實(shí)驗(yàn)4 淡水綠藻分離純化與種群增長(zhǎng)影響因素分析

1、實(shí)驗(yàn)四 淡水綠藻分離純化與種群增長(zhǎng)影響因素分析一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.1了解常用的藻類培養(yǎng)基配方、適用性及其配置方法。1.2 掌握常用的藻類分離純化技術(shù)，熟悉藻類的培養(yǎng)設(shè)施。1.3 測(cè)試光照、溫度、鹽分、pH值等不同生態(tài)因子對(duì)藻類種群增長(zhǎng)速率的影響。1.4 了解藻類的分子系統(tǒng)學(xué)等鑒定方法。二、實(shí)驗(yàn)原理2.1純培養(yǎng)藻類培養(yǎng)首先要有藻種。從天然水域的混雜生物群中，用一定方法把所需藻類個(gè)體分離來(lái)，而獲純種培養(yǎng)。真正的“純種培養(yǎng)”是指在排除包括細(xì)菌在內(nèi)的一切生物的條件下進(jìn)行的培養(yǎng)。這是進(jìn)行科學(xué)研究不可缺少的技術(shù)，而在生產(chǎn)性培養(yǎng)中不排除細(xì)菌的稱之為“單種培養(yǎng)”。用作預(yù)備培養(yǎng)的培養(yǎng)液，各種藻類是不同的，對(duì)一些難以

2、培養(yǎng)的藻類一般加入土壤抽出液較好。預(yù)備培養(yǎng)液營(yíng)養(yǎng)成分濃度應(yīng)小些，一般只有原配方的1/41/2。如水樣中藻類種類較多，就應(yīng)使用幾種不同的培養(yǎng)液，使藻類在適合于自己繁殖的培養(yǎng)液中繁殖起來(lái)。可用三角燒瓶或試管作培養(yǎng)容器，加入容量1/41/3培養(yǎng)液。然后把經(jīng)篩絹過(guò)濾除去大型浮游生物的水樣接種進(jìn)去，放在合適溫度下或室內(nèi)靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時(shí)，容器可靜止不動(dòng)；而培養(yǎng)浮游藻類時(shí)，應(yīng)該每天搖動(dòng)一次。有的藻類在普通培養(yǎng)液中完全不能繁殖，有的繁殖非常困難。此時(shí)需改變培養(yǎng)液濃度，加入葡萄糖、蛋白胨等有機(jī)物，補(bǔ)充微量元素和輔助生長(zhǎng)物質(zhì)，加入土壤抽出液，就有可能獲較好效果。2.1 培養(yǎng)基配方的選擇藻類培養(yǎng)基的

3、配方極多，每種配方主要適用于一定藻種，表1列舉的是比較常用的幾種。 水生4號(hào)和克諾普（Knop）培養(yǎng)液，一般用于綠藻；藍(lán)藻可用朱氏10號(hào)或水生105號(hào)無(wú)氮培養(yǎng)基（后者適于固氮藍(lán)藻）；硅藻可用朱氏10號(hào)和水生硅1號(hào)培養(yǎng)基；另外還有海產(chǎn)綠藻、硅藻的培養(yǎng)基。2.2 培養(yǎng)基的配制原則1）要有適量氮源（除固氮藍(lán)藻外），如氨鹽、硝酸鹽、有機(jī)氮等；2）應(yīng)包括主要元素鉀、磷、鎂、硫、鈣等；3）要考慮各種鹽類總濃度和pH是否適合藻類需要，可用碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH；4）要加入各種藻類需要的微量元素，如鐵、錳、銅、鋅等（后幾種包括在土壤抽出液中）；5）要滿足某些藻類特殊需要，如藍(lán)藻需鉬，硅藻需硅；6）要添加適量生長(zhǎng)物質(zhì)

4、如維生索B1、B2等（包括在土壤抽出液中）。2.3 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制方法表1各種培養(yǎng)基的用水量都是加至1000mL，海藻培養(yǎng)液用海水，如無(wú)海水可用淡水1000mL加30克食鹽代替。土壤抽出液用菜園土1份和水2份比例混合攪勻，靜置，取上清液；海泥抽出液也可用同樣比例制備。如配制固體培養(yǎng)基，可在培養(yǎng)液內(nèi)加入1.5瓊脂。2.4 土壤抽出液制作方法1）先在試管底部，加入高約1cm土壤（采用腐殖化的農(nóng)田和庭院土）；2）再加入水使達(dá)5cm，塞上棉塞，采用蒸氣間隙滅菌，每天滅菌1小時(shí)，連續(xù)二天（備注：由于氣泡上升，棉塞可能弄臟，因此最好先在水中煮一段時(shí)間，使氣泡跑掉后，再加棉塞進(jìn)行滅菌）。三、實(shí)驗(yàn)儀器藥品移

5、液器 (200 ul， 1000 ul)，15 ml試管及配套試管塞，1.5ml EP管，9cm玻璃平皿，封口膜，保鮮袋，手套，口罩，超凈工作臺(tái)，顯微鏡，溫度計(jì)，電導(dǎo)率儀，pH計(jì)，光強(qiáng)測(cè)試儀，光照培養(yǎng)箱，表1所列全部試劑。四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和步驟4.1 培養(yǎng)基的配制按表1配制水生4號(hào)培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH值至7.5（左右）。固體培養(yǎng)基則在培養(yǎng)液內(nèi)加入2.0%瓊脂。配好的培養(yǎng)基于高壓滅菌鍋內(nèi)121滅菌20分鐘，待用。液體培養(yǎng)基可分裝入已滅菌的試管中；固體培養(yǎng)基待冷卻至50后，在超凈臺(tái)中倒入預(yù)先滅過(guò)菌的玻璃平板中。4.2 樣品的采集與富集培養(yǎng)采集湖泊或池塘中藻類的水樣，置于干凈的三角燒瓶中，放在合適溫度下或室

6、內(nèi)靠北窗口下培養(yǎng)。在培養(yǎng)附著藻類時(shí)，容器可靜止不動(dòng)；而培養(yǎng)浮游藻類時(shí)，應(yīng)該每天搖動(dòng)一次。 4.3 藻類的分離培養(yǎng)（1）稀釋分離法 把含有需要分離的藻類而又混雜有其他生物的水樣，取其一定量，用培養(yǎng)液稀釋。通過(guò)稀釋到適宜程度的方法，達(dá)到把原混雜生物單個(gè)分離培養(yǎng)的目的。在無(wú)菌條件下采用逐步稀釋的方法， 邊稀釋，邊在顯微鏡下鏡檢，直到鏡檢視野中每滴樣品只含有23 個(gè)細(xì)胞時(shí)，即停止稀釋，開(kāi)始分接培養(yǎng)。具體過(guò)程如下：1）取已滅菌的1.5 mlEP管數(shù)個(gè)，在第一個(gè)試管中加藻液樣品1ml，其他EP管中加入一定體積的無(wú)菌富集培養(yǎng)液0.5ml；2）從第一管中取藻液0.5ml 加到第二管中，充分振蕩，使均勻稀釋，此

7、時(shí)藻液被稀釋了2倍；3）再用一支新的消毒刻度移液管，吸取第二管中的稀釋藻液0.5ml 加入第三支試管中， 如前振蕩，使均勻稀釋，此時(shí)藻液被稀釋了4 倍；4）以后依次同樣滴入第四管、第五管中，充分均勻稀釋，當(dāng)?shù)沃恋谖骞軙r(shí)，此時(shí)藻液被稀釋了16 倍，鏡檢發(fā)現(xiàn)每滴稀釋樣品中只有2-3 個(gè)細(xì)胞， 可以用這樣的藻液進(jìn)行培養(yǎng)；5）從稀釋16 倍的藻液中各取0.2 ml滴入1個(gè)含5 ml新鮮培養(yǎng)基的滅菌的試管中培養(yǎng)，在培養(yǎng)過(guò)程中，將試管放在有漫射陽(yáng)光的地方，每日輕輕搖動(dòng)幾次；6）1-2周后鏡檢，有的則既含綠藻，又有雜藻，將之舍棄；7）又過(guò)1-2周， 藻體不斷繁殖， 培養(yǎng)液顏色變綠，再次鏡檢了所有的試管，有的

8、試管中含有大量的單一綠藻A，有的含單一綠藻B，有的多種綠藻并存，有的含有綠藻與雜藻并存，再次舍混，留純。此時(shí)已達(dá)到了分離、純化的目的。（2）平板劃線分離法1) 采回后經(jīng)富集培養(yǎng)的含藻水樣， 不用稀釋， 用一支無(wú)菌接種環(huán)蘸取一滴，在無(wú)菌平板培養(yǎng)基上輕輕劃線，劃3-4 條以后，把接種環(huán)在火焰上滅菌后，再通過(guò)第一次劃線區(qū)，以70 度左右的夾角，換一個(gè)方向第二次劃線3-4 條。2) 以同樣的方法做第三次、第四次劃線。然后蓋上培養(yǎng)皿，用封口膜封口后，置于恒溫、恒濕，具有適宜散射光照的培養(yǎng)架上培養(yǎng)。3) 兩周后可見(jiàn)到第一、二劃線區(qū)有連成一片或密集的藻落出現(xiàn)，而第三、四劃線區(qū)則零星地出現(xiàn)一些顏色不同的孤立的

9、藻落。4) 培養(yǎng)2-4周時(shí)， 用接種針從第三、第四劃線區(qū)挑取離相鄰藻落較遠(yuǎn)的、綠色的藻落，在顯微鏡下檢查，找到純種藻落時(shí)，將該藻落用無(wú)菌解剖針挑入含有新鮮培養(yǎng)基的無(wú)菌試管中，在適宜條件下在恒溫光照搖床上繼續(xù)培養(yǎng)。5) 1-2周試管中的液體呈均勻綠色時(shí)，再一次鏡檢，確定沒(méi)有其他藻類、其他生物侵染時(shí)，即成功地得到單種培養(yǎng)的綠藻藻種。4.4 藻類鑒定和種群增長(zhǎng)影響因素分析通過(guò)上述分離培養(yǎng)獲得的藻種，顯微觀察和畫(huà)示意圖，通過(guò)藻分類學(xué)參考書(shū)進(jìn)行藻種鑒定。測(cè)試光照、溫度、鹽分、pH值等不同生態(tài)因子對(duì)藻類種群增長(zhǎng)速率的影響，具體實(shí)驗(yàn)過(guò)程由同學(xué)們自主設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案，待與老師討論后執(zhí)行。4.5 藻類的分子鑒定（有

10、深厚興趣的、實(shí)驗(yàn)技術(shù)扎實(shí)的，學(xué)習(xí)態(tài)度好的同學(xué)可以找老師選做）分子鑒定實(shí)驗(yàn)大致流程：將純養(yǎng)藻類10-50 ml離心后，藻細(xì)胞沉淀采用CTAB法提取基因組DNA，之后采用真核細(xì)胞通用引物對(duì)備注：4條基因核基因組rDNA的18S rRNA gene、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)、內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS-2)和葉綠體rbcL基因中篩選出最為適用的引物對(duì)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和測(cè)序鑒定，具體實(shí)驗(yàn)步驟參見(jiàn)環(huán)境生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)一甲基營(yíng)養(yǎng)菌的分離與鑒定。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析與討論六、作業(yè)1. 除了本講義所列2種藻類分離純化方法外，再列舉2種以上其它的藻類分離純化方法。2. 你認(rèn)為藻類的分離培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵是什么？3. 影響

11、藻類種群生長(zhǎng)的生態(tài)因子有哪些？結(jié)合試驗(yàn)結(jié)果談?wù)勗孱惙N群增長(zhǎng)的規(guī)律？4. 通過(guò)期刊網(wǎng)查找藻類的鑒定方法？成功案例中國(guó)藻類學(xué)會(huì)第八次會(huì)員代表大會(huì)暨第十六次學(xué)術(shù)討論會(huì)論文摘要集2011年加入收藏 獲取最新產(chǎn)油微藻O.multisporus的分子生物學(xué)鑒定楊勛 劉平懷 時(shí)杰 郝宗娣 張森 【摘要】：從海南淡水水體分離得到一株富油微藻,通過(guò)形態(tài)觀察及分子生物學(xué)鑒定其為Ourococcus multisporus。微藻DNA提取采用生工SK1375真菌基因組DNA抽提試劑盒,所提DNA于-4冰箱保存?zhèn)溆?。DNA擴(kuò)增采用真核生物18S rDNA擴(kuò)增通用引物18SF(5-CCTGGTTGATC CTGC CAG-3)和18SR(5-TTGATCCTTCTGCAGGTTCA-3)。PCR反應(yīng)條件為98預(yù)變性5min,然后9535 S,5535 S,7240 S,35個(gè)循環(huán)后于72延伸8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳后采用生工SK1131膠回收試劑盒回收,將目標(biāo)片段連接到PUCm-T載體上克隆,選擇陽(yáng)性載體測(cè)序。獲得測(cè)序結(jié)果后,用BLAST軟件對(duì)基因序列的同源性進(jìn)行分析,從數(shù)據(jù)庫(kù)下載相似的18S rDNA部分序列,