發(fā)酵液上清液經(jīng)過酸堿處理后，由圖2可見，在pH在510之間，仍具有較高的活性，尤其是在堿性條件下仍有一定的抑菌性。作為常用的食品防腐劑，Nisin在酸性的條件下抑菌活性較強，而堿性的條件則不利于發(fā)揮抑菌活性，這導(dǎo)致了Nisin在應(yīng)用過程中的局限性，所以一定耐堿能力的細菌素具有一定的應(yīng)用前景。2.3 產(chǎn)細菌素乳酸菌的鑒定2.3.1 HY07、TRS5、TRS6的菌落特征以及個體形態(tài)特征HY07、TRS5、TRS6三株菌在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)為圓形的白色菌落，無芽孢，革蘭氏

19、陽性，不運動，兼性厭氧。2.3.2 生理生化特征 分離到的HY07、TRS5、TRS6三株菌發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，在10和45都能生長，在6.5%的NaCl中也能生長，其他的的生理生化實驗結(jié)果見表3?；痉衔墨I資料中屎腸球菌的特征，初步確定為屎腸球菌（E. faecium）。2.3.3 16S rRNA基因序列分子生物學(xué)鑒定 以篩選到的三株產(chǎn)細菌素的乳酸菌基因組DNA為模板，進行16SrRNA基因序列的PCR擴增，得到的約1600bp產(chǎn)物純化后連接測序載體，將測序后得到的序列進行BLAST比對，通過比對發(fā)現(xiàn)HY07、TRS5、TRS6與E. faecium有超過99%的同源性，結(jié)合生理生化實

20、驗結(jié)果，可以鑒定篩選到的三株產(chǎn)細菌素的乳酸菌為屎腸球菌。菌株 對照 胰蛋白酶 胃蛋白酶TRS5 + TRS6 + HY07 + 表2 蛋白酶對細菌素抑菌活力的影響Table 2 Effect of different proteases on the antibacterialactivity of bacteriocin注：“+”表示有抑菌效果，“”表示無抑菌現(xiàn)象。圖1 細菌素的熱穩(wěn)定性Fig.1 Thermal stability of bacteriocinT（）對照 40 60 80 100 12014121086420抑菌圈直徑（mm）TRS5TRS6HY07生理生化實驗 實驗結(jié)果

21、生理生化實驗 實驗結(jié)果過氧化氫酶 氧化酶 L-阿拉伯糖 木糖 D-核糖 葡萄糖 甘露糖 纖維二糖 鼠李糖 蔗糖 乳糖 麥芽糖 蜜二糖 海藻糖 棉子糖 半乳糖 水楊苷 山梨醇 表3 菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical features of HY07，TRS5，TRS6注“：+”代表陽性；“”代表陰性。HY07Enterococcus faecium ML768TRS5Enterococcus durans strain GM20Enterococcus mundtii strain C4L10Enterococcus dispar st

22、rain BB11Enterococcus faecalis strain B10L7Enterococcus rivorum strain Z S TSA 23TRS6809472951000.005圖3基于篩選菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence ofstrains HY-7，TRS-5 and TRS-6214生 物 工 程2013年第20期Vol . 34 , No . 20 , 2013對煙曲霉XD-9菌株的5-PDE的催化特性及結(jié)構(gòu)的進一步研究將可以揭示該酶的本質(zhì)，并豐富

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28、生物化學(xué)與分子生物學(xué)報，2005，21（2）：278-281.3 結(jié)論本研究從湖南傳統(tǒng)發(fā)酵肉制品中，篩選出具有一定抑菌能力的乳酸菌，在排除酸和過氧化氫的影響后，結(jié)合蛋白酶酶解等實驗，證實分離到的三株乳酸菌能產(chǎn)生細菌素。細菌素的穩(wěn)定性實驗表明，篩選到的乳酸菌產(chǎn)生的細菌素具有一定的酸和熱穩(wěn)定性。根據(jù)16S rDNA序列的測定，結(jié)合生理生化實驗，將三株菌初步歸屬為屎腸球菌。參考文獻1 Koumoutsi A，Chen XH，Henne A，et al. Structural andfunctional characterization of gene clusters directing nonri

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