應用siRNA技術下調survivin基因表達以增強SGC7901胃癌細胞對順鉑的敏感性

1、應用siRNA技術下調survivin基因表達以增強SGC7901胃癌細胞對順鉑的敏感性【摘要】 目的 利用小干擾RNA(siRNA)技術特異性下調survivin基因的表達，檢測SGC7901胃癌細胞轉染前后對順鉑敏感性的變化。方法 實驗分為空白對照組(control組)、單用順鉑組(CDDP組)、脂質體組(Lip組)、單用survivin siRNA組(siRNA組)、轉染survivin siRNA(轉染組)及轉染survivin siRNA聯(lián)合順鉑作用組(聯(lián)合作用組)。人工合成survivin siRNA，通過Lip包裹將siRNA轉染胃癌細胞SGC7901，熒光顯微鏡下觀察轉染情況。

2、MTT法檢測各組細胞的增殖抑制率，Western blot及免疫細胞化學法檢測survivin蛋白的表達，Hoechst染色觀察細胞凋亡的形態(tài)改變。結果 Hoechst染色熒光顯微鏡下control組、Lip組及siRNA組細胞核呈正常的藍色,而CDDP組、轉染組及聯(lián)合作用組細胞核染色增強、核質濃縮、核碎裂,呈凋亡改變;聯(lián)合作用組細胞增殖抑制率(63.93±4.22)%明顯高于其余各組(P<0.05);轉染組及聯(lián)合作用組survivin蛋白表達明顯低于其他各組(P<0.05)。結論 應用siRNA技術下調SGC7901胃癌細胞中survivin基因的表達，

3、能夠增加其對順鉑的藥物敏感性。 【關鍵詞】 survivin;siRNA;胃癌;順鉑Abstract:Objective To detect the variations in cisplatin sensitivity of human gastric carcinoma cell line SGC7901 before and after transfection to specifically downregulate the expression of surviving gene with small interfering RNA (siRNA) technology.Method

4、s This experiment is divided into the control group, cisplatin group (CDDP group), lipsome group (lip group), siRNA group, transfection group and siRNA combined CDDP group (combined group). Survivin siRNA was artificially synthesized and then transfected into gastric cancer cells with liposome. The

5、transfection effects were determined by fluorescence microscopy. The inhibitory rate of cell proliferation was assayed by MTT, and the expression of survivin protein was determined by Western blot and immunocytochemical staining. The morphological changes of the apoptotic cells were observed by Hoec

6、hst staining.Results As observed under the fluorescence microscope after Hoechst staining, the nuclei presented as normal blue in the control group, lip group and siRNA group, while CDDP group, siRNA transfection group and siRNA combined cisplatin group had such changes as reinforced nuclear stainin

7、g, karyopyknosis and karyorrhexis with apoptotic changes. The inhibition rate of cell proliferation in siRNA combined cisplatin group (63.93±4.22)% was markedly higher than the other groups (P<0.05). Compared with other groups, the expression of survivin protein in the transfection group

8、 and siRNA combined cisplatin group was significantly reduced, and the differences had statistical significance (P<0.05).Conclusion The application of siRNA technology to downregulate the survivin gene expression of human gastric carcinoma cell line SGC7901 is able to enhance its drug sensiti

9、vity to cisplatin.Key words： survivin; siRNA; gastric carcinoma; cisplatin順鉑是目前臨床上最常用的化療藥物之一,其抗腫瘤作用明顯、價格低廉，并且可應用于多種腫瘤的化療,但是長期應用后極易出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，降低其療效,并且隨著劑量的增加，出現(xiàn)的副作用越來越多。有研究表明,長期應用順鉑后，某些腫瘤細胞中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象并且可檢測到存活素(survivin)的高表達1。survivin是近年新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，具有強大的抗凋亡功能，屬于凋亡抑制因子(inhibitor of apoptosis proteins， IAP)家族成

10、員之一。survivin與胃癌的定量研究表明，其表達量與患者的預后呈負相關。分化程度越低的胃癌組織中survivin表達率越高，患者預后越差2。因此，本實驗通過將人工合成的survivin 小干擾RNA(siRNA)經脂質體(liposome,Lip)包裹后轉染胃癌細胞SGC7901，探討特異性地降低胃癌細胞SGC7901中survivin的表達能否增強該細胞對順鉑的化療敏感性，從而為胃癌的化療開辟一條新途徑。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 主要試劑 RPMI 1640購自美國GIBCO公司;胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產品;LipfectamineTM 2000試劑盒及OPTIM

11、EN轉染液為Invitrogen公司產品，兔抗人survivin多克隆抗體購于Santa Cruz公司，四甲基偶氮唑藍(MTT)購自Sigma公司，順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)公司，稀釋于RPMI 1640培養(yǎng)液中，終濃度為1 mg/L。1.1.2 細胞株 人胃癌細胞株SGC7901，由徐州醫(yī)學院病理學教研室保存。1.2 方法1.2.1 實驗分組及細胞轉染 實驗分為空白對照組(control組)、單用順鉑組(CDDP組)、Lip組、單用survivin siRNA組(siRNA組)、轉染survivin siRNA(轉染組)及轉染survivin siRNA聯(lián)合順鉑作用組(聯(lián)合作用組)，每組設4個復孔

12、。各組作用SGC7901細胞72 h后進行相應后續(xù)試驗。人胃癌細胞SGC7901常規(guī)培養(yǎng)至細胞融合約40%70%時進行轉染。用Optimem分別稀釋脂質體和survivin siRNA至試驗所需濃度并輕輕混勻，5 min后將survivin siRNA稀釋液與Lip稀釋液混勻，并在室溫下放置30 min使之充分結合，加入細胞中，輕輕搖晃。37 5% CO2溫箱中培養(yǎng)，46 h后吸出，加入含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48 h后即可用于后續(xù)試驗。1.2.2 MTT法檢測細胞增殖抑制率 實驗分組同前，各組設4個復孔，分別收集轉染及未轉染細胞，按每孔1×104個細胞接

13、種于96孔培養(yǎng)板，細胞貼壁后，根據(jù)分組加入所需試劑及藥物。72 h后，每孔加入20 l的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，加150 l的二甲基亞砜(DMSO)室溫振蕩10 min后570 nm波長處測定光密度值(D570)。細胞抑制率(%)=(1-D570處理組/D570對照組)×100%。1.2.3 免疫細胞化學檢測survivin蛋白的表達 棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，固定，再次PBS沖洗。根據(jù)SP9001試劑盒說明書進行操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。survivin以細胞質出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。1.2.4 Western blot法檢測survivin蛋白的表達 收集各組細

14、胞，用預冷的PBS洗滌2遍，加入細胞裂解液，冰浴30 min進行充分裂解。4低溫離心機13 000 r/min離心5 min，取上清，F(xiàn)orlin酚法測蛋白濃度。100 g/孔上樣，進行12.5% Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠和5%的積層膠電泳、轉膜、封閉。分別加入一抗兔抗人survivin及-actin多克隆抗體，4孵育過夜，堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG孵育2 h，四唑硝基藍(NBT)/ 5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BCIP)顯色。一抗及二抗?jié)舛染鶠?1 000，用圖像分析系統(tǒng)測定各條帶的灰度值，并用Image J圖像分析軟件分析。以-actin為內參，表示survivin蛋白

15、的相對表達強度。1.2.5 Hoechst33258檢測細胞凋亡形態(tài) Hoechst33258染色：棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，固定，再次PBS沖洗。根據(jù)說明書進行染色。熒光顯微鏡下觀察拍照。1.3 統(tǒng)計學處理 用SPSS 13.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用±s表示，多個樣本均數(shù)比較采用方差分析，兩兩比較用q檢驗，相關性檢驗用Pearson相關分析。P<0.05認為差異有顯著性。2 結 果2.1 熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài) 轉染6 h后，出現(xiàn)綠色熒光，細胞碎片增多。見圖1。2.2 轉染survivin siRNA后胃癌細胞SGC7901對順鉑敏感性的影響 MT

16、T法檢測發(fā)現(xiàn)CDDP組、轉染組及聯(lián)合作用組對SGC7901細胞的增殖有較明顯的抑制作用。其中聯(lián)合作用組的細胞增殖抑制率最高，與其余各組相比差異有顯著性(P<0.05)。見表1。圖1 綠色熒光蛋白FITC標記siRNA轉染SGC7901細胞(×400)2.3 轉染前后細胞中survivin蛋白表達水平的改變2.3.1 免疫細胞化學檢測結果 與control組、lip組、siRNA組和CDDP組相比,轉染后細胞中survivin蛋白表達明顯降低(P<0.05)。見圖2、表2。表1 Survivin siRNA對SGC7901細胞增殖的抑制作用表2 各組SGC7

17、901細胞survivin蛋白的表達與其余各組比較：#、*P<0.05;與CDDP組比較：P<0.052.3.2 Western blot法檢測結果 轉染組survivin蛋白的表達明顯低于其余各組(P<0.05);CDDP組作用細胞72 h后，survivin蛋白的表達明顯高于其余各組(P<0.05)。見表3。2.4 轉染前后對細胞凋亡的影響 Honchest33258染色顯示control組、Lip組和siRNA組細胞的細胞核完整，呈正常的藍色;CDDP組、轉染組及聯(lián)合作用組細胞的細胞核染色增強、核質濃縮、核碎裂，呈凋亡改變。表3 各

18、組SGC7901細胞中survivin蛋白的D值與其余各組比較：#P<0.05;與CDDP組比較：*P<0.053 討 論胃癌是常見的消化道惡性腫瘤,世界胃癌發(fā)病率為13.86/10萬,僅次于肺癌居惡性腫瘤的第2位。在我國胃癌的發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤之首,每年死于胃癌者達16萬人,占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的23%。由于胃癌早期診斷率較低，而進展期胃癌單純根治手術年生存率僅40%，即使擴大切除范圍的超根治術也未明顯提高生存率，因此，目前臨床上化療對于胃癌的治療具有重要意義。順鉑由于其抗腫瘤作用明顯、價格低廉，并且可應用于多種腫瘤的化療，是目前臨床最常用的化療藥物之一

19、，在腫瘤的治療中占有重要地位。但是長期運用順鉑會造成機體對其敏感性降低，從而嚴重影響了化療效果，并且降低了患者的生存率。survivin直接作用于caspase，主要通過抑制凋亡終末效應器caspase-3和caspase-7或干擾caspase-9的活性，阻斷細胞凋亡的共同通路。而順鉑也是通過caspase-3依賴的信號傳導途徑，誘導腫瘤細胞的凋亡而抑制腫瘤細胞的生長，從而達到抗腫瘤的效果3。并且有研究顯示，在耐順鉑的人胃癌細胞中，survivin表達明顯高于普通人的胃癌細胞4。因此，我們認為降低腫瘤細胞中survivin的表達可能能夠增強腫瘤細胞對順鉑的藥物敏感性。本實驗采用RNA干擾(R

20、NA interference， RNAi)技術特異性的降低survivin在SGC7901中的表達。RNAi技術是利用雙鏈RNA(dsRNA)能夠特異性地降解具有同源序列的mRNA，特異性地阻斷相應基因的表達，從而成為近年來較為熱門的一種研究基因功能和進行基因治療的新方法5。RNAi在胞質dsRNA特異性核酸內切酶(Dicer)的作用下裂解成為具有2123nt堿基的短片段dsRNA分子，稱之為siRNA，siRNA與核酶復合體結合形成RNA誘導的沉默復合物(RISC),RISC通過堿基配對方式與同源靶向mRNA結合后，從siRNA的3端將靶mRNA切割成小于12nt的片段并使其降解，從而阻斷

21、相應基因表達的轉錄后基因沉默機制6。與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，RNAi技術具有特異、高效和毒性小的特點，有著明顯的優(yōu)勢。本研究采用脂質體包裹survivin siRNA轉染SGC7901細胞6 h后，熒光顯微鏡下可以看見綠色熒光，出現(xiàn)細胞碎片，并且轉染后的細胞survivin蛋白的表達明顯降低。聯(lián)合作用組Honchest染色可見SGC7901細胞核染色增強、核質濃縮、核碎裂，呈凋亡改變的細胞明顯多于CDDP組。而轉染后順鉑對SGC7901的細胞增殖抑制率從轉染前的(42.97±2.73)%提高到(63.93±4.22)%。本實驗結果顯示，通過RNAi技術特異性地下調胃癌SGC7901細胞中survivin的表達，能夠明顯增加SGC7901對順鉑的敏感性，增強順鉑對細胞的殺傷作用，從而為臨床治療胃癌提供了一個新的思路?！緟⒖嘉墨I】 1 Zaffaroni N, Daidone MG. Survivin expression and resistance to anticancer treatment: perspectives for new therapeutic interventions J. Drug Resist Updat, 2002, 5(2):65-72.2 張宏,韓大正,徐麗. Survivin蛋白在胃癌中的表達及臨床意義 J.