實(shí)時(shí)定量PCR完全手冊(cè)

1、方法簡(jiǎn)介所謂的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 就是 通過(guò)對(duì) PCR 擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)產(chǎn)物熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)檢測(cè)從而實(shí)現(xiàn)對(duì)起始模板定量及定性的分析。在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 反應(yīng)中，引入了一種熒光化學(xué)物質(zhì)，隨著 PCR 反應(yīng)的進(jìn)行，PCR 反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線。RT-qPCR是由三個(gè)步驟組成1、反轉(zhuǎn)錄:依賴反轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNDA2、擴(kuò)增:用PCR的方法擴(kuò)增cDNA3、檢測(cè):實(shí)時(shí)檢測(cè)和定量擴(kuò)增的產(chǎn)物RT-qRCR影響分析可靠性關(guān)鍵點(diǎn)(Key porint)1、分析結(jié)

2、果依賴于模板的數(shù)量、質(zhì)量以及合理的檢測(cè)方法設(shè)計(jì)2、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的非標(biāo)準(zhǔn)化影響試驗(yàn)的穩(wěn)定性3、數(shù)據(jù)分析應(yīng)該高度客觀，如果不合理的分析，從分析結(jié)果中會(huì)得到混淆的錯(cuò)誤結(jié)果，因此通過(guò)對(duì)RT-qPCR的每一組分進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)以達(dá)到最小化變異性，最大化可重復(fù)性，而且還需要沿用一個(gè)通用的數(shù)據(jù)分析的指南。對(duì)基因表達(dá)分析的標(biāo)準(zhǔn)化的需要是與人類臨床診斷分析相適應(yīng)的。QRT-PCR 抑制物的組成QRT-PCR抑制物嚴(yán)重減少了PCR的靈敏度以及熱動(dòng)力學(xué)反應(yīng),高度的抑制還導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。抑制物的來(lái)源：生物樣品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，鹽離子，尿素，血紅素，heparin以及IgG.存在的問題由于各個(gè)學(xué)術(shù)團(tuán)體和科研機(jī)

3、構(gòu)使用不同的操作流程，必然導(dǎo)致大家使用不同定量的來(lái)源物以及數(shù)據(jù)分析：1、.新鮮、冰凍、甲醛固定的樣品2、整個(gè)組織樣本，顯微切割樣本，單個(gè)細(xì)胞，組培細(xì)胞3、總RNA或者mRNA4、RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA的不同的引發(fā)策略5、不同的酶以及酶的不同組合6、變異系數(shù)、靈敏度7、多類型的檢測(cè)化學(xué)方法，反應(yīng)的條件，熱循環(huán)儀的分析以及匯報(bào)方式。8、每一步驟缺乏標(biāo)準(zhǔn)化分析流程造成了在樣品的處理，內(nèi)參的使用，歸一化的方法，質(zhì)量控制等等因素嚴(yán)重影響RT-qPCR的可信度，重復(fù)性。RNA 質(zhì)量評(píng)價(jià)現(xiàn)在RNA 定量的程序很多。最近EMBO qPCR course () 比較了用Ribogreen, Agilent Bi

4、oAnalyser, spectrophotometer,Nanodrop and the BioRad Experion 來(lái)定量同樣的樣品。結(jié)果顯示沒有哪兩種方法得到同樣的分析數(shù)據(jù)。所以用不同的方法進(jìn)行定量是不明智的。因此，我們需要用統(tǒng)一套定量分析方法來(lái)完成所有RNA樣品的評(píng)價(jià)。RNA 質(zhì)量RNA 質(zhì)量主要包括RNA的純度（沒有蛋白質(zhì)和DNA的污染）以及完整性。傳統(tǒng)的RNA質(zhì)量的評(píng)價(jià)通過(guò)分析A260/A280的比值或者對(duì)瓊脂糖凝膠電泳rRNA的條帶的分析。Agilent Bioanalyser/BioRad Experion 微流體毛細(xì)電泳系統(tǒng)也是一種較新的分析方法。Agilent的2100

5、也是一種十分好的分析RNA質(zhì)量的方法，它通過(guò)分析18S以及28S rRNA的分析圖譜，通過(guò)圖譜來(lái)反應(yīng)RNA的量和完整性，其完整性通過(guò)完整性系數(shù)（RIN）來(lái)反應(yīng)。樣品的RINs在10-4之間。10代表完整的RNA，4代表沒有完整的rRNA帶。由于以上的方法并非100準(zhǔn)確定反應(yīng)mRNA的完整性，因?yàn)樗麄冎皇欠磻?yīng)rRNA的量來(lái)間接測(cè)定mRNA的完整性。這里推薦一種方法：采用GAPDH的3：5分析法。我們使用oligo dT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，然后對(duì)逆轉(zhuǎn)錄的cDNA用multiplex熒光定量評(píng)價(jià)。設(shè)計(jì)三個(gè)taqman探針來(lái)定量三種相同大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。探針設(shè)計(jì)的位點(diǎn)分別位于3;5以及中部。擴(kuò)增產(chǎn)物的之間的比值

6、反應(yīng)RNA的完整性。如果3;5的比值在1,反應(yīng)較高度完整性，如果高于5說(shuō)明降解。是否有抑制物的評(píng)價(jià)體系：1、通過(guò)對(duì)目的樣品進(jìn)行梯度稀釋進(jìn)行PCR擴(kuò)增效率的檢測(cè)2、.通過(guò)內(nèi)部擴(kuò)增對(duì)照來(lái)反應(yīng)樣品處理過(guò)程中樣本的情況3、用細(xì)菌檢測(cè)臨床樣品的抑制4、通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)人工合成的擴(kuò)增進(jìn)行RT-PCR來(lái)反應(yīng)目標(biāo)檢測(cè)物的抑制情況反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)系統(tǒng)1、RT和PCR單一酶系統(tǒng)2、RT和PCR分離的酶系統(tǒng)3、RNA逆轉(zhuǎn)錄引物的選擇引物主要有三種：1、隨機(jī)引物：隨機(jī)引物，特別是6nt引物對(duì)所有的靶位點(diǎn)不產(chǎn)生十分穩(wěn)定一致的結(jié)果，建議使用15nt的隨機(jī)引物。2、oligo-dT：只能用于mRNA完整的樣品，特別有polyA .而且對(duì)

7、于一些特殊的變異體以及較長(zhǎng)的3UTR的區(qū)域比較困難3、特異引物：最特異最靈敏的方法。特別RNA量足夠情況下建議使用此法。PCR 優(yōu)化PCR優(yōu)化主要有：1、引物的濃度2、建議使用SYBR Green I和EvaGreen 進(jìn)行擴(kuò)增和溶解曲線的測(cè)試筆者建議的操作流程:I靶的選擇和試驗(yàn)設(shè)計(jì)1.針對(duì)目的基因序列選擇合適的擴(kuò)增片斷查看以下三個(gè)網(wǎng)站是否有合適的已經(jīng)證實(shí)的QRT-PCR的擴(kuò)增引物,探針以及反應(yīng)條件.RTPrimerDB (),PrimerBank ()Real Time PCR Primer Sets ()如果沒有合適的或者已經(jīng)證實(shí)的可以提供參考,以下的設(shè)計(jì)方案僅供參考:A、最廣泛使用的商業(yè)

8、化的軟件Beacon Designer()B、DIY的軟件Primer ExpressC、如果Beacon Designer 無(wú)法得到您說(shuō)需要的結(jié)果,或者獲得到設(shè)計(jì)方案的備選數(shù)目不夠的話,可以選擇Sigma-Genosys )的服務(wù)方案,詳細(xì)周到D、一個(gè)免費(fèi)的基于網(wǎng)頁(yè)構(gòu)架的引物和探針設(shè)計(jì)程序: 您可以挑選其中的4-6對(duì)引物進(jìn)行試驗(yàn),選擇引物的擴(kuò)增效率和靈敏度高的.這個(gè)軟件可以直接與NCBI的網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì),并且用NCBI的ePCR進(jìn)行虛擬的電子PCR引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)介DNA引物長(zhǎng)度:15-25 個(gè)堿基GC含量:50%左右如果引物的與AT區(qū)域富集結(jié)合,可以考慮用LNA替換幾個(gè)堿基,較少引物的長(zhǎng)度以及避免

9、引物次級(jí)結(jié)構(gòu)和3端二聚體的影響.由于引物和模板和探針與靶點(diǎn)之間的分之間的相互競(jìng)爭(zhēng),分之內(nèi)雜交,倒轉(zhuǎn)重復(fù)等等會(huì)引起引物的引發(fā)探針對(duì)結(jié)合效率達(dá)降低,因此我們選擇引物二聚體的G為負(fù)值,即:<10 kcal/mol.沒有連續(xù)的G/C.引物探針的保存一般遵循以下原則:正向和反向引物保存在-20度, 濃度為10mM 或者10×工作濃度.探針應(yīng)該避光保存，貯存在-70度,最好以凍干粉狀態(tài)，工作濃度的液體保存一般兩周左右。2、輸入靶序列，用BLASTn在進(jìn)行比對(duì)。3、檢查比對(duì)序列的多態(tài)性以及可能的錯(cuò)誤避免這些區(qū)域來(lái)進(jìn)行引物和探針設(shè)計(jì)。4、在靶序列中避免直接待重復(fù)區(qū)，在重復(fù)區(qū)進(jìn)行雜交容易使得引物

10、非獲得產(chǎn)物性結(jié)合，降低DNA的擴(kuò)增效率以及減少分析的靈敏度。5、考慮到潛在的剪接變異體以及合適的所需要的獲得到靶，通過(guò)學(xué)分析內(nèi)含子以及外顯子的邊界，主要通過(guò)cDNA和基因組序列比對(duì)來(lái)確定。一般都設(shè)計(jì)跨最長(zhǎng)內(nèi)含子區(qū)，這樣減少了擴(kuò)增子受到基因組DNA的污染的影響。這是十分有必要的，特別當(dāng)用DNA做歸一化處理以及靶向某一特異的剪接變異體。最經(jīng)濟(jì)的做法是讓下游引物跨越剪接接頭，這樣允許使用一條探針檢測(cè)可能剪接變異體.然后如果在有效性和靈敏度無(wú)法保證情況下，可以使用跨越單一外顯子的設(shè)計(jì)方案。我們還是建議試驗(yàn)者用DnaseI處理樣品，除去gDNA的污染。6、在RT步驟時(shí)，用()工具檢測(cè)在特定溫度下靶序列的

11、折疊情況，避免一些高度次級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域，那些區(qū)域探針和引物結(jié)合效率較低。7、盡可能用60-150bp的擴(kuò)增產(chǎn)物，GC含量在60或者稍小來(lái)確定高效的變性，更高度反應(yīng)效率。GC含量高度序列容易產(chǎn)生非特異性的反應(yīng)，短序列擴(kuò)增是的擴(kuò)增時(shí)間縮短gDNA污染可能性減少。短的序列容易人工合成，用來(lái)做擴(kuò)增多標(biāo)準(zhǔn)曲線。用oligodT進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄最好設(shè)計(jì)擴(kuò)增子位于靠近模板的3區(qū)域 。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(圖)點(diǎn)擊次數(shù)： 2258  發(fā)表于：2008-07-21 01:57轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自丁香園 來(lái)源：互聯(lián)網(wǎng) 一、實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理（一）定義：在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒

12、光信號(hào)累積實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知模板進(jìn)行定量分析的方法 。（二）實(shí)時(shí)原理1、常規(guī)PCR技術(shù)：對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)的終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量和定性分析無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量，無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)。2、實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析3、如何對(duì)起始模板定量？ 通過(guò)Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析.4、幾個(gè)概念：（1）擴(kuò)增曲線 ：（2） 熒光閾值：（3）Ct值：     CT值的重現(xiàn)性：5、定量原理：理想的PCR反應(yīng)

13、：   X=X0*2n非理想的PCR反應(yīng)：  X=X0 (1+Ex)n      n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)      X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量      X0：初始模板量      Ex：擴(kuò)增效率5、標(biāo)準(zhǔn)曲線6、絕對(duì)定量1）確定未知樣品的 C(t)值 2）通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線由未知樣品的C(t)值推算出其初始量7、DNA的熒光標(biāo)記：分頁(yè): 1   2   3

14、   實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)的原理及應(yīng)用(圖)點(diǎn)擊次數(shù)： 2258  發(fā)表于：2008-07-21 01:57轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自丁香園 來(lái)源：互聯(lián)網(wǎng) 二、實(shí)時(shí)熒光定量PCR的幾種方法介紹方法一：SYBR Green法（一）工作原理1、SYBR Green  能結(jié)合到雙鏈DNA的小溝部位     2、SYBR Green  只有和雙鏈DNA結(jié)合后才發(fā)熒光3、變性時(shí)，DNA雙鏈分開，無(wú)熒光4、復(fù)性和延伸時(shí)，形成雙鏈DNA， SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號(hào)。PCR反應(yīng)體系的建立及優(yōu)化:

15、 1、SYBR Green 使用濃度:太高抑制Taq酶活性，太低，熒光信號(hào)太弱，不易檢測(cè) 2、Primer：引物的特異性高，否則擴(kuò)增有雜帶，定量不準(zhǔn) 3、MgCl2的濃度:可以降低到1.5mM,以減少非特異性產(chǎn)物4、反應(yīng)Buffer 體系的優(yōu)化5、反應(yīng)溫度和時(shí)間參數(shù):由酶和引物決定 6、其他與常規(guī)PCR相同（二）應(yīng)用范圍1、起始模板的測(cè)定；2、 基因型的分析；3、 融解曲線分析：可以優(yōu)化PCR反應(yīng)的條件，對(duì)常規(guī)PCR有指導(dǎo)意義，如對(duì)primer的評(píng)價(jià)；可以區(qū)分單一引物、引物二聚體、變異產(chǎn)物、多種產(chǎn)物。（三）優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)DNA模板沒有選擇性；適用于任

16、何DNA； 使用方便；不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針；非常靈敏； 便宜。 缺點(diǎn)：容易與非特異性雙鏈DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽(yáng)性；但可以通過(guò)融解曲線的分析，優(yōu)化反應(yīng)條件；   對(duì)引物特異性要求較高。方法二：TaqMan-水解型雜交探針 *5端標(biāo)記有報(bào)告基團(tuán)(Reporter, R)  ，如FAM、VIC等 *3端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán) (Quencher, Q)* 探針完整，R所發(fā)射的熒光能量被Q基團(tuán)吸收 ，無(wú)熒光， R與Q分開，發(fā)熒光*Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探針（一）工作原理注意：每擴(kuò)增一條DNA分子，釋放一個(gè)熒光信號(hào)，可以在循環(huán)過(guò)程中任一點(diǎn)

17、檢測(cè)熒光PCR反應(yīng)的建立：1、引物、探針的設(shè)計(jì)： 探針Tm為68-70 ，<30 bp, 5不能有G，G可能會(huì)淬滅熒光素，引物盡量靠近探針，擴(kuò)增片段<400 bp，引物Tm為59-602、反應(yīng)參數(shù)的確定：一般為：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通過(guò)溫度梯度優(yōu)化退火溫度72 ，45 S，3、優(yōu)化引物和探針濃度：獲得最小Ct值，信號(hào)/背景比值的最大值  引物濃度：50-900nM 探針濃度：50-250nM4、其他與常規(guī)PCR相同（二）優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：對(duì)目標(biāo)序列的高特異性 &

18、#160;      -陰性結(jié)果確定設(shè)計(jì)相對(duì)簡(jiǎn)單       -與目標(biāo)序列某一區(qū)域互補(bǔ)重復(fù)性比較好缺點(diǎn)：只適合一個(gè)特定的目標(biāo);委托公司標(biāo)記，價(jià)格較高;不易找到本底低的探針定量PCR常見問題及對(duì)策點(diǎn)擊次數(shù)： 417  發(fā)表于：2008-07-20 19:35轉(zhuǎn)載請(qǐng)注明來(lái)自丁香園 來(lái)源：丁香園 Q1無(wú)CT值（信號(hào)）出現(xiàn)1.反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠。一般都要在35個(gè)循環(huán)以上，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)情況增加循環(huán)（如至45cycles），但高于45個(gè)循環(huán)會(huì)增加過(guò)多的背景信號(hào)。 2.檢測(cè)熒光信號(hào)的步

19、驟有誤。一般SG法采用72延伸時(shí)采集，Taqman法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸結(jié)束采集信號(hào)。 3.引物或探針降解?？赏ㄟ^(guò)PAGE電泳檢測(cè)其完整性。 4.引物或探針的設(shè)計(jì)，如探針高于引物的溫度不夠，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸的情況。 5.模板量不足。對(duì)未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起。 6.模板降解。避免樣品制備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況。 Q2CT值出現(xiàn)過(guò)晚1.擴(kuò)增效率低，反應(yīng)條件不夠優(yōu)化。設(shè)計(jì)更好的引物或探針；改用三步法進(jìn)行反應(yīng)；適當(dāng)降低退火溫度；增加鎂離子濃度等。 2.PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足。 3.PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。一般采用80-150bp的產(chǎn)物長(zhǎng)度。 Q3標(biāo)準(zhǔn)

20、曲線的線性關(guān)系不佳1.加樣存在誤差，使得標(biāo)準(zhǔn)品不呈梯度。 2.標(biāo)準(zhǔn)品出現(xiàn)降解。應(yīng)避免標(biāo)準(zhǔn)品反復(fù)凍融，或重新制備并稀釋標(biāo)準(zhǔn)品。 3.引物或探針不佳。重新設(shè)計(jì)更好的引物和探針 4模板中存在抑制物，或模板濃度過(guò)高 Q4陰性對(duì)照也出現(xiàn)明顯的起飛1.應(yīng)mix或水被污染。 2.引物二聚體的出現(xiàn)。用SG法在35cycles以后陰性出現(xiàn)起飛屬正常情況，可配合熔解曲線進(jìn)行分析。 3.反應(yīng)過(guò)程中探針的降解。用PAGE電泳對(duì)探針進(jìn)行檢測(cè)。 4.如果使用了ROX校正，則可能是ROX的降解所造成。 Q5在溶解曲線前是否插入一個(gè)同溶解程序初始溫度相同的一個(gè)保溫過(guò)程如果在熔解曲線前沒有一個(gè)保溫過(guò)程，則曲線會(huì)在前幾個(gè)循環(huán)非常

21、陡峭，使真正的熔解峰型幾乎看不到。 Q6熔解曲線不止一個(gè)主峰1引物設(shè)計(jì)不夠優(yōu)化。應(yīng)避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)的出現(xiàn)。 2.引物濃度不佳。適當(dāng)降低引物的濃度，并注意上下游引物的濃度配比。 3.鎂離子濃度過(guò)高。適當(dāng)降低鎂離子濃度，或選擇更合適的mix試劑盒。 4.模板有基因組的污染。RNA提取過(guò)程中避免DNA的引入，或通過(guò)引物設(shè)計(jì)避免非特異擴(kuò)增。Q7擴(kuò)增效率低1.反應(yīng)試劑中部分成分特別是熒光染料降解。 2.反應(yīng)條件不夠優(yōu)化，可適當(dāng)降低退火溫度或改為三步擴(kuò)增法。 3.反應(yīng)體系中有PCR反應(yīng)抑制物。一般是加入模板時(shí)所引入，應(yīng)先把模板適度稀釋，再加入反應(yīng)體系中，減少抑制物的影響。 Q8實(shí)驗(yàn)重復(fù)性不好1.加樣不準(zhǔn)確。 2.儀器在樣品上溫度條件有差異，即溫度