小鼠PARP1基因RNAi表達載體對Lewis細胞株的影響

1、小鼠PARP1基因RNAi表達載體對Lewis細胞株的影響 作者：王鐵君 鄒永巍 劉林林 楊海山【摘要】 目的 觀察PARP1基因RNAi表達載體對Lewis肺癌細胞的抑制及凋亡情況。方法 以脂質體Lipofectimine? 2000介導，將PARP11308的siRNA表達載體轉染Lewis肺癌細胞株，將其分為空白對照組、錯義序列組、siRNA組，2Gy照射組、2Gy照射+錯義序列組、2Gy照射+siRNA組。應用MTT法檢測轉染細胞抑制率、流式細胞術分析轉染siRNA后細胞的凋亡，并應用RTPCR檢測轉染細胞Parp1 mRNA表達水平。結果 siRNA轉染組及2Gy照射組的吸光度值與空

2、白對照組比較差異有顯著意義；2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異有顯著意義。錯義序列組與正常對照組比較無顯著差異；2Gy照射組+錯義序列組與2Gy照射組比較無顯著差異。2Gy照射組+ siRNA組對Lewis肺癌細胞的抑制率最高。RTPCR檢測結果顯示轉染細胞Parp1 mRNA表達水平降低。siRNA轉染、2Gy照射可誘導Lewis肺癌細胞凋亡，與正常對照組比較差異顯著(P0.05)，并且siRNA轉染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細胞凋亡。結論 針對PARP1的RNAi可以提高Lewis肺癌細胞的抑制率及放療引起的腫瘤細胞的凋亡。 【關鍵詞】 P

3、ARP；RNAi；細胞凋亡；腫瘤細胞 聚腺苷酸二磷酸核糖轉移酶1（PARP1）在DNA修復、細胞死亡、增殖分化等方面發(fā)揮著重要作用1，2，研究表明通過抑制PARP1活性可抑制PARP1介導的DNA修復機制，提高放療和化療對腫瘤細胞DNA的損傷效果3，4，且腫瘤治療效果滿意。但阻斷劑技術本身存在諸多缺陷，這極大地限制其應用于臨床腫瘤治療。而小片段干擾核糖核酸(small interference RNA，siRNA)技術能較好地解決應用阻斷劑所帶來的問題，從而可為腫瘤放射基因治療研究提供新途徑。本文應用PARP11308的RNAi載體轉染小鼠Lewis肺癌細胞株，觀察PARP1的RNAi對小鼠L

4、ewis肺癌細胞株凋亡的影響。 1 材料與方法 1.1 材料 TRIzol Raegent、脂質體LipofectimineTM2000、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清，Invitrogen公司；MTT，Sigma公司。Lewis肺癌細胞株，本室保存。pGPU6/GFP/NeoParp11308，本室構建、鑒定、篩選5。 1.2 方法 1.2.1 pGPU6/GFP/NeoParp11308轉染Lewis肺癌細胞株 取對數(shù)生長期的Lewis肺癌細胞，調整細胞濃度為6×107/L，取100 l接種于96孔板。設空白對照組、錯義序列組（錯義序列組序列與Parp1基因的siRNA序列有相同的GC

5、組成，但與小鼠的 mRNA沒有明顯的同源性，作為陰性對照）、siRNA組，2Gy照射組、2Gy照射+錯義序列組、2Gy照射+siRNA組，每組3復孔，接種24 h后棄去上清，以脂質體LipofectimineTM 2000介導，將siRNA表達載體轉染Lewis肺癌細胞株，具體操作按說明書進行。置于37、5% CO2、無血清培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)6 h，更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 1.2.2 細胞抑制率檢測 在各組細胞轉染24 h后分別加入MTT 20 l，培養(yǎng)箱中4 h，棄上清加入DMSO，振蕩15 min，酶標儀檢測吸光度（A）值。計算細胞抑制率。 1.2.3 轉染siRNA后細胞凋亡的檢測 各組

6、細胞以1.5×105/L密度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，轉染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化、離心收集并懸于PBS中，4、70%乙醇固定30 min，用含RNase及碘化丙錠（PI）的染色液染色30 min。應用流式細胞儀進行細胞凋亡分析。 1.2.4 轉染細胞Parp1 mRNA表達水平的檢測 各組細胞以1.0×105/L密度接種于6孔板，24 h后 棄去上清，轉染siRNA，24 h后胰酶消化，離心收集。TRIzol提取各組細胞總RNA，取1 g總RNA進行RTPCR擴增。以Parp1的引物5TCCCAAGGACTCCCTCCGCATGG3、5CTTTGCCTGCCACGCC

7、TCCAGCC3進行RTPCR，擴增片段為210 bp，檢測Parp1 mRNA的表達情況。以actin （5GTCAGGTCATCACTATCGGCAAT3，5AGAGGTCTTTACGGATGTCAACGT3）為內參照。將PCR擴增產物在1.5%的瓊脂糖凝膠上電泳。 2 結 果 2.1 siRNA對Lewis肺癌細胞生長的抑制作用 siRNA轉染組及2Gy照射組的吸光度值與空白對照組相比差異有顯著意義(P0.05)；2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異有顯著意義（P0.05)。錯義序列組與正常對照組比較差異無顯著性；2Gy照射組+錯義序列組與2Gy照射

8、組比較差異無顯著意義。2Gy照射組+ siRNA組對Lewis肺癌細胞的抑制率最高。 2.2 siRNA對Lewis肺癌細胞凋亡的影響 siRNA轉染、2Gy照射可誘導Lewis肺癌細胞凋亡，與正常對照組比差異顯著（P0.05），并且siRNA轉染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細胞凋亡（P0.05）。 2.3 轉染細胞Parp1 mRNA表達水平 見圖1。各組210 bp處均可見清晰條帶，siRNA和2Gy照射組+ siRNA組條帶明顯減弱，各組內參照actin條帶一致。 3 討 論 PARP是一類存在于多數(shù)真核細胞(酵母除外)中的蛋白質翻譯后修飾酶6，在DNA 的損傷修復、DNA復制、

9、細胞增殖分化調控、細胞凋亡、基因組的穩(wěn)定方面發(fā)揮著重要的作用7。PARP1活性抑制是輻射敏感性增高的主要原因，采用PARP1抑制劑可增強幾種抗腫瘤因子殺傷腫瘤細胞的效能。但是由于PARP是一個多成員的蛋白質家族，化學抑制劑可能會帶來非特異性抑制效果，給特定PARP成員功能的研究帶來不便。而且PARP1特異性阻斷劑還處于實驗階段，毒副作用仍不清楚。 siRNA是一種簡單的、有效的代替基因敲除的工具，其作用機制是通過活化的小干擾RNA靶向降解目的mRNA，從而使目的基因表達沉默。2123nt的短片斷雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特定的mRNA。RNA干擾技術已經廣泛用于基

10、因功能的研究以及多種疾病的治療，如乙型肝炎、丙肝、流感、艾滋病等810。本研究利用RNA干擾技術，將構建的針對PARP1的RNAi裁體轉染小鼠Lewis肺癌細胞株，結果表明siRNA轉染組及2Gy照射組吸光度值與空白對照組比較差異顯著；2Gy照射組+ siRNA組的吸光度值與2Gy照射組、siRNA組比較差異顯著。錯義序列組與正常對照組比較無顯著差異；2Gy照射組+錯義序列組與2Gy照射組比較無顯著差異，2Gy照射組+ siRNA組對Lewis肺癌細胞的抑制率最高，RTPCR檢測結果顯示轉染細胞Parp1 mRNA表達水平降低。表明RNAi沉默PARP1基因的表達，針對PARP1的RNAi可以

11、提高Lewis肺癌細胞的抑制率。 PARP具有保持染色體結構完整、參與DNA復制和轉錄的功能，在維持基因組穩(wěn)定和細胞凋亡過程中發(fā)揮作用。PARP在DNA損傷斷裂時被激活，作為DNA損傷的分子感受器，識別、結合到DNA斷裂處，激活、催化受體蛋白的聚ADP核糖基化作用，參與DNA的修復。PARP與組蛋白H1結合，影響核小體的正常結構，使染色體形成開放、松散結構，有利于DNA修復11。本研究中siRNA轉染、2Gy照射可誘導Lewis肺癌細胞凋亡，與正常對照組比較差異顯著，并且siRNA轉染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌細胞凋亡。表明針對PARP1的RNAi可以提高放療引起的腫瘤細胞的凋亡。R

12、NAi不僅克服了PARP1抑制劑的毒副作用，還具有高度特異性，為腫瘤治療治療提供了實驗依據，同時也探索了一條新的治療途徑。【參考文獻】 1 Rouleau M,Aubin RA，Poirier GG.Poly(ADPribosyl)ated chromatin domains：access grantedJ.J Cell Sci，2004；117：81525.2 Haince JF，Rouleau M，Hendzel MJ,et al.Targeting poly(ADPribosyl)ation：a promising approach in cancer therapyJ.Trends M

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