基因克隆步驟完整版

1、1總RNA提取(1) 液氮研磨或冰上勻漿試驗材料；先將1ml Trizol加到離心管中待用(2) 將研磨好的樣品加到離心管中混勻，室溫放置5 min；打開離心機預冷(3) 加200 µL氯仿，振蕩15 sec，室溫放置3 min，分層；(4) 4oC，12,000g，離心15 min；(5) 取上清，加500 L異丙醇，混勻，室溫放置10 min；(6) 4oC，12,000g，離心10 min；(7) 棄上清，加1 mL75%乙醇，漂移洗滌沉淀，振蕩充分；再用100%乙醇清洗(8) 4oC，7,500g，離心5 min；(9) 棄上清，離心，用槍吸取多余液體，放在超凈臺里干燥后，加

2、50 L DEPC水，80oC保存。此操作中所用到的器皿均需經(jīng)過DEPC滅活RNA酶處理。提取的總RNA需經(jīng)RNA電泳檢測質量，并用紫外分光光度計測定濃度。OD260值為核酸的吸取值，OD280值為蛋白的吸取值，OD260/280值在1.8-2.0間一般說明該核酸蛋白含量在允許的范圍內，可正常使用；此外還有OD230值為多糖和酚類的吸取值，比較潔凈的核酸OD260/230值能達到2.2左右。RNA濃度計算公式：總RNA 濃度（µg/mL）=A260×稀釋倍數(shù)×40。2反轉錄/cDNA第一鏈的合成純化RNA以去除基因組DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScr

3、ipt RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)說明書進行。其體系為：Total RNA1g5× gDNA Eraser Buffer2LgDNA Eraser1LRNase Free dH2O補齊至10L條件為：42oC，2min；RNA純化后，即可進行反轉錄。其體系為：5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4LPrimeScript RT enzyme mix 1LRT Primer Mix 1L上一步的反應液10LRNase Free dH2O補齊至20L操作條件為：(1) 37

4、oC放置15 min； (2) 85oC，5 sec； (3) 4oC保存。3 PCR按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，PCR反應體系如下：Premix Taq25 L模板5L引物1 (10 M)1 L引物2 (10 M)1 LddH2O18LPCR反應條件為：94°C預變性5min；94°C變性30s，53°C退火30s，72°C延長30s，循環(huán)36次；72°C延長10min。PCR反應完畢，取5L反應產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳（若割膠回收則用10L反應產(chǎn)物）。4 基因克隆及測序4.1 PCR產(chǎn)物切膠回收將

5、PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，在紫外燈下觀看并切下預期大小的DNA片段。使用TIANGEN公司的Universal DNA Purification Kit割膠回收試劑盒進行純化，步驟如下：(1)平衡吸附柱：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500L平衡液BL，13,400×g離心1 min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(2) 按100 mg agarose膠加入100L 溶液PC，置于50oC中10 min左右，中途混勻幾次，至膠完全溶化；(3) 將樣品倒入一個吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室溫下13,400×g離心1 min，

6、倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(4)向吸附柱CB2中加入600L 漂洗液PW（加乙醇），室溫下13,400×g離心1 min，倒掉收集管中的廢液，吸附柱CB2重新套回收集管中；(5) 重復上一步驟；(6) 將吸附柱CB2放入收集管中，室溫下13,400×g離心2 min，盡量除去漂洗液，將吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干；(7) 將柱子套入一新的滅菌1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50µL 洗脫緩沖液，室溫放置2分鐘，13,400×g室溫離心2 min，收集到的洗脫液即為回收的DNA純化液；(8) 取5µL的

7、純化液體進行1%瓊脂糖凝膠電泳，以檢查純度，并測量溶液中DNA含量。4.2目的片段與載體連接(1) 膠回收產(chǎn)物與T載體連接體系，參考Takara公司pMD18-T載體的試劑盒說明書。在滅菌的0.5 mL 離心管中配制如下溶液（10 L）：回收DNA4LLigation Solution5LpMD18-T Vector1L(2) 16oC反應30分鐘，所得產(chǎn)物保存于4oC冰箱備用。4.3連接產(chǎn)物轉化E.coli DH5(1) 將5 µL連接產(chǎn)物加入到100µLE.coli DH5感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉離心管混勻內容物，冰上靜置30 min； (2) 42oC水浴熱激轉化90

8、sec，馬上放回冰上，放置3 min；(3) 每管加入500 µL LB培育基（室溫放置），37oC 160-180 rpm振蕩培育45-60 min，使菌體復蘇并表達抗性基因；(4) 在含有Amp（100 µg/mL）的選擇性平板上加入60-100 µL 菌液，用無菌涂布棒輕輕涂布均勻后，用Parafilm膜封好；(5) 將培育皿正放，37oC約50 min，待液體全部吸取后，倒置平板連續(xù)培育10-16 h。4.4轉化子的篩選及鑒定(1) 用無菌槍頭挑取LB平板上3-5個單菌落，分別接種到3.5 mL LB液體培育基中（含100 µg/mL Amp），37oC，165rpm振蕩培育1