【定量數(shù)據(jù)分析】熒光定量PCR技術(shù)_常見問題與解答

1、螺旋課堂第一課熒光定量PCR技術(shù)PCR技術(shù)的發(fā)明極大地推動了分子生物學(xué)的發(fā)展，而且迅速被推廣和應(yīng)用到生命科學(xué)的各個領(lǐng)域，可以說它是目前核酸分子水平的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究中使用最廣泛的一項技術(shù)。常規(guī)PCR中，在擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束之后，我們一般通過凝膠電泳的方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性的分析，無法對PCR擴(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實時檢測，也無法對起始模板準(zhǔn)確定量，而很多情況下，我們所感興趣的是起始模板量，如轉(zhuǎn)基因動植物中插入某種外源基因的拷貝數(shù)或者病人中某種病毒DNA/RNA的精確copy數(shù)等，如此,熒光定量PCR技術(shù)便應(yīng)運(yùn)而生。本文將分為三大部分向大家介紹，首先是理論篇：首先了解熒光定量PCR的理論知識，如熒光定量PCR技術(shù)

2、的原理、方法等；隨后為實踐篇：如實驗的操作流程、注意事項、方法選擇、結(jié)果分析與處理等；第三部分為問題分析與解答篇：熒光定量PCR過程中有哪些常見問題，我們?nèi)绾伪苊夂徒鉀Q。第一章理論篇一、熒光定量PCR技術(shù)發(fā)展史1993年，日本Higuchi等人首次采用動態(tài)PCR方法和封閉式檢測方式對目的核酸數(shù)量進(jìn)行定量分析，首次提出了熒光定量PCR技術(shù)的概念。當(dāng)時他使用了EB（澳乙錠）作為熒光標(biāo)記染料，采用一臺經(jīng)過改良的熱循環(huán)儀，用UV射線照射樣品然后通過CCD相機(jī)檢測產(chǎn)生的熒光值，利用了PCR反應(yīng)中的數(shù)學(xué)函數(shù)關(guān)系，再結(jié)合加入標(biāo)準(zhǔn)品的方法，達(dá)到了對檢測樣品進(jìn)行準(zhǔn)確定量的目的，但由于這種方法由于有著在實驗儀器資

3、金上巨大的耗費(fèi)，一些非特異的PCR產(chǎn)物同樣能被檢測到并包含在被測的熒光信號值總量之中而導(dǎo)致定量不準(zhǔn)確等因素，最終使這種實驗技術(shù)在當(dāng)時沒能成為主流的實驗技術(shù)。1995年美國PE公司成功研制了TaqMan技術(shù)，1996年又推出了首臺熒光定量PCR檢測系統(tǒng)，通過檢測每個循環(huán)的熒光強(qiáng)度，并使用Ct值進(jìn)行分析，熒光定量PCR才很快得到大家的接受，并廣為應(yīng)用。近年來，熒光定量PCR技術(shù)不斷完善，取得了突飛猛進(jìn)的發(fā)展。由于其具有操作簡單、快速方便、靈敏度高、重復(fù)性好、污染率低等優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于基礎(chǔ)科學(xué)研究、藥物研發(fā)、臨床診斷、轉(zhuǎn)基因研究、基因檢測等各個領(lǐng)域研究當(dāng)中。二、熒光定量PCR概述1、熒光定量PC

4、R概念所謂定量PCR技術(shù)（real-timePCR）,是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號累積實時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過特定數(shù)學(xué)原理對未知模板進(jìn)行定量分析的方法（圖1）。圖1熒光定量PCR反應(yīng)原理Icytle熒光檢測元件2、熒光定量PCR與普通PCR的主要區(qū)別常規(guī)PCR中，PCR產(chǎn)物通過凝膠電泳，然后進(jìn)行成像分析，常規(guī)PCR只能通過終點(diǎn)法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行定性分析，而不能進(jìn)行定量分析（圖2）;熒光定量PCR中，PCR反應(yīng)體系中加入了熒光分子，通過熒光信號的變化來反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物的變化，使PCR產(chǎn)物的實時檢測成為可能。相對常規(guī)PCR而言，熒光定量PCR的主要優(yōu)點(diǎn)使準(zhǔn)確地確定初始模版拷貝

5、數(shù)和較高的檢測靈敏度；熒光定量PCR不僅可用于定性，如判斷一段序列的有無，也可用于定量，如確定起始模版的拷貝數(shù);圖2終點(diǎn)法定量PCR的缺陷jflhWk.理論上PCR是一中指數(shù)增長的過程：但是實際的PCR擴(kuò)增曲線并不是標(biāo)至DNA模板等各種PCR要素逐漸不敷需求,準(zhǔn)的用數(shù)曲線;而是S形曲餞。這¥因為隨著PCR循環(huán)的增多，擴(kuò)增規(guī)模迅速增大，Taq酶、dTP、弓I物,FPCR的效率越來啊B以后，PCR就進(jìn)入了晉令期。由于各種環(huán)境因素的復(fù)雜相互作用，不同的PCRJr，產(chǎn)物增長的速度就逐漸減緩。當(dāng)所有的Taq酶都被飽和反應(yīng)體系進(jìn)入年臺加的孫機(jī)和平臺期的高低都有很大變化，難以精確控制。所以，即使是

6、96次PCR重復(fù)實驗，各種條件基本一致，所得結(jié)果有很大差異（圖2）常規(guī)PCR的定量方法，測定的都是PCR的終產(chǎn)物，而不是起始DNA拷貝數(shù)。由于PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系（圖2）,所以不能根據(jù)最終PCR產(chǎn)物的量直接計算出起始DNA拷貝數(shù)。雖然加入內(nèi)標(biāo)后，可部分消除終產(chǎn)物定量所造成的不準(zhǔn)確性。但即使如此，傳統(tǒng)的定量方法也都只能算作半定量、粗略定量的方法。而從圖2也可以看出，雖然相同模版在同一臺PCR儀上進(jìn)行96次擴(kuò)增,終點(diǎn)處檢測產(chǎn)物量不恒定，但96次PCR擴(kuò)增曲線都有一個共同的拐點(diǎn)，即熒光定量PCR中Ct值的重現(xiàn)性，恒定的Ct值為熒光定量PCR的分析提供了理論依據(jù)。前面我們對熒光

7、定量PCR的歷史、熒光定量PCR概念和與常規(guī)PCR區(qū)別有了大致的了解，但你可能心中存在許多疑惑：什么是擴(kuò)增曲線？什么是Ct值？它們有什么特點(diǎn)？我們?nèi)绾蝸砼卸晒舛縋CR反應(yīng)中的Ct值，原理是什oooooo為了使大家更好的理解、掌握熒光定量PCR技術(shù)，在介紹熒光定量PCR檢測方法、動力學(xué)原理和數(shù)據(jù)分析方法前，有必要先介紹幾個最基本的概念。3.1 3、熒光定量PCR的幾個基本概念擴(kuò)增曲線為了更好的理解熒光定量PCR原理，我將用樣品擴(kuò)增曲蜃來進(jìn)行說明。描述PCR動態(tài)進(jìn)程的曲線即擴(kuò)增曲線。PCR的擴(kuò)增曲紜實際上并不是一條標(biāo)準(zhǔn)的指數(shù)曲線，而是呈S型曲線（圖3）。圖3中，X軸表示PCR循環(huán)%Y軸表示擴(kuò)增

8、反應(yīng)的熒光值，與反應(yīng)管中擴(kuò)增產(chǎn)物的量有比例關(guān)系。從圖3可用艮直觀的看出，熒光定量PCR擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段（基線期），熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段（對數(shù)期）和平臺期。在基線期，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。PCR的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的PCR產(chǎn)物量不能計算出起始DNA拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段，PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系,我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。3.2 熒光閾值在介紹熒光閾值之前，先了解一下熒光本底信號（圖3）,我們一般把熒光PCR的前

9、15個循環(huán)信號作為熒光本底信號（baseline,基線期），即樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋。熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個值，它可以設(shè)定在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段任n意位置上，熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍（機(jī)器自動設(shè)置）。我們在做熒光定量PCR實驗時，經(jīng)常采用手動設(shè)置，手動設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進(jìn)入指數(shù)期的最初階段，真正的信號是熒光信號超過域值（圖4）0圖4手工調(diào)整熒光閾值示意圖3.3 Ct值益-了解了熒光抽叱概念后，Ct值就很好理解了。C代表Cycle,t代表thr

10、eshold,所謂Ct值就是在熒光、PCR擴(kuò)增過程.中，當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)區(qū)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)。如圖3所小，黑色的線顯示的是熒光閾值，當(dāng)信號超過黑色線所經(jīng)歷的循杼數(shù)即為CfSo從這也可以了解到Ct值是可以變化的，我們實驗時帶有一定4人為（素。,熒光定量PCR后面的數(shù)據(jù)處理要用到Ct值來計算，所以有關(guān)熒光閾伯設(shè)置卜顯得尤為重要。一般說來，新手按熒光PCR儀的自動設(shè)置為好，加如乂你1常有經(jīng)驗，一般會手動設(shè)置熒光閾值。因為Ct值即達(dá)到熒光閾值所經(jīng)過的循環(huán)數(shù)，所以它就與模版的拷貝數(shù)存在著線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，經(jīng)過的循環(huán)數(shù)就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范圍在18-3

11、0之間，過大和過小都將影響實驗數(shù)據(jù)的精度。前面也提到過，同一模板經(jīng)過96次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物雖然不恒定，但Ct值極具重現(xiàn)性。根據(jù)這個特點(diǎn)，我們可以利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)樣品的Ct值做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，只要在同一次PCR實驗中得到未知樣品的Ct值，就可以根據(jù)曲線算出該未知樣品的起始拷貝數(shù)。接下來我們就來看看通過Ct值算出拷貝數(shù)的數(shù)學(xué)原理是怎樣的：首先我們來回顧一下PCRT增原理（圖5）,從PCR原理圖中我們也可以很清楚的知道理想的PCR反應(yīng)是以2n次方增長的方式擴(kuò)增，即：X=X0>2n但由于PCR反應(yīng)體系是一個有限的體系，也就是我們加入到PCR反應(yīng)體系中的物質(zhì)是有限的，例如酶、引物、Buff

12、er等，只有在對數(shù)增長期時，PCR的擴(kuò)增效率才等于1,大部分時候擴(kuò)增效率小于一，有時甚至等于零。因此PCR擴(kuò)增的真正情況是：X=X0(1+Ex)n其中n：擴(kuò)增反應(yīng)的循環(huán)次數(shù)；X：第n次循環(huán)后的產(chǎn)物量X。：初始模板量；Ex：擴(kuò)增效率在擴(kuò)增產(chǎn)物達(dá)到閾值線時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)為Ct個循環(huán)，航時的產(chǎn)物量為XCt=X0(1+Ex)Ct=M其中XCt：熒光擴(kuò)增信號達(dá)到閾值強(qiáng)度時擴(kuò)增產(chǎn)物的量，在閾值線設(shè)定即它是一個常數(shù)，我們設(shè)為M,。對方程式兩邊同時取對數(shù)得10gM=logX0(1+Ex)Ct,我們對該方程式做簡單的數(shù)學(xué)運(yùn)算后得到：logXo=-log(1+Ex)*Ct+logM其中M為常數(shù)，Ex為常變數(shù)，也就

13、呈說Ex在PCR反應(yīng)中的某一個循環(huán)中是一個常數(shù)，但不同的循環(huán)數(shù)中，fEx的數(shù)值會發(fā)生變化?因此從上式可以推出：Log濃度與循環(huán)數(shù)呈線性關(guān)系，N據(jù)柱品擴(kuò)增達(dá)到域值的循環(huán)數(shù)即Ct值就可計算出樣品中所含的模板量。DZAHt合峰在丸樂及fPCRJObiAm以”nrrmninrrrnrrrriIII門匚IUlllI口ILinni|川口門iniJBIIIIIIIIIIIIIIIIII,A/Jfl圖5PCR原理圖.口IL通dLAiDMA*j3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線在絕對定量中，未知樣本的量如基因拷貝數(shù)可通過梯度稀釋的已知量的標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值推算出。在實驗過程中，我們可以將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋個(56r稀釋梯度

14、)，將未知樣品和梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品在同一熒光PCR實驗中進(jìn)行反應(yīng)，將稀釋標(biāo)準(zhǔn)品得到的Ct值構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可以推算出未知樣品的量（圖6）。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作不需要人工操作，由儀器自動完成。理論上，一系列稀釋樣品的擴(kuò)增曲線之間有均勻的間距（圖6左），如果PCR反應(yīng)呈理想的方式擴(kuò)增，產(chǎn)物在每一循環(huán)都加倍，熒光曲線之間的間距則符合等式"2n=稀釋倍數(shù)”，n為2樣本問Ct值差。例如：10倍稀釋的樣本，2n=10,可得n=3.32,Ct值差3.32。圖6熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線示意圖3.5 擴(kuò)增效率«、在絕對定量中，我們將已知模板稀釋成一系列濃度梯度進(jìn)行熒光PCR實驗，利用拷貝數(shù)和

15、Ct值做成標(biāo)準(zhǔn)曲線，禾擁遞減的直線關(guān)系等式和相關(guān)系數(shù)（r）或可信度來計算擴(kuò)增效率。1-A擴(kuò)增效率與標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率j關(guān)，計4方程為：擴(kuò)增效率（E）=10-1用率。理論上，在每個指數(shù)擴(kuò)曲循環(huán)中，!PCRT物的量加倍，即PCR產(chǎn)物2倍增加，反應(yīng)效率為2,擴(kuò)增效率就吶2,就可得2=10-1今.標(biāo)準(zhǔn)曲線彳#斜率就為-3.32,斜率得絕對值與熒光曲線間距相同。如果將擴(kuò)增效奉用0分率來表示，即:.E%=（E-1）X100%,對于理想的PCR反應(yīng)lE=2,即：擴(kuò)增效率E%=（2-1）X100%=100%如果E=1：9&,帶入方程（1版-1）X100%=92%,表示每個循環(huán)的終點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物的拷貝數(shù)增如&

16、quot;2倍，內(nèi)每次循環(huán)有92%的模板被擴(kuò)增。一般說來，曠增效率隹近100%是優(yōu)化的重復(fù)性好實驗的最好標(biāo)志，實際操作時，反應(yīng)的擴(kuò)增效率應(yīng)該在90%105%之間，如果擴(kuò)增效率低，可能的原因是引物設(shè)計不當(dāng)一或者反應(yīng)條件未優(yōu)化；擴(kuò)增效率大于100%時，可能的原因是系列稀釋樣品加樣錯誤，或者有非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，如引物二聚體產(chǎn)生。用上述方法確定擴(kuò)增效率時，反應(yīng)體系中的抑制劑的出現(xiàn)也可能導(dǎo)致擴(kuò)增效率明顯增加，原因是高濃度模板樣本中抑制劑的濃度低，導(dǎo)致反應(yīng)的Ct值延遲出現(xiàn)，而低濃度模板樣本中抑制劑濃度高，反應(yīng)的Ct值延遲程度小，導(dǎo)致斜率的絕對值以及計算所得的擴(kuò)增效率會增加。如果擴(kuò)增效率小于90%或大于10

17、5%,建議重新設(shè)計引物或探針。三、熒光定量PCR的方法熒光定量PCR所使用的熒光化學(xué)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。而熒光定量PCR的方法相應(yīng)的可分為特異類和非特異類兩類，特異性檢測方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核甘酸探針來檢測產(chǎn)物；而非特異性檢測方法是在在PCR反應(yīng)體系中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟，特異性更高，但后者則簡便易行熒光定量PCR最常用的方法是DNA結(jié)合染料SYBRGreenI的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法，在這里主要介紹這2不忘法，其它方法請參考其它熒光定量PCR資料。1、

18、非特異性SYBRGreenI染料法SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長的染料（圖7）,在游離狀態(tài)下，SYBRGreenI發(fā)出微弱的熒光，但一旦與雙鏈DNA結(jié)合后，熒光大大增強(qiáng)（圖茍。因此RsYBRGreenI的熒光信號強(qiáng)度與雙鏈DNA的數(shù)量相關(guān)，可以根"熒光信司檢測出,PCR體系存在的雙鏈DNA數(shù)量。SYBRGreenI的最大吸收可長約為497nm,發(fā)射波長最大約為520nm。熱變性引物VV箕光物質(zhì)TTTT©jFF引物退火DNA聚合酹（FJFkII陰IIIIIIIII延伸反應(yīng)SYBRGreenI的優(yōu)點(diǎn)：實驗設(shè)計簡單，僅需要設(shè)計上下游

19、一對引物，不需要設(shè)計探針，無需設(shè)計多個探針即可快速檢驗多個基因，通用性好；成本低；能夠通過溶解曲線分析檢驗擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性。因而在低通量實驗和單重實驗時一般優(yōu)先考慮使用SYBRGreenI染料法SYBRGreenI的缺點(diǎn)：由于SYBRGreenI與所有的雙鏈DNA相結(jié)合,因此由引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性，SYBRGreenI方法對PCR擴(kuò)增特異性要求較高。實驗過程中通過熔解曲線來分析產(chǎn)物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到定量結(jié)果。另外，因為SYBRGreenI不能區(qū)分不同擴(kuò)增子發(fā)出的熒光而導(dǎo)致它不能用于多重反應(yīng)。溶解曲線分析可以用來確定不

20、同的反應(yīng)產(chǎn)物，包括非特異性產(chǎn)物。擴(kuò)增反應(yīng)完成后，通過逐漸增加溫度同時監(jiān)測每一步的熒光信號來產(chǎn)生溶解曲線，隨著反應(yīng)中雙鏈DNA變性，熒光染料又回復(fù)到游離狀態(tài)導(dǎo)致熒光信號降低，用熒超號改變的負(fù)的一次導(dǎo)數(shù)與溫度作圖，在擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度上有一特征峰（Tm,DNA雙鏈解鏈50%的溫度），用這個殖征峰就可以將特異產(chǎn)物？其它產(chǎn)物如引物二聚體區(qū)分開，因為它們在不同的皿溶解、（圖9）。圖9SYBRGreenI焊曾產(chǎn)物溶解曲線分析律一峰，無非籽岸性產(chǎn)I二經(jīng)小一"物，定里準(zhǔn)確cl"?i-M_«:4iti出現(xiàn)氽峰，存在非杵洋性擴(kuò)增，定位不僦病2、特異性Taqman水%探針法TaqmaL

21、熒光定重技術(shù)是以Taqman熒光探針為基礎(chǔ)，Taqman熒光探針為一寡核甘酸，兩端分別標(biāo)記一個熒光發(fā)射基團(tuán)和一個熒光淬滅基團(tuán)。探針完整時，發(fā)射基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'3'外切酶活性將探針酶切降解，使熒光發(fā)射基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。從而實現(xiàn)定量。當(dāng)探針與靶序列配對時，熒光基團(tuán)發(fā)射的熒光因與3'端的淬滅基團(tuán)接近而被淬滅。在進(jìn)行延伸反應(yīng)時，聚合酶的5'外切酶活性將探針切斷，使得熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光

22、。一分子產(chǎn)物生成伴隨一分子熒光信號產(chǎn)生（圖10）。隨著擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，熒光增強(qiáng)。PCR擴(kuò)增程序通常將復(fù)性與延伸合二為一。常用的熒光基團(tuán)是FAM,TET,VIC,HEX圖10Taqman探針工作原理fi1由于Taqman探針法中，除引物外，還使用了一條特異的探針，因此此方法可以特異的檢測目標(biāo)序列，防止非特異產(chǎn)物的干擾影響定量的準(zhǔn)確性，同時它也可以用于多重反應(yīng)，但探針設(shè)計成本較高，有時探針設(shè)計困難。第二章實踐篇我們在設(shè)計實驗的時候通常對下列事情更感興趣：1）測定未知樣品的絕對量：如給定的血樣中的病毒顆粒數(shù)，食品中某一種轉(zhuǎn)基因成分的含量；2）未知樣品與已知樣品相比，基因的表達(dá)量改變了多少倍：如相當(dāng)量

23、的腫瘤組織和正常組織相比，p53mRN做變了多少倍。分析這兩種假設(shè)的方法就分別叫絕對定量和相對定量。絕對定量是通過樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較實現(xiàn)的。分析的結(jié)果是給定數(shù)量的樣品中（給定數(shù)量的細(xì)胞，每微克總RNA）中核酸的量（拷貝數(shù)、微克）。相對定量的分析結(jié)果是在相當(dāng)量的試驗組（樣品A）和對照組（樣品B）中一個靶基因的相對比率（倍數(shù)差異）。接下來我們就來看看我們在實驗過程中如何來使用絕對定量和相對定量的分析方法。一、絕對定量分析1、絕對定量分析方法的使用條件在這里我將舉例來說明我們在實驗過程中，何種實驗需要用絕對定量來進(jìn)行分析。醫(yī)生對一個乙肝病人的每毫升血液中HBVDNA的精確拷貝數(shù)感興趣。首

24、先醫(yī)生要從病人血液中提取DNA,然后通過熒光定量PCR實驗來確定HBV病毒DNA的copy數(shù)。通過病人樣品的Ct值和設(shè)置梯度稀釋的已知HBV對照樣品的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，醫(yī)生就能確定病人血液中HBV病毒DNA的copy數(shù)。從這個例子，我們也可以看出，在實驗過程中，如果最終的結(jié)果是對未知樣品的定量描述，并不依賴別的樣品的性質(zhì)的時候，就應(yīng)該使用絕對定量進(jìn)行分析。2、引物和探針的設(shè)計使用Taqman探針法要同時考慮探針和引物的質(zhì)量。首先要尋找合適的探針位置，再設(shè)計引物，并使引物盡可能靠近探針。2.1 引物設(shè)計原則引物的設(shè)計大家應(yīng)該非常清楚了，在這里就不再贅述，但熒光定量PCR引物的設(shè)計還是與普通PCR

25、引物設(shè)計有所差別和要求。探針設(shè)計原則探針位置盡可能地靠近上游引物，擴(kuò)增片段長度在50-150bp范圍內(nèi)；探針長度通常在20-30bp,Tm值在6570C,通常比引物Tm高5-10C,GC含量在40%70%。探針的5'端應(yīng)避免使用堿基Go探針內(nèi)部或探針與2條引物之間避免3個堿基以上的互補(bǔ)序列。整條探針中，堿基C的含量要明顯高于G的含量。為確保引物探針的特異性，最好將設(shè)計好的序列在blast中核實一次，如果發(fā)現(xiàn)有非特異性互補(bǔ)區(qū)，建議重新設(shè)計引物探針。3、標(biāo)準(zhǔn)品的制作：3.1 標(biāo)準(zhǔn)品制作流程目的基因PCR擴(kuò)增目的基因克隆重組質(zhì)粒篩選梯度稀釋計算質(zhì)粒DNA質(zhì)粒DNA提取、制作標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)重組質(zhì)

26、粒鑒定.3.2 標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)的計算待測樣本濃度（ng/ul）=OD260M0淅釋倍數(shù)樣本分子量=堿基數(shù)X3243.3 待測樣本拷貝數(shù)（copies/ul）=待測樣本濃度/樣本分子量6X1014標(biāo)準(zhǔn)品的梯度稀釋：1v原液（標(biāo)準(zhǔn)品i）+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品ii1v標(biāo)準(zhǔn)品ii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iii1v標(biāo)準(zhǔn)品iii+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品iv1v標(biāo)準(zhǔn)品iv+9v稀釋緩沖液，得標(biāo)準(zhǔn)品v注意：稀釋的時候，1v體積不要只加1ul,體積最好加大，如10ul,這樣有助于保證標(biāo)準(zhǔn)品稀釋是土一的10倍梯度.4、熒光定量PCR模板的制備請查閱DNA/RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄的相關(guān)資料。5、熒光定量PCR體系

27、準(zhǔn)備PCR條件摸索：不加探針的常規(guī)PCR反應(yīng)，驗證引物是否合適、模板是否降解、模板純度是否合適。同時確定最佳反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。由于當(dāng)前大部分實驗為使用mix,所以只用摸索模板、引物條件即可。模板濃度：如果是首次實驗，那么應(yīng)選擇一系列稀釋濃度的模板來進(jìn)行實驗條件摸索，以選擇出最合適的模板濃度，條件困難時，也至少要選擇兩個稀釋度（高或中、低濃度）來進(jìn)行實驗。一般而言，Ct值在15-30范圍內(nèi)比較合適，若大于30則應(yīng)加大模板使用量，如果Ct小于15則應(yīng)對模板進(jìn)行稀釋后再進(jìn)行實驗。引物的濃度：引物的濃度是一個影響PCR反應(yīng)的關(guān)鍵因素，若濃度太低，會致使反應(yīng)不完全，若引物太多，則發(fā)生錯配以及產(chǎn)生非特異

28、的產(chǎn)物的可能性會大大增加。對于大多數(shù)PCR反應(yīng)，可在0.1-1.0UM之間進(jìn)行選擇，直至得到滿意的結(jié)果。探針濃度：初次實驗每個探針用0.2uM,如果信號強(qiáng)度達(dá)不到要求，可以適當(dāng)增加至0.4uM將已知濃度的HBV陽性標(biāo)準(zhǔn)品做系列濃度稀釋，分別含有5X103、5X104、5X105、5X106copies/m|建立20ul反應(yīng)體系（參照優(yōu)化體£）,3次重復(fù)（熒光PCR一般進(jìn)行3次以上重復(fù)，有的甚至達(dá)到了6次以上重復(fù)）。以某病人的血液提取的HBV病毒DNA為模板，建立20ul熒光處吹PCR反應(yīng)體系（參照優(yōu)化體系），每個樣品3次重復(fù)，同時設(shè)置不加模板的陰，N照。6、熒光定量PCR體系配制及儀

29、器程序設(shè)置請參照各公司熒光定量PCR試劑、熒光定量PCR儀器說明書進(jìn)行。7、實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)處理一JrPCR反應(yīng)結(jié)束后，得到如下數(shù)據(jù)：copies/mlCt1Ct24MeanCt5X10327.61.27.58/(27.8427.676675X10424.2524.4224.5524.406675X10521.1121.0421.1621.103335X10618.0518.0618.2118.10667BLANKNoneNoneNone-iSTD0.130.080.060.08注：平行樣的Ct：叱間的差0.51用表示重復(fù)性較好0.05(slope)o相關(guān)sample23.2523.4623.3

30、923.36667系數(shù)反映標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線性，理想值應(yīng)大于0.98,越接近1說明直線性越好，定量越準(zhǔn)確。斜率反映PCIT增效率（E）,理想的PCIT增效率在90%105%之問，如果PCfT增效率低，必須重新設(shè)計引物或探針；如果擴(kuò)增效率高于理想值，可能是系列稀釋樣品加樣錯誤，或者非特異性產(chǎn)物擴(kuò)增，或反應(yīng)體系中可能存在著對反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)或PC岐應(yīng)阻害的物質(zhì)，需要相應(yīng)的解決辦法。從標(biāo)準(zhǔn)曲線可以看出：r2=0.9995,大于0.98,標(biāo)準(zhǔn)差都在0.2范圍內(nèi)，而E=101/-3.2013=2.04,擴(kuò)增效率=（2.04-1）X100%=104%,表示定量準(zhǔn)確，可將未知樣品的Ct值帶入方程：23.36667=-

31、3.2013X+30.827可得X=2.33所以copies=（5X104/2）乂2.33=5.825x104但我們需要注意的是，標(biāo)準(zhǔn)曲線只可能用于推算稀釋梯度范圍內(nèi)的未知樣本的量，而不能外推稀釋梯度外的未知樣本的含量。所以，我們在實驗過程中盡可能使未知樣品的濃度在標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋范圍內(nèi)。二、相對定量分析1、相對定量分析方法的使用條件同絕對定量分析類似，我將舉例來說明我們在實驗過程中何種實驗需要用相對定量來進(jìn)行分析。我們?nèi)绻胫澜?jīng)過藥物處理過的組織和未處理的組織中某一目的基因的表達(dá)水平是否有差異，相差多少倍？我們可以選擇以下2種方式：1）我們可以從等量的2種組織中提取RNA,分別進(jìn)行目的基因的反

32、轉(zhuǎn)錄特異性熒光定量PCR實驗來確定目的基因在2種組織中的表達(dá)量，結(jié)果可以反映等量的2種組織中目的基因表達(dá)量的比率。2）如果我們之前已經(jīng)確定2種組織中看家基因如GAPDH的表達(dá)量相等，那么，我們就可以從大約等量（不需要等量）的2種組織中分別提取RNA,通過RT-qPCR實驗來確定2種組織中目的基因和看見基因的表達(dá)水平。藥物處理組織的目的基因的表達(dá)量可由2種組織中看家基因和未處理組織中目的基因的表達(dá)量共同來確定。2種分析方法的差異就在于用的標(biāo)準(zhǔn)有所不同，方法1）中的標(biāo)準(zhǔn)是2種組織的量相等；方法2）中的標(biāo)準(zhǔn)是2種組織中看家基因如GAPDH的表達(dá)量恒定不變；2、相對定量數(shù)據(jù)處理方法：對于不同的實驗需求

33、，我們可以采用不同的方法進(jìn)行實驗設(shè)計和數(shù)據(jù)分析，一般常用的方法有雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法、Ct、2-MCt、用參照基因的Ct法和Pfaffi法，應(yīng)用每種方法都有適應(yīng)條件。如為檢測A基因在某因子干預(yù)下的表達(dá)，我們得到一組數(shù)據(jù)見下表：待測基因（Ct值）參照基因（Ct值）待測基因擴(kuò)增效率（E）參照基因擴(kuò)增效率（E）干預(yù)前ABCD干預(yù)后EFCD根據(jù)實驗要求我們可以選擇相應(yīng)的方法，如下表:數(shù)據(jù)處理方法經(jīng)巧條件計算方法Ct法擴(kuò)增效率為100%,僅需目標(biāo)基因即可表達(dá)水平=2-Ct=24）目的基因和參照基因打增效率都接近100%,且相AACt表達(dá)水平=2-=2-(E-F)-(A-B)表達(dá)水平=2(f-b)-(e-a)表達(dá)

34、水平=c(a-e)/d(f-b)對偏差不超過|5%,需要目標(biāo)基因和參照基因。|參照基因的CtPfaffi法同2目標(biāo)基因和參照基因打增效率不同，但目標(biāo)基因間的擴(kuò)增效率相同，需目標(biāo)基因和參照基因，以及擴(kuò)增效率。而目前相對定量普遍采用操作簡便的2一"Ct分析方法，下面就以此分析方法為例進(jìn)行分析，應(yīng)用SYBRGreen方法對不同樣本問X基因表達(dá)分析的詳啟明和舉例。3、引物的設(shè)計在這里不再贅述，但需要提醒大家再設(shè)計擴(kuò)增片段長度時，最好在100-200bp范圍內(nèi)，在這范圍內(nèi)，擴(kuò)增片段越短，有效擴(kuò)增反應(yīng)越容易實現(xiàn)，同時較短的擴(kuò)增片段也可保證分析的一致性。4、模板的制備請查閱DNA/RNA提取、逆轉(zhuǎn)

35、錄的相關(guān)資料。5、PCR體系準(zhǔn)備PCR條件摸索：同絕對定量分析條件摸索，只是值得注意的是由于SYBR染料法對引物要求要比探針法高，在熒光定量實驗前，我們可通過普通PCR實驗來評價引物質(zhì)量。以RT-PCR獲得的cDNA為模板，建立20ul熒光定量PCR反應(yīng)體系，每個樣品6次重復(fù)（藥物處理和未處理）,對X基因和GAPDH基因進(jìn)行擴(kuò)增，同時設(shè)置不加模板的陰性對照。6、熒光定量PCR體系配制及儀器程序設(shè)置請參照各公司熒光定量PCR試劑、熒光定量PCR儀器說明書進(jìn)行。7、實驗結(jié)果與數(shù)據(jù)處理7.1 溶解曲線繪制與分析SYBRGreen染料沒有序列特異性，可以結(jié)合到包括非特異產(chǎn)物和引物二聚體在內(nèi)的任何dsD

36、NA上，因此有必要區(qū)分目標(biāo)信號和假信號。內(nèi)嵌染料可以在反應(yīng)末尾對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解，稱為溶解曲線分析。在溶解曲線分析過程中，隨著溫度從低于產(chǎn)物溶解點(diǎn)緩慢升到高于產(chǎn)物溶解點(diǎn)，實時儀器連續(xù)監(jiān)測每個樣品的熒光值?；诋a(chǎn)物長度和G/C含量的不同，擴(kuò)增產(chǎn)物會在不同的溫度點(diǎn)解鏈。隨著產(chǎn)物的解鏈，可以看到熒光值的降低并被儀器所測量。對溶解曲線進(jìn)行微分可以計算出溶解峰。溶解峰反映了反應(yīng)中擴(kuò)增到的產(chǎn)物。這些峰與凝膠電泳中條帶類似。熔解曲線的設(shè)置是在整個PCR完成后進(jìn)行，從60c升至95C,每升高1C儀器會自動收集熒光信號，得到的熔解曲線是逐漸下降的過程，且在Tm值下降最快，為方便分析，我們將溫度與熒光強(qiáng)度的變化求

37、導(dǎo)，即得到單峰的熔解曲線，這樣我們就可以證明引物的特異性良好，實驗結(jié)果不受非特異性擴(kuò)增和引物二聚體的干擾。7.2數(shù)據(jù)處理樣品未處理樣品藥物處理樣品BLANKCt值MeanCt6.1820.124.06NNonefNone24.18120.34基因MeanftGAPDHCt2-"Ct26.52-2.124.35下面我們來看看上面表格中差異倍數(shù)是如何得來的：首先，分別求出6個重復(fù)樣品X基因和GAPDH基因平均Ct值后，應(yīng)用參照基因GAPDH對未處理樣品和藥物處理樣品進(jìn)行校正： Ct（未處理樣品）=X基因MeanCt值一GAPDH基因MeanCt值=26.5220.34=6.18 Ct（藥

38、物處理樣品）=X基因MeanCt值一GAPDH基因MeanCt值=24.1820.12=4.06然后，對未處理樣品和藥物處理樣品的Ct進(jìn)行歸一化:Ct=zCt（藥物處理樣品）-ACt（未處理樣品）=4.06-6.18=-2.12最后，我們就可以根據(jù)Ct算出藥物處理樣品與未處理樣品問X基因的表達(dá)差異:2-Ct=2（2.12）=4.35量達(dá)表對相未處理樣品:藥物處理樣品一樣品名稱翼因此藥物處理樣本的X基因的表達(dá)水平是未處理樣品的14.35倍此結(jié)果是通過參照基因表達(dá)水平校正的待測樣本中的目標(biāo)基因相對于校準(zhǔn)樣本，用參照基因校準(zhǔn)目標(biāo)基因表達(dá)的目的是彌補(bǔ)樣本組織量的差異。為了更直觀的表示樣品間的表達(dá)差異，

39、最后我們可以將計算得到的相對量用圖表來表示，如下圖：<K54.543.532.521.510.50。法的修工如果目標(biāo)基因可蓊照基因有相同的擴(kuò)平效率，但擴(kuò)增效率不等于2,那么,廣C法的公式可以修房用家際擴(kuò)增效率.代替等式中的2。例如，如果目標(biāo)基因后參照基因的,增效率都匯上1.98,計算公式可以修正為1.98-"Ct。第三章常見問題與解答篇一、無Ct值（信號）出現(xiàn)1、反應(yīng)循環(huán)數(shù)不夠：一般都要在35個循環(huán)以上，可根據(jù)實驗情況增加循環(huán)，但高于45個循環(huán)會增加過多的背景信號；2、檢測熒光信號的步驟有誤：一般采用72c延伸時采集熒光，Taqman方法則一般在退火結(jié)束或延伸結(jié)束采集信號；3、引物或探針降解：可通過PAGE電泳檢測其完整性；4、探針設(shè)計不佳：設(shè)計探針溫度低于引物，造成探針未雜交上而產(chǎn)物已延伸；5、模板量少：對未知濃度的樣品應(yīng)從系列稀釋樣品的最高濃度做起；6、模板降解：避免樣