麻瘋樹curcin 啟動子的分離及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析

1、植物學通報Chinese Bulletin of Botany 2008, 25 (4): 407414, .研究論文.麻瘋樹curcin啟動子的分離及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析秦小波, 高繼海, 徐鶯*, 張金平, 邵彩霞, 林莎, 張淑文, 江璐玎, 李月琴, 陳放四川大學生命科學學院, 成都 610064摘要 核糖體失活蛋白是一類可以使核糖體28S rRNA的保守莖環(huán)結構域脫嘌呤的蛋白質(zhì)。麻瘋樹毒蛋白(curcin)前體基因編碼麻瘋樹胚乳I 型核糖體失活蛋白。從麻瘋樹基因組中克隆得到其5側翼區(qū)0.6 kb長的片段, 將該片段插入pBI121載體置換其中的CaMV 35S啟動子并在相應的轉(zhuǎn)

2、基因煙草中檢測報告基因GUS的表達情況。經(jīng)過GUS活性檢測分析發(fā)現(xiàn), 該0.6 kb長的片段能夠啟動報告基因在種子中的表達, 并且其在種子不同發(fā)育階段的表達活性存在差異。同時, GUS組織化學染色定位分析表明, 在雙子葉植物中該啟動子片段是胚乳特異性表達的, 它從心形胚時期開始持續(xù)地在煙草的胚乳中發(fā)揮啟動活性。關鍵詞 curcin, 麻瘋樹, 啟動子, 核糖體失活蛋白秦小波, 高繼海, 徐鶯, 張金平, 邵彩霞, 林莎, 張淑文, 江璐玎, 李月琴, 陳放 (2008). 麻瘋樹curcin啟動子的分離及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析. 植物學通報 25, 407414.在植物發(fā)育和遺傳工程中,

3、研究者總是希望目的基因在特殊的組織和器官里能夠達到期望的表達水平?；虻牟煌磉_模式, 例如組織和器官的特異性、植物發(fā)育中的獨立性等, 在植物的生長發(fā)育中非常重要。由于分子調(diào)控元件是建立生物反應器所需要考慮的一個重要前提, 因此研究植物中能夠調(diào)控外源基因表達的分子元件非常必要, 而啟動子正是其中一種重要的類型(McElroy and Brettell, 1994)。在植物中, 核糖體失活蛋白具有十分重要的生物學功能。麻瘋樹毒蛋白(curcin)作為一種核糖體失活蛋白,主要貯存在含油植物麻瘋樹種子的胚乳中(王小行等,2006), 并且含量很高(Mourgue et al., 1961)。它具有和

4、巴豆毒蛋白(crotin)相似的動物毒性和蛋白質(zhì)合成抑制能力(Stirpe et al., 1976), 其半抑制系數(shù)僅略低于美洲商陸蛋白(Barbieri et al., 1993)。許多研究表明該類蛋白可能具有多種生物學功能, 如參與植物的防御體系等(Barbieri et al., 1993; Stirpe, 2004)。因此, 研究它的表達模式將有助于其在醫(yī)藥上的開發(fā)應用。啟動子是調(diào)控基因表達的一項重要因素, 是幫助基因在恰當?shù)臅r間和地點實現(xiàn)功能的前提之一。目前, 本實驗室已克隆得到編碼一種curcin蛋白的基因序列(Lin et al., 2003),但對該基因的表達模式尚未開展研究

5、, 同時在以往有關核糖體失活蛋白研究的報道中也未發(fā)現(xiàn)對其啟動子的相關研究。因此, 本研究針對curcin基因5上游長度為620 bp的序列進行分析研究, 通過生物信息學和轉(zhuǎn)基因的方法鑒定了該片段的啟動子活性及其強度和組織特異性, 為進一步了解curcin在麻瘋樹生長發(fā)育中的作用以及構建胚乳特異型基因工程載體奠定了基礎。1 材料和方法1.1 材料麻瘋樹(Jatropha curcas L.)成熟種子采自四川攀枝花地區(qū)。采收暖房中萌發(fā)后生長2個月的葉片, 根據(jù)Wang等(1996)的方法提取麻瘋樹核基因組DNA。煙草(Nicotiana tabacum) 品種為NC98, 由本實驗室保存并繁殖。大

6、腸桿菌(Escherichia coli)菌株JM109、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens) 菌株EHA105及收稿日期: 2007-10-10; 接受日期: 2007-12-11基金項目: 國家自然科學基金(No.30670204)、國際科學技術合作項目(No.2004DFB00300, No.2006DFB63400)和教育部科技重點項目(No.104151)* 通訊作者。E-mail: qxb_2003408植物學通報 25(4) 2008質(zhì)粒pBI121 等均由本實驗室保存。1.2 方法1.2.1 PCR 擴增curcin 5端序列根據(jù)curcin 全長基

7、因(GenBank No. AF469003)設計PCR 反應引物, 序列如下: 引物P1F, 5-(HindIII)-AATATTGGAATAGAAGACTTTG-3; 引物P2R, 5-CCA(BamHI)-CAAATATCA-TTATACGAATACG-3。擴增所用酶為Vent DNA 聚合酶(New England Biolabs)。PCR程序如下: 95C 5分鐘; 94C 40秒, 56C 40秒, 72C 2分鐘, 循環(huán)35 次;72C 8分鐘。在PCR產(chǎn)物3末端加腺嘌呤核苷酸后,連接入pMD18-T 載體, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 感受態(tài)細胞, 獲得陽性轉(zhuǎn)化子后經(jīng)專業(yè)公司測序鑒

8、定正確性。1.2.2 植物表達載體的構建將含有curcin基因啟動子的重組質(zhì)粒(pMD18-CP1)經(jīng)HindIII和BamHI雙酶切, 回收目的片段。將pBI121載體(Chen et al., 2003)進行同樣的雙酶切, 去除花椰菜花葉病毒(cauliflower mosaic virus, CaMV)35S啟動子片段, 回收載體大片段, 與目的片段連接, 轉(zhuǎn)化JM109感受態(tài)細胞。在含100 mg.L1卡那霉素(Kan)的LB培養(yǎng)基上進行初步篩選, 提取陽性克隆的質(zhì)粒進行酶切鑒定,得到重組質(zhì)粒pBI121-CP1(圖 1)。1.2.3 煙草的轉(zhuǎn)化分別將pBI121和pBI121-CP1

9、質(zhì)粒用直接法導入農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中(Hoekema et al., 1983; Komariet al., 1996), 然后采用農(nóng)桿菌介導的煙草葉盤轉(zhuǎn)化法(Horsch et al., 1985), 獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。煙草培養(yǎng)溫度均為28C, 相對濕度為70%。1.2.4 轉(zhuǎn)基因煙草的PCR鑒定和Southern雜交檢測取轉(zhuǎn)基因煙草植株的葉片, 用改良的CTAB法(Wang etal., 1996)提取總DNA。根據(jù)pBI121的序列(GenBankNo.AF485783), 設計如下引物: 引物P3F, 5-AGAGGCTTACGCAGCAGGTCTC-3; 引物P4R, 5

10、-GGAAGGGTCTTGCGAAGGATAG-3, 用于檢測pBI121質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化植株。此外, 引物P1F和P2R用于檢測pBI121-CP1質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化植株。選取PCR檢測為陽性的植株, 用HindIII對其基因組DNA 進行消化, 0.8%瓊脂糖凝膠電泳分離, 再轉(zhuǎn)移到尼龍膜上固定(Sambrookand Russell, 2002)。采用PCR-DIG探針標記試劑盒以引物對(5-CAGGAAGTGATGGAGCATCAG-3和5-TCGTGCACCATCAGCACGTTA-3)制備地高辛標記的-葡萄糖醛酸酶基因(GUS) 探針片段(638 bp)。最后采用地高辛標記和檢測試劑盒進行雜交和

11、顯色處理。1.2.5 GUS活性熒光分析采用熒光分析法(Jefferson et al., 1987)測定轉(zhuǎn)基因煙草各組織器官的-葡萄糖醛酸酶(GUS)活性。以單位時間內(nèi)單位蛋白產(chǎn)生4-methylumbelliferone(MU)的量比較各啟動子對GUS表達的影響。取5 組數(shù)據(jù)的平均值作為本次實驗的結果。實驗設3次重復, 取3次實驗數(shù)據(jù)的平均值進行比較。分別取根、幼葉(5 cm)、幼莖、花(花后2天, 2 DAF)、種子(20 DAF)、葉片(20 cm)、莖和成熟種子(35 DAF)作為材料。取0.5 g樣品置于預冷的研缽中, 加0.5 mL預冷的研磨緩沖液(0.05 mol.L1 NaH

12、PO4 pH 7.0, 0.1% SDS, 0.01 mol.L1 EDTApH 8.0, 20%甲醇, 0.1% Triton X-100, 0.1% -巰基乙醇), 迅速研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入預冷的1.5 mL離心管中,2 800g, 4C離心10分鐘, 上清液即為GUS 蛋白粗提取液。按照Jefferson等(1987)的方法進行酶促反應, 在365 nm激發(fā)光下測定酶反應產(chǎn)物的455 nm熒光強度。同時采用Bradford法測定蛋白質(zhì)含量(Bradford,1976)。1.2.6 GUS活性的組織化學染色分析根據(jù)Jefferson等(1987)的方法, 將待測煙草樣品與含X-gluc底物的染

13、色反應液(0.5 g.L1 X-gluc, 0.075 mol.L1 Na2HPO4, pH 7.0, 0.05 mmol.L1 K3Fe(CN)6,0.05 mmol.L1 K4Fe(CN)6, 0.01 mol.L1 EDTA, pH8.0, 20%甲醇, 0.1% Triton X-100)于37C保溫過夜,秦小波等: 麻瘋樹curcin啟動子的分離及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析409用75%乙醇脫色, 觀察并照相。(TGCAAAG)(Wu et al., 2000)。其它光誘導、激素誘導、病原體誘導以及脫水應答相關的啟動子基序也普遍存在于該啟動子中(Higo et al., 1999),

14、 例如GT-1結合位點(GRWAAW, R=A/G, W=A/T)、I-box(GATAA)、MYB識別位點(YAACKG, Y=C/T, K=G/T)和W-box(TTGAC)等。根據(jù)上述分析結果, 該CP1片段極有可能就是驅(qū)動curcin表達的特異性啟動子片段。因此將CP1片段插入pBI121載體中, 置換其中的CaMV 35S啟動子, 構建成為一個植物表達載體(圖1), 同時用pBI121質(zhì)粒本身作為對照進行后續(xù)分析。2 結果與分析2.1 麻瘋樹毒蛋白(curcin)基因5調(diào)控區(qū)的分離及分析利用引物P1F和P2R, 從麻瘋樹基因組DNA中擴增得到一條長度為620 bp的片段CP1(Gen

15、Bank No.EF612739)。分析該序列發(fā)現(xiàn), 它與之前登錄到GenBank 上的一條序列(No. AF469003)有90%以上的相似性, 其差異主要表現(xiàn)在一些零散的單核苷酸多態(tài)位點以及短的重復序列插入或缺失。在植物啟動子元件預測數(shù)據(jù)庫中對該序列進一步分析顯示, 該片段含有1個TATA盒和3個CAAT盒。同時, 還存在一些與胚乳特異性表達調(diào)節(jié)相關的功能元件, 例如DOFCORE(Yanagisawa, 2000)、DPBFCORE (Finkelstein andLynch, 2000) 和 E-box (Hartmann et al., 2005)等。其中, DOFCORE 是Yan

16、agisawa和Schmidt(1999)用DNA結合位點篩選實驗研究一種玉米胚乳特異性DNA結合蛋白(prolamin-box binding factor, PBF)的DNA結合位點時發(fā)現(xiàn)的。其共有的特征序列是NNNA/TAAAGNGN, 主要位于麻瘋樹CP1片段中。E-box的保守基序為 CANNTG, 是控制貯藏蛋白napA在油菜種子中表達的啟動子順式作用元件, 在CP1片段中則位于預測的DOFCORE元件下游。另外, CP1中還存在與胚乳特異性表達相關的功能基序Prolamin box2.2 轉(zhuǎn)基因煙草的再生及檢測分析通過農(nóng)桿菌的浸染和卡那霉素篩選, 共獲得28株轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pBI1

17、21-CP1的卡那霉素抗性煙草和25株轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBI121的卡那霉素抗性對照煙草。用PCR方法初步鑒定這些抗性煙草植株。對于轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pBI121-CP1的卡那霉素抗性煙草, 使用引物P1F和P2R, 經(jīng)PCR反應后, 轉(zhuǎn)化成功植株DNA可以擴增到一條620bp長的片段, 從而得到鑒定。同樣對于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒pBI121的卡那霉素抗性對照煙草, 使用CaMV 35S啟動子特異引物P3F和P4R, 可以從陽性植株中擴增到一條0.7 kb長的片段, 從而鑒定出含有質(zhì)粒pBI121的對照煙草植株。通過該步驟, 進一步篩選得到了21株含重組質(zhì)粒pBI121-CP1的轉(zhuǎn)基因煙草和18株含質(zhì)粒pBI121的對

18、照煙草(圖2)。圖1 表達載體構建模式圖Figure 1 Strategy for construction of expression vectors410植物學通報 25(4) 2008為進一步鑒定陽性轉(zhuǎn)基因植株并確定其轉(zhuǎn)入片段的拷貝數(shù), 選取GUS上一段長度為638 bp的片段作為探針, 進行Southern雜交分析。由于所構建的質(zhì)粒載體上只含有1個HindIII 限制性內(nèi)切酶的識別位點, 在用HindIII對轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA進行酶切后, 探針應該與含有完整整合片段的酶切片段相結合。而且由于片段在基因組中整合的位置不同會產(chǎn)生不同長度的酶切片圖2 轉(zhuǎn)基因煙草的部分PCR分析結果(A)

19、 pBI121轉(zhuǎn)基因煙草株系的PCR分析; (B) pBI121-CP1轉(zhuǎn)基因煙草株系的PCR分析M: DL2000 DNA marker; C1: 相應的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒陽性對照; C2: 野生型煙草; 35S-135S-8: 含有CaMV 35S啟動子的各轉(zhuǎn)基因煙草植株; CP1-1CP1-8: 含有CP1啟動子的各轉(zhuǎn)基因煙草植株Figure 2 Partial results of PCR analysis of transgenic plants(A) PCR analysis of putative transgenic tobacco plants trans-formed with pB

20、I121; (B) PCR analysis of putative transgenictobacco plants transformed with pBI121-CP1M: DL2000 DNA marker; C1: The corresponding plasmid usedfor transformation as positive control; C2: Non-transgenic to-bacco plants as negative control; 35S-135S-8: Transgenictobacco plants containing CaMV 35S prom

21、oter; CP1-1CP1-8:Transgenic tobacco plants containing CP1 promoter段, 因此雜交分析中的條帶數(shù)即可以代表轉(zhuǎn)基因植株中整合的目的片段的拷貝數(shù)。通過分析, 確定陽性植株中被整合入煙草基因組中的目的片段有13個拷貝(圖3)。2.3 GUS活性定量分析和啟動子活性比較在T0代轉(zhuǎn)基因煙草中, 對每一轉(zhuǎn)基因系的10株PCR陽性植株進行GUS活性定量分析。根據(jù)Southern雜交結果, 為避免轉(zhuǎn)基因煙草中目的片段插入位置不同造成的影響, 從每一轉(zhuǎn)基因系中GUS活性值相近的多數(shù)植株中選取3株進行T1和T2代的培育并進一步分析。在T1代中, 選取

22、每個轉(zhuǎn)基因系中的5株PCR陽性植株進行GUS活性檢測, 以檢測到的平均GUS活性值來衡量每個啟動子的活性。圖4A顯示了T0代轉(zhuǎn)基因煙草莖、葉和種子組織中的GUS活性情況。從中可以看出, 在CP1轉(zhuǎn)基因煙草系中, 種子的GUS活性(84.23 nmol 4-MU.min1.mg1protein)最高, 而葉片(0.19 nmol 4-MU.min1.mg1protein)和莖(0.12 nmol 4-MU.min1.mg1protein)中的GUS活性很圖3 轉(zhuǎn)基因煙草的Southern雜交分析WT: 野生型煙草; 35S-3、35S-4、35S-7和35S-8: pBI121轉(zhuǎn)基因煙草植株;

23、CP1-1、CP1-4、CP1-6、CP1-8和 CP1-9:pBI121-CP1轉(zhuǎn)基因煙草植株Figure 3 Southern hybridization analysis of transgenic to-bacco plantsWT: Non-transgenic tobacco plants; 35S-3, 35S-4, 35S-7 and35S-8: Transgenic tobacco plants transformed with pBI121;CP1-1, CP1-4, CP1-6, CP1-8 and CP1-9: Transgenic tobaccoplants tran

24、sformed with pBI121-CP1秦小波等: 麻瘋樹curcin啟動子的分離及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析411低, 可以忽略不計。而在含有CaMV 35S啟動子的轉(zhuǎn)基因煙草系中, 各組織中的GUS活性都較高。通過對CP1和CaMV 35S啟動子的活性進行比較, 發(fā)現(xiàn)前者在煙草種子中的活性略低于后者。在T1代轉(zhuǎn)基因煙草中, 進一步對CP1和CaMV 35S啟動子進行了時空表達方面的檢測(圖4B)。結果發(fā)現(xiàn),除種子外, CP1轉(zhuǎn)基因煙草植株的根、幼莖、幼葉、圖4 轉(zhuǎn)基因煙草中的啟動子活性分析(A) 啟動子在T0代轉(zhuǎn)基因煙草中的活性比較; (B) 啟動子在T1代轉(zhuǎn)基因煙草中的時空表達分析

25、WT: 野生型煙草; 35S: 轉(zhuǎn)入35S 啟動子的陽性對照煙草; CP1: 轉(zhuǎn)入curcin基因啟動子片段(0.6 kb)的煙草1: 根; 2: 幼莖; 3: 幼葉; 4: 花瓣; 5: 花萼; 6: 雄蕊; 7: 柱頭; 8: 子房;9: 成熟葉片; 10: 莖; 11: 花后20天的種子; 12: 花后35天的種子Figure 4 Analysis of promoter activity in transgenic plants(A) Comparison of promoter activity in first generation oftransgenic plants (T0)

26、; (B) Temporal and spatial analysis ofpromoter activity in next generation of transgenic plants (T1)WT: Wild type tobacco plants as negative control; 35S:Transgenic plants integrated 35S promoter as a nominally con-stitutive control; CP1: Transgenic plants integrated 5 flankingfragment of curcin gen

27、e(0.6 kb)1: Root; 2: Young stem; 3: Young leaf; 4: Petal; 5: Calyx; 6:Stamen; 7: Stigma; 8: Ovary; 9: Mature leaf; 10: Mature stem;11: 20-DAF seed; 12: 35-DAF seed花瓣、花萼、雄蕊、柱頭、子房、葉片和莖組織中的GUS活性都非常低, 可以忽略不計。T1代CP1轉(zhuǎn)基因煙草系開花后20天的種子中表現(xiàn)出較低的GUS活性, 但開花后35天則顯示出很高的GUS活性。在含有CaMV 35S啟動子的對照煙草株系中, 除幼莖外, 其它各組織中的GUS活

28、性都較高。由此表明CP1啟動子的種子偏好性表達起始于轉(zhuǎn)基因煙草種子發(fā)育的某個時期。與CaMV 35S啟動子在幾乎所有的組織和發(fā)育階段都能表達的特點相比, CP1啟動子片段的表達更加獨特和專一。2.4 組織化學染色分析為進一步了解CP1片段在種子發(fā)育過程中具有的時空表達驅(qū)動特性, 將T1代轉(zhuǎn)基因煙草在開花前一天套袋,使其自花授粉。然后收集授粉后不同發(fā)育時期的果實,進行GUS表達的組織化學定位分析。分析發(fā)現(xiàn), GUS組織化學染色的藍色斑點首次出現(xiàn)于胚胎發(fā)育進入心形胚后, 然后一直持續(xù)到成熟種子時期, 并且嚴格定位于胚乳區(qū)域(圖5)。這表明CP1啟動子在麻瘋樹自身體系中的時空表達模式及發(fā)育中的調(diào)控機

29、制與在異源植物體系煙草中的情況非常相似。因此, CP1片段應該是一個胚乳特異性的啟動子, 并包含了至少大部分的順式調(diào)控元件。3 討論在本研究中首次對麻瘋樹curcin基因的5上游CP1序列進行了克隆和分析。結果顯示, 該片段富含胚乳和種子特異的啟動子元件, 不僅在轉(zhuǎn)基因煙草植株中具有啟動子活性, 同時還嚴格地將其下游基因的表達限制在轉(zhuǎn)基因植株心形胚時期以后的種子胚乳中, 這種情形與curcin在麻瘋樹種子中的表達積累情況相吻合, 因此該片段應該就是調(diào)控curcin基因表達的啟動子。同時研究也證實麻瘋樹中的啟動子在煙草等其它異源植物中也能發(fā)揮作用。但還需進一步開展更深入的研究工作。本實驗室早期的

30、研究數(shù)據(jù)顯示, 麻瘋樹中curcin毒蛋白的含量至少可占種仁總蛋白含量的13.5%, 這表明412 植物學通報 25(4) 2008 CP 1 啟動子在內(nèi)源體系中的活性應強于 CaMV 35S 啟 動子。然而本實驗通過對 GUS 活性分析表明, 在轉(zhuǎn)基 因煙草中 CP1 啟動子的表達活性不及 35S 啟動子。造 成這種現(xiàn)象的原因可能有 2 個。其一是 c urc in 的表達 除了現(xiàn)有 CP 1 片段之外, 在其上游、下游或其它位置 還存在另外的表達增強元件, 能夠提高 curcin 的表達水 平; 或者由于煙草和麻瘋樹本身的差異, 導致在煙草胚乳 細胞中缺乏促進 curcin 表達的反式調(diào)控

31、因子, 因此使得 其表達未達到應有的水平。其二, 本實驗中 35S 啟動子 啟動的 GUS 表達水平相對高于之前報道的在煙草中的 表達水平(Jefferson et al., 1987), 可能也存在一定影響。 此外, 各種生物和非生物脅迫條件對CP 1片段表達 的影響還有待研究。早期的關于其它植物核糖體失活 蛋白的研究報道以及本實驗室的前期研究結果表明, 一 些核糖體失活蛋白基因的表達與脅迫條件息息相關, 而 盡管預測分析顯示 CP 1 片段中有一些病原誘導 、脫水 誘導的應答元件(Higo et al., 1999), 但它是否真正參與 了這種調(diào)控還不得而知。 圖5 煙草種子的 GUS 活

32、性組織化學染色縱切圖 分析還顯示其它植物基因啟動子中與胚乳特異性表 達相關的順式元件也出現(xiàn)在 c u rc in 基因的啟動子中 。 因此, 為了進一步研究該啟動子中與胚乳特異性表達相 關的順式元件的功能特征, 更加深入的啟動子缺失和突 變分析以及對其它遠端調(diào)控因子和相關反式轉(zhuǎn)錄因子的 研究是必要的 。 由于CaMV 35S啟動子不能滿足啟動目的基因在特 定組織中表達的要求, 而在植物生物反應器的研究中種 子是作為反應器的重要器官。因此, 能有效啟動基因在 種子中進行特異表達的啟動子和順式調(diào)控元件顯得尤為 重要。此外, 分離和比較種子特異性表達的啟動子還有 助于揭示組織特異性、相對啟動活性和發(fā)

33、育進程中的 時空調(diào)節(jié)與序列之間的關系, 同時有助于發(fā)現(xiàn)順式調(diào)控 序列的新特性, 從而滿足遺傳工程的特定要求。 em: 胚; en: 胚乳 (A) 轉(zhuǎn)入 CaMV 35S 啟動子的轉(zhuǎn)基因煙草種子, 胚和胚乳均染上 藍色; (B) 野生型煙草成熟種子, 均不能染上藍色; (C) 轉(zhuǎn)入 CP1 啟動子的轉(zhuǎn)基因煙草成熟種子, 僅胚乳被染上藍色; (D) 野生型煙草心形胚時期的種子, 均不能染上藍色; (E) 轉(zhuǎn)入CP1啟動子的轉(zhuǎn)基因煙草心形胚時期的種子, 僅胚乳被染 上藍色 Figur e 5 His toc hemical analys is of GUS activity in tobac co

34、seed pod longitudinal sec tions em: Embr yo; en: Endosperm (A) Seed of transgenic tobacco c ontaining CaMV 35S promoter, w ith both embr yo and endos per m s tained in deep blue; (B) Wild- type tobacco seed at mature embryo period, no blue is visible; (C) Seed of tr ans genic tobac co containing CP1

35、 at matur e embr yo period, the full of the endosper m is the only main region w hich show s GUS activity; (D) Wild-ty pe tobac co seed at hear t-s hape embryo period, no blue is vis ible; (E) Seed of transgenic tobacco containing CP1 at heart- shape embr yo per iod, only the main r egion of develop

36、mental endosperm is stained in blue 參考文獻 王小行, 彭峰, 牛冬云, 李鋼, 陳放 (2006). 麻瘋樹脂酶全長基因克 隆、表達及其蛋白質(zhì)結構預測. 植物學通報 23, 634641. 秦小波等: 麻瘋樹curcin啟動子的分離及其在轉(zhuǎn)基因煙草中的功能分析413Sambrook J, Russell D ( 黃培堂等譯 ) (2002). 分子克隆實驗指南 (第3版). 北京: 科學出版社. pp. 656675.Barbieri L, Battelli MG, Stirpe F (1993). Ribosome-inactivatingprotein

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