【定量數(shù)據(jù)分析】熒光定量PCR技術_常見問題與解答

1、螺旋課堂第一課熒光定量PCR技術PCR技術的發(fā)明極大地推動了分子生物學的發(fā)展，而且迅速被推廣和應用到生命科學的各個領域，可以說它是目前核酸分子水平的基礎及應用研究中使用最廣泛的一項技術。常規(guī)PCR中，在擴增反應結束之后，我們一般通過凝膠電泳的方法對擴增產(chǎn)物進行定性的分析，無法對PCR擴增反應進行實時檢測，也無法對起始模板準確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量，如轉基因動植物中插入某種外源基因的拷貝數(shù)或者病人中某種病毒DNA/RNA的精確copy數(shù)等，如此,熒光定量PCR技術便應運而生。本文將分為三大部分向大家介紹，首先是理論篇：首先了解熒光定量PCR的理論知識，如熒光定量PCR技術

2、的原理、方法等；隨后為實踐篇：如實驗的操作流程、注意事項、方法選擇、結果分析與處理等；第三部分為問題分析與解答篇：熒光定量PCR過程中有哪些常見問題，我們如何避免和解決。第一章理論篇一、熒光定量PCR技術發(fā)展史1993年，日本Higuchi等人首次采用動態(tài)PCR方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進行定量分析，首次提出了熒光定量PCR技術的概念。當時他使用了EB（澳乙錠）作為熒光標記染料，采用一臺經(jīng)過改良的熱循環(huán)儀，用UV射線照射樣品然后通過CCD相機檢測產(chǎn)生的熒光值，利用了PCR反應中的數(shù)學函數(shù)關系，再結合加入標準品的方法，達到了對檢測樣品進行準確定量的目的，但由于這種方法由于有著在實驗儀器資

3、金上巨大的耗費，一些非特異的PCR產(chǎn)物同樣能被檢測到并包含在被測的熒光信號值總量之中而導致定量不準確等因素，最終使這種實驗技術在當時沒能成為主流的實驗技術。1995年美國PE公司成功研制了TaqMan技術，1996年又推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強度，并使用Ct值進行分析，熒光定量PCR才很快得到大家的接受，并廣為應用。近年來，熒光定量PCR技術不斷完善，取得了突飛猛進的發(fā)展。由于其具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復性好、污染率低等優(yōu)點，而被廣泛應用于基礎科學研究、藥物研發(fā)、臨床診斷、轉基因研究、基因檢測等各個領域研究當中。二、熒光定量PCR概述1、熒光定量PC

4、R概念所謂定量PCR技術（real-timePCR）,是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過特定數(shù)學原理對未知模板進行定量分析的方法（圖1）。圖1熒光定量PCR反應原理Icytle熒光檢測元件2、熒光定量PCR與普通PCR的主要區(qū)別常規(guī)PCR中，PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳，然后進行成像分析，常規(guī)PCR只能通過終點法對擴增產(chǎn)物進行定性分析，而不能進行定量分析（圖2）;熒光定量PCR中，PCR反應體系中加入了熒光分子，通過熒光信號的變化來反應擴增產(chǎn)物的變化，使PCR產(chǎn)物的實時檢測成為可能。相對常規(guī)PCR而言，熒光定量PCR的主要優(yōu)點使準確地確定初始模版拷貝

5、數(shù)和較高的檢測靈敏度；熒光定量PCR不僅可用于定性，如判斷一段序列的有無，也可用于定量，如確定起始模版的拷貝數(shù);圖2終點法定量PCR的缺陷jflhWk.理論上PCR是一中指數(shù)增長的過程：但是實際的PCR擴增曲線并不是標至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求,準的用數(shù)曲線;而是S形曲餞。這¥因為隨著PCR循環(huán)的增多，擴增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dTP、弓I物,FPCR的效率越來啊B以后，PCR就進入了晉令期。由于各種環(huán)境因素的復雜相互作用，不同的PCRJr，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當所有的Taq酶都被飽和反應體系進入年臺加的孫機和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是

6、96次PCR重復實驗，各種條件基本一致，所得結果有很大差異（圖2）常規(guī)PCR的定量方法，測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系（圖2）,所以不能根據(jù)最終PCR產(chǎn)物的量直接計算出起始DNA拷貝數(shù)。雖然加入內標后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。而從圖2也可以看出，雖然相同模版在同一臺PCR儀上進行96次擴增,終點處檢測產(chǎn)物量不恒定，但96次PCR擴增曲線都有一個共同的拐點，即熒光定量PCR中Ct值的重現(xiàn)性，恒定的Ct值為熒光定量PCR的分析提供了理論依據(jù)。前面我們對熒光

7、定量PCR的歷史、熒光定量PCR概念和與常規(guī)PCR區(qū)別有了大致的了解，但你可能心中存在許多疑惑：什么是擴增曲線？什么是Ct值？它們有什么特點？我們如何來判定熒光定量PCR反應中的Ct值，原理是什oooooo為了使大家更好的理解、掌握熒光定量PCR技術，在介紹熒光定量PCR檢測方法、動力學原理和數(shù)據(jù)分析方法前，有必要先介紹幾個最基本的概念。3.1 3、熒光定量PCR的幾個基本概念擴增曲線為了更好的理解熒光定量PCR原理，我將用樣品擴增曲蜃來進行說明。描述PCR動態(tài)進程的曲線即擴增曲線。PCR的擴增曲紜實際上并不是一條標準的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線（圖3）。圖3中，X軸表示PCR循環(huán)%Y軸表示擴增

8、反應的熒光值，與反應管中擴增產(chǎn)物的量有比例關系。從圖3可用艮直觀的看出，熒光定量PCR擴增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段（基線期），熒光信號指數(shù)擴增階段（對數(shù)期）和平臺期。在基線期，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關系,我們可以選擇在這個階段進行定量分析。3.2 熒光閾值在介紹熒光閾值之前，先了解一下熒光本底信號（圖3）,我們一般把熒光PCR的前

9、15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline,基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。熒光閾值是在熒光擴增曲線上人為設定的一個值，它可以設定在熒光信號指數(shù)擴增階段任n意位置上，熒光域值的缺省設置是315個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍（機器自動設置）。我們在做熒光定量PCR實驗時，經(jīng)常采用手動設置，手動設置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，真正的信號是熒光信號超過域值（圖4）0圖4手工調整熒光閾值示意圖3.3 Ct值益-了解了熒光抽叱概念后，Ct值就很好理解了。C代表Cycle,t代表thr

10、eshold,所謂Ct值就是在熒光、PCR擴增過程.中，當擴增產(chǎn)物的熒光信號達到設定的閾值時所經(jīng)區(qū)的擴增循環(huán)次數(shù)。如圖3所小，黑色的線顯示的是熒光閾值，當信號超過黑色線所經(jīng)歷的循杼數(shù)即為CfSo從這也可以了解到Ct值是可以變化的，我們實驗時帶有一定4人為（素。,熒光定量PCR后面的數(shù)據(jù)處理要用到Ct值來計算，所以有關熒光閾伯設置卜顯得尤為重要。一般說來，新手按熒光PCR儀的自動設置為好，加如乂你1常有經(jīng)驗，一般會手動設置熒光閾值。因為Ct值即達到熒光閾值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)，所以它就與模版的拷貝數(shù)存在著線性關系，起始拷貝數(shù)越多，經(jīng)過的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范圍在18-3

11、0之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。前面也提到過，同一模板經(jīng)過96次PCR擴增，擴增產(chǎn)物雖然不恒定，但Ct值極具重現(xiàn)性。根據(jù)這個特點，我們可以利用已知起始拷貝數(shù)的標準樣品的Ct值做出標準曲線，只要在同一次PCR實驗中得到未知樣品的Ct值，就可以根據(jù)曲線算出該未知樣品的起始拷貝數(shù)。接下來我們就來看看通過Ct值算出拷貝數(shù)的數(shù)學原理是怎樣的：首先我們來回顧一下PCRT增原理（圖5）,從PCR原理圖中我們也可以很清楚的知道理想的PCR反應是以2n次方增長的方式擴增，即：X=X0>2n但由于PCR反應體系是一個有限的體系，也就是我們加入到PCR反應體系中的物質是有限的，例如酶、引物、Buff

12、er等，只有在對數(shù)增長期時，PCR的擴增效率才等于1,大部分時候擴增效率小于一，有時甚至等于零。因此PCR擴增的真正情況是：X=X0(1+Ex)n其中n：擴增反應的循環(huán)次數(shù)；X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X。：初始模板量；Ex：擴增效率在擴增產(chǎn)物達到閾值線時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Ct個循環(huán)，航時的產(chǎn)物量為XCt=X0(1+Ex)Ct=M其中XCt：熒光擴增信號達到閾值強度時擴增產(chǎn)物的量，在閾值線設定即它是一個常數(shù)，我們設為M,。對方程式兩邊同時取對數(shù)得10gM=logX0(1+Ex)Ct,我們對該方程式做簡單的數(shù)學運算后得到：logXo=-log(1+Ex)*Ct+logM其中M為常數(shù)，Ex為常變數(shù)，也就

13、呈說Ex在PCR反應中的某一個循環(huán)中是一個常數(shù)，但不同的循環(huán)數(shù)中，fEx的數(shù)值會發(fā)生變化?因此從上式可以推出：Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關系，N據(jù)柱品擴增達到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量。DZAHt合峰在丸樂及fPCRJObiAm以”nrrmninrrrnrrrriIII門匚IUlllI口ILinni|川口門iniJBIIIIIIIIIIIIIIIIII,A/Jfl圖5PCR原理圖.口IL通dLAiDMA*j3.4 標準曲線在絕對定量中，未知樣本的量如基因拷貝數(shù)可通過梯度稀釋的已知量的標準品的Ct值推算出。在實驗過程中，我們可以將已知濃度的標準品進行梯度稀釋個(56r稀釋梯度

14、)，將未知樣品和梯度稀釋的標準品在同一熒光PCR實驗中進行反應，將稀釋標準品得到的Ct值構建標準曲線，通過標準曲線可以推算出未知樣品的量（圖6）。標準曲線的制作不需要人工操作，由儀器自動完成。理論上，一系列稀釋樣品的擴增曲線之間有均勻的間距（圖6左），如果PCR反應呈理想的方式擴增，產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距則符合等式"2n=稀釋倍數(shù)”，n為2樣本問Ct值差。例如：10倍稀釋的樣本，2n=10,可得n=3.32,Ct值差3.32。圖6熒光定量PCR標準曲線示意圖3.5 擴增效率«、在絕對定量中，我們將已知模板稀釋成一系列濃度梯度進行熒光PCR實驗，利用拷貝數(shù)和

15、Ct值做成標準曲線，禾擁遞減的直線關系等式和相關系數(shù)（r）或可信度來計算擴增效率。1-A擴增效率與標準曲線的斜率j關，計4方程為：擴增效率（E）=10-1用率。理論上，在每個指數(shù)擴曲循環(huán)中，!PCRT物的量加倍，即PCR產(chǎn)物2倍增加，反應效率為2,擴增效率就吶2,就可得2=10-1今.標準曲線彳#斜率就為-3.32,斜率得絕對值與熒光曲線間距相同。如果將擴增效奉用0分率來表示，即:.E%=（E-1）X100%,對于理想的PCR反應lE=2,即：擴增效率E%=（2-1）X100%=100%如果E=1：9&,帶入方程（1版-1）X100%=92%,表示每個循環(huán)的終點，擴增產(chǎn)物的拷貝數(shù)增如&

16、quot;2倍，內每次循環(huán)有92%的模板被擴增。一般說來，曠增效率隹近100%是優(yōu)化的重復性好實驗的最好標志，實際操作時，反應的擴增效率應該在90%105%之間，如果擴增效率低，可能的原因是引物設計不當一或者反應條件未優(yōu)化；擴增效率大于100%時，可能的原因是系列稀釋樣品加樣錯誤，或者有非特異性產(chǎn)物擴增，如引物二聚體產(chǎn)生。用上述方法確定擴增效率時，反應體系中的抑制劑的出現(xiàn)也可能導致擴增效率明顯增加，原因是高濃度模板樣本中抑制劑的濃度低，導致反應的Ct值延遲出現(xiàn)，而低濃度模板樣本中抑制劑濃度高，反應的Ct值延遲程度小，導致斜率的絕對值以及計算所得的擴增效率會增加。如果擴增效率小于90%或大于10

17、5%,建議重新設計引物或探針。三、熒光定量PCR的方法熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量PCR的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核甘酸探針來檢測產(chǎn)物；而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行熒光定量PCR最常用的方法是DNA結合染料SYBRGreenI的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法，在這里主要介紹這2不忘法，其它方法請參考其它熒光定量PCR資料。1、

18、非特異性SYBRGreenI染料法SYBRGreenI是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料（圖7）,在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結合后，熒光大大增強（圖茍。因此RsYBRGreenI的熒光信號強度與雙鏈DNA的數(shù)量相關，可以根"熒光信司檢測出,PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBRGreenI的最大吸收可長約為497nm,發(fā)射波長最大約為520nm。熱變性引物VV箕光物質TTTT©jFF引物退火DNA聚合酹（FJFkII陰IIIIIIIII延伸反應SYBRGreenI的優(yōu)點：實驗設計簡單，僅需要設計上下游

19、一對引物，不需要設計探針，無需設計多個探針即可快速檢驗多個基因，通用性好；成本低；能夠通過溶解曲線分析檢驗擴增產(chǎn)物的特異性。因而在低通量實驗和單重實驗時一般優(yōu)先考慮使用SYBRGreenI染料法SYBRGreenI的缺點：由于SYBRGreenI與所有的雙鏈DNA相結合,因此由引物二聚體、單鏈二級結構以及錯誤的擴增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性，SYBRGreenI方法對PCR擴增特異性要求較高。實驗過程中通過熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到定量結果。另外，因為SYBRGreenI不能區(qū)分不同擴增子發(fā)出的熒光而導致它不能用于多重反應。溶解曲線分析可以用來確定不

20、同的反應產(chǎn)物，包括非特異性產(chǎn)物。擴增反應完成后，通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測每一步的熒光信號來產(chǎn)生溶解曲線，隨著反應中雙鏈DNA變性，熒光染料又回復到游離狀態(tài)導致熒光信號降低，用熒超號改變的負的一次導數(shù)與溫度作圖，在擴增產(chǎn)物的溶解溫度上有一特征峰（Tm,DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個殖征峰就可以將特異產(chǎn)物？其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開，因為它們在不同的皿溶解、（圖9）。圖9SYBRGreenI焊曾產(chǎn)物溶解曲線分析律一峰，無非籽岸性產(chǎn)I二經(jīng)小一"物，定里準確cl"?i-M_«:4iti出現(xiàn)氽峰，存在非杵洋性擴增，定位不僦病2、特異性Taqman水%探針法TaqmaL

21、熒光定重技術是以Taqman熒光探針為基礎，Taqman熒光探針為一寡核甘酸，兩端分別標記一個熒光發(fā)射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時，發(fā)射基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團和熒光淬滅基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。從而實現(xiàn)定量。當探針與靶序列配對時，熒光基團發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅基團接近而被淬滅。在進行延伸反應時，聚合酶的5'外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團與淬滅基團分離，發(fā)出熒光

22、。一分子產(chǎn)物生成伴隨一分子熒光信號產(chǎn)生（圖10）。隨著擴增產(chǎn)物的增加，熒光增強。PCR擴增程序通常將復性與延伸合二為一。常用的熒光基團是FAM,TET,VIC,HEX圖10Taqman探針工作原理fi1由于Taqman探針法中，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測目標序列，防止非特異產(chǎn)物的干擾影響定量的準確性，同時它也可以用于多重反應，但探針設計成本較高，有時探針設計困難。第二章實踐篇我們在設計實驗的時候通常對下列事情更感興趣：1）測定未知樣品的絕對量：如給定的血樣中的病毒顆粒數(shù)，食品中某一種轉基因成分的含量；2）未知樣品與已知樣品相比，基因的表達量改變了多少倍：如相當量

23、的腫瘤組織和正常組織相比，p53mRN做變了多少倍。分析這兩種假設的方法就分別叫絕對定量和相對定量。絕對定量是通過樣品的Ct值和標準曲線進行比較實現(xiàn)的。分析的結果是給定數(shù)量的樣品中（給定數(shù)量的細胞，每微克總RNA）中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）。相對定量的分析結果是在相當量的試驗組（樣品A）和對照組（樣品B）中一個靶基因的相對比率（倍數(shù)差異）。接下來我們就來看看我們在實驗過程中如何來使用絕對定量和相對定量的分析方法。一、絕對定量分析1、絕對定量分析方法的使用條件在這里我將舉例來說明我們在實驗過程中，何種實驗需要用絕對定量來進行分析。醫(yī)生對一個乙肝病人的每毫升血液中HBVDNA的精確拷貝數(shù)感興趣。首

24、先醫(yī)生要從病人血液中提取DNA,然后通過熒光定量PCR實驗來確定HBV病毒DNA的copy數(shù)。通過病人樣品的Ct值和設置梯度稀釋的已知HBV對照樣品的標準曲線進行比較，醫(yī)生就能確定病人血液中HBV病毒DNA的copy數(shù)。從這個例子，我們也可以看出，在實驗過程中，如果最終的結果是對未知樣品的定量描述，并不依賴別的樣品的性質的時候，就應該使用絕對定量進行分析。2、引物和探針的設計使用Taqman探針法要同時考慮探針和引物的質量。首先要尋找合適的探針位置，再設計引物，并使引物盡可能靠近探針。2.1 引物設計原則引物的設計大家應該非常清楚了，在這里就不再贅述，但熒光定量PCR引物的設計還是與普通PCR

25、引物設計有所差別和要求。探針設計原則探針位置盡可能地靠近上游引物，擴增片段長度在50-150bp范圍內；探針長度通常在20-30bp,Tm值在6570C,通常比引物Tm高5-10C,GC含量在40%70%。探針的5'端應避免使用堿基Go探針內部或探針與2條引物之間避免3個堿基以上的互補序列。整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。為確保引物探針的特異性，最好將設計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補區(qū)，建議重新設計引物探針。3、標準品的制作：3.1 標準品制作流程目的基因PCR擴增目的基因克隆重組質粒篩選梯度稀釋計算質粒DNA質粒DNA提取、制作標準品拷貝數(shù)重組質

26、粒鑒定.3.2 標準品拷貝數(shù)的計算待測樣本濃度（ng/ul）=OD260M0淅釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)X3243.3 待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量6X1014標準品的梯度稀釋：1v原液（標準品i）+9v稀釋緩沖液，得標準品ii1v標準品ii+9v稀釋緩沖液，得標準品iii1v標準品iii+9v稀釋緩沖液，得標準品iv1v標準品iv+9v稀釋緩沖液，得標準品v注意：稀釋的時候，1v體積不要只加1ul,體積最好加大，如10ul,這樣有助于保證標準品稀釋是土一的10倍梯度.4、熒光定量PCR模板的制備請查閱DNA/RNA提取、逆轉錄的相關資料。5、熒光定量PCR體系

27、準備PCR條件摸索：不加探針的常規(guī)PCR反應，驗證引物是否合適、模板是否降解、模板純度是否合適。同時確定最佳反應體系和反應條件。由于當前大部分實驗為使用mix,所以只用摸索模板、引物條件即可。模板濃度：如果是首次實驗，那么應選擇一系列稀釋濃度的模板來進行實驗條件摸索，以選擇出最合適的模板濃度，條件困難時，也至少要選擇兩個稀釋度（高或中、低濃度）來進行實驗。一般而言，Ct值在15-30范圍內比較合適，若大于30則應加大模板使用量，如果Ct小于15則應對模板進行稀釋后再進行實驗。引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應的關鍵因素，若濃度太低，會致使反應不完全，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異

28、的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應，可在0.1-1.0UM之間進行選擇，直至得到滿意的結果。探針濃度：初次實驗每個探針用0.2uM,如果信號強度達不到要求，可以適當增加至0.4uM將已知濃度的HBV陽性標準品做系列濃度稀釋，分別含有5X103、5X104、5X105、5X106copies/m|建立20ul反應體系（參照優(yōu)化體£）,3次重復（熒光PCR一般進行3次以上重復，有的甚至達到了6次以上重復）。以某病人的血液提取的HBV病毒DNA為模板，建立20ul熒光處吹PCR反應體系（參照優(yōu)化體系），每個樣品3次重復，同時設置不加模板的陰，N照。6、熒光定量PCR體系配制及儀

29、器程序設置請參照各公司熒光定量PCR試劑、熒光定量PCR儀器說明書進行。7、實驗結果與數(shù)據(jù)處理一JrPCR反應結束后，得到如下數(shù)據(jù)：copies/mlCt1Ct24MeanCt5X10327.61.27.58/(27.8427.676675X10424.2524.4224.5524.406675X10521.1121.0421.1621.103335X10618.0518.0618.2118.10667BLANKNoneNoneNone-iSTD0.130.080.060.08注：平行樣的Ct：叱間的差0.51用表示重復性較好0.05(slope)o相關sample23.2523.4623.3

30、923.36667系數(shù)反映標準曲線的直線性，理想值應大于0.98,越接近1說明直線性越好，定量越準確。斜率反映PCIT增效率（E）,理想的PCIT增效率在90%105%之問，如果PCfT增效率低，必須重新設計引物或探針；如果擴增效率高于理想值，可能是系列稀釋樣品加樣錯誤，或者非特異性產(chǎn)物擴增，或反應體系中可能存在著對反轉錄反應或PC岐應阻害的物質，需要相應的解決辦法。從標準曲線可以看出：r2=0.9995,大于0.98,標準差都在0.2范圍內，而E=101/-3.2013=2.04,擴增效率=（2.04-1）X100%=104%,表示定量準確，可將未知樣品的Ct值帶入方程：23.36667=-

31、3.2013X+30.827可得X=2.33所以copies=（5X104/2）乂2.33=5.825x104但我們需要注意的是，標準曲線只可能用于推算稀釋梯度范圍內的未知樣本的量，而不能外推稀釋梯度外的未知樣本的含量。所以，我們在實驗過程中盡可能使未知樣品的濃度在標準品的稀釋范圍內。二、相對定量分析1、相對定量分析方法的使用條件同絕對定量分析類似，我將舉例來說明我們在實驗過程中何種實驗需要用相對定量來進行分析。我們如果想知道經(jīng)過藥物處理過的組織和未處理的組織中某一目的基因的表達水平是否有差異，相差多少倍？我們可以選擇以下2種方式：1）我們可以從等量的2種組織中提取RNA,分別進行目的基因的反

32、轉錄特異性熒光定量PCR實驗來確定目的基因在2種組織中的表達量，結果可以反映等量的2種組織中目的基因表達量的比率。2）如果我們之前已經(jīng)確定2種組織中看家基因如GAPDH的表達量相等，那么，我們就可以從大約等量（不需要等量）的2種組織中分別提取RNA,通過RT-qPCR實驗來確定2種組織中目的基因和看見基因的表達水平。藥物處理組織的目的基因的表達量可由2種組織中看家基因和未處理組織中目的基因的表達量共同來確定。2種分析方法的差異就在于用的標準有所不同，方法1）中的標準是2種組織的量相等；方法2）中的標準是2種組織中看家基因如GAPDH的表達量恒定不變；2、相對定量數(shù)據(jù)處理方法：對于不同的實驗需求

33、，我們可以采用不同的方法進行實驗設計和數(shù)據(jù)分析，一般常用的方法有雙標準曲線法、Ct、2-MCt、用參照基因的Ct法和Pfaffi法，應用每種方法都有適應條件。如為檢測A基因在某因子干預下的表達，我們得到一組數(shù)據(jù)見下表：待測基因（Ct值）參照基因（Ct值）待測基因擴增效率（E）參照基因擴增效率（E）干預前ABCD干預后EFCD根據(jù)實驗要求我們可以選擇相應的方法，如下表:數(shù)據(jù)處理方法經(jīng)巧條件計算方法Ct法擴增效率為100%,僅需目標基因即可表達水平=2-Ct=24）目的基因和參照基因打增效率都接近100%,且相AACt表達水平=2-=2-(E-F)-(A-B)表達水平=2(f-b)-(e-a)表達

34、水平=c(a-e)/d(f-b)對偏差不超過|5%,需要目標基因和參照基因。|參照基因的CtPfaffi法同2目標基因和參照基因打增效率不同，但目標基因間的擴增效率相同，需目標基因和參照基因，以及擴增效率。而目前相對定量普遍采用操作簡便的2一"Ct分析方法，下面就以此分析方法為例進行分析，應用SYBRGreen方法對不同樣本問X基因表達分析的詳啟明和舉例。3、引物的設計在這里不再贅述，但需要提醒大家再設計擴增片段長度時，最好在100-200bp范圍內，在這范圍內，擴增片段越短，有效擴增反應越容易實現(xiàn)，同時較短的擴增片段也可保證分析的一致性。4、模板的制備請查閱DNA/RNA提取、逆轉

35、錄的相關資料。5、PCR體系準備PCR條件摸索：同絕對定量分析條件摸索，只是值得注意的是由于SYBR染料法對引物要求要比探針法高，在熒光定量實驗前，我們可通過普通PCR實驗來評價引物質量。以RT-PCR獲得的cDNA為模板，建立20ul熒光定量PCR反應體系，每個樣品6次重復（藥物處理和未處理）,對X基因和GAPDH基因進行擴增，同時設置不加模板的陰性對照。6、熒光定量PCR體系配制及儀器程序設置請參照各公司熒光定量PCR試劑、熒光定量PCR儀器說明書進行。7、實驗結果與數(shù)據(jù)處理7.1 溶解曲線繪制與分析SYBRGreen染料沒有序列特異性，可以結合到包括非特異產(chǎn)物和引物二聚體在內的任何dsD

36、NA上，因此有必要區(qū)分目標信號和假信號。內嵌染料可以在反應末尾對擴增產(chǎn)物進行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點，實時儀器連續(xù)監(jiān)測每個樣品的熒光值。基于產(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴增產(chǎn)物會在不同的溫度點解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈，可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進行微分可以計算出溶解峰。溶解峰反映了反應中擴增到的產(chǎn)物。這些峰與凝膠電泳中條帶類似。熔解曲線的設置是在整個PCR完成后進行，從60c升至95C,每升高1C儀器會自動收集熒光信號，得到的熔解曲線是逐漸下降的過程，且在Tm值下降最快，為方便分析，我們將溫度與熒光強度的變化求

37、導，即得到單峰的熔解曲線，這樣我們就可以證明引物的特異性良好，實驗結果不受非特異性擴增和引物二聚體的干擾。7.2數(shù)據(jù)處理樣品未處理樣品藥物處理樣品BLANKCt值MeanCt6.1820.124.06NNonefNone24.18120.34基因MeanftGAPDHCt2-"Ct26.52-2.124.35下面我們來看看上面表格中差異倍數(shù)是如何得來的：首先，分別求出6個重復樣品X基因和GAPDH基因平均Ct值后，應用參照基因GAPDH對未處理樣品和藥物處理樣品進行校正： Ct（未處理樣品）=X基因MeanCt值一GAPDH基因MeanCt值=26.5220.34=6.18 Ct（藥

38、物處理樣品）=X基因MeanCt值一GAPDH基因MeanCt值=24.1820.12=4.06然后，對未處理樣品和藥物處理樣品的Ct進行歸一化:Ct=zCt（藥物處理樣品）-ACt（未處理樣品）=4.06-6.18=-2.12最后，我們就可以根據(jù)Ct算出藥物處理樣品與未處理樣品問X基因的表達差異:2-Ct=2（2.12）=4.35量達表對相未處理樣品:藥物處理樣品一樣品名稱翼因此藥物處理樣本的X基因的表達水平是未處理樣品的14.35倍此結果是通過參照基因表達水平校正的待測樣本中的目標基因相對于校準樣本，用參照基因校準目標基因表達的目的是彌補樣本組織量的差異。為了更直觀的表示樣品間的表達差異，

39、最后我們可以將計算得到的相對量用圖表來表示，如下圖：<K54.543.532.521.510.50。法的修工如果目標基因可蓊照基因有相同的擴平效率，但擴增效率不等于2,那么,廣C法的公式可以修房用家際擴增效率.代替等式中的2。例如，如果目標基因后參照基因的,增效率都匯上1.98,計算公式可以修正為1.98-"Ct。第三章常見問題與解答篇一、無Ct值（信號）出現(xiàn)1、反應循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號；2、檢測熒光信號的步驟有誤：一般采用72c延伸時采集熒光，Taqman方法則一般在退火結束或延伸結束采集信號；3、引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；4、探針設計不佳：設計探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸；5、模板量少：對未知濃度的樣品應從系列稀釋樣品的最高濃度做起；6、模板降解：避免樣