western blot超詳細步驟

1、一、蛋白質(zhì)的樣品制備:一、溶液:裂解液及蛋白酶抑制劑(每毫升裂解液加20ulcocktail二、操作步驟:1、6孔板置于冰上,細胞經(jīng)預(yù)冷的PBS漂洗3次,每孔加入100l裂解液, 5min后用細胞刮刀刮取細胞,用槍頭轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中,編號置于冰上。2、以上所得的樣品用超聲細胞破碎儀超聲處理,超聲時間為3S,間歇時間為10S,重復(fù)三次。3、于4離心機(預(yù)冷12000r離心15min,取上清,收集于0.5mlEP管中。二、蛋白濃度的測定(BCA法測定蛋白濃度1.取標準蛋白(2mg/ml備用。2.于標準蛋白稀釋為2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125

2、mg/ml 0mg/ml,96孔板中每孔加入10ul,設(shè)3個復(fù)孔,待測蛋白稀釋8倍,每孔加入10ul,設(shè)3個復(fù)孔,每孔加入BCA工作液(A液:B液=50:1混勻90ul,37溫浴30min,酶標儀測出各吸光度值,EXCEL輸入數(shù)據(jù),繪制標準曲線。測出待測蛋白濃度。測完蛋白含量后,計算含30、50l蛋白的溶液體積即為上樣量。按上樣量取出樣品至0.5ml的EP管中,加入5×SDS 上樣緩沖液至終濃度為1×。后蛋白于95煮5min(干濕溫箱預(yù)熱。樣品于-80保存。三、電泳1.制膠分離膠:電泳凝膠濃度試劑 10%H2O(ml 4.030%丙烯酰胺 3.31.5mol/lTris.c

3、l(PH8.8 (ml2.510%SDS(ml 0.110%AP(ml 0.1TEMED(l 5總體積(ml 10濃縮膠試劑濃度(5%H2O(ml 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8 (ml 0.510%SDS(l 4010%AP(l 30TEMED(l 4總體積(ml 31、玻璃板對齊后放入夾中卡緊。然后垂直卡在架子上準備灌膠。2、按前面方法配10%分離膠,加入TEMED前混勻,加入TEMED后再次搖勻即可灌膠。灌膠時,可用1ml槍吸取膠沿玻璃放出,待膠面升到綠帶中間線高度時即可。然后膠上加一層水。3、當水和膠之間有一條折射線時

4、,說明膠已凝了,時間約20min左右。用吸水紙將膠上面水吸干。4.濃縮膠按前面比例加入,加入TEMED前混勻,加入TEMED后再次搖勻,快速灌膠,可用1ml槍吸取膠沿玻璃放出,約5min后濃縮膠凝固,插梳子時要使梳子保持水平。放入4冰箱備用。2、電泳:1.配制電泳緩沖液(5×:Tris 15g+甘氨酸72g+SDS 5g+H2O至1L,稀釋為1×.2.取出膠板,兩手分別捏住梳子的兩邊豎直向上輕輕將其拔出。加足夠的電泳液后開始準備上樣。(電泳液至少要漫過內(nèi)側(cè)的電泳槽,外側(cè)量可只到2/3。用槍頭吸取樣品,將樣品吸出不要吸進氣泡。將槍頭稍插入孔中緩慢加入樣品。3、加樣完畢,于冰上

5、電泳,蓋好電泳槽的蓋子,(注意電極方向紅對紅,黑對黑,先以80V電壓進行電泳15-20min左右,后調(diào)電壓至 100V,電泳直至溴酚染料前沿下至凝膠末端處,即停止電泳,時間約1h30min左右(注意觀察電泳液是否泄漏。四、轉(zhuǎn)膜(1配制轉(zhuǎn)膜緩沖液(5×:Tris 15g+甘氨酸72g加水定容到1L,稀釋為1×,放入4預(yù)冷。(2將PVDF膜在甲醇中活化。在加有轉(zhuǎn)移液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子、兩塊海綿墊、濾紙和浸過的膜。(3將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,在墊子上墊一層加厚濾紙,注意不要有氣泡。(4要先將玻璃板撬掉才可剝膠,撬的時候動作要輕,要在兩個邊上輕輕的

6、反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動,直到撬去玻板。除去小玻璃板后,將濃縮膠輕輕刮去,要避免把分離膠刮破。小心剝下分離膠蓋于濾紙上,輕輕用玻棒搟去氣泡。將膜蓋于膠上,要蓋滿整個膠(膜蓋下后不可再移動并除氣泡。在膜上蓋1張加厚濾紙并除去氣泡。最后蓋上海綿,合起夾子。整個操作在轉(zhuǎn)移液中進行,要不斷的搟去氣泡。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,接觸后會發(fā)生短路。(5先開啟4循環(huán)冷凝水預(yù)冷,將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中,要使夾的黑面對槽的黑面,夾的白面對槽的紅面。電轉(zhuǎn)移時會產(chǎn)熱,加冰降溫。以250mA轉(zhuǎn)膜3h。五、麗春紅染色轉(zhuǎn)完膜后用TBST浸潤一下,將膜用1×麗春紅染液染5min(于脫色搖床上搖。然后用TBST沖洗掉沒染上的染液就可看到膜上的蛋白。再以TBST徹底洗去麗春紅染液。六、封閉:以5%的脫脂牛奶粉溶于TBS-T中,將膜放入封閉液中封閉1h。七、抗體孵育1、標記Marker分子量,選擇目的蛋白所在范圍剪膜,將條帶在一抗(參照說明書比例VP16 1:1000, ICP4 1:500及內(nèi)參(參照說明書中孵育,封閉于PE手套中,注意不要有氣泡,加入約2ml封閉液,后搖床上4過夜。2.取出一抗及內(nèi)參中的條帶,用TBST在水平搖床中洗脫4次,每次5min。加TBST 10ml于50ml離心管中,加入相應(yīng)二抗(