幽門螺桿菌外膜蛋白基因omp22克隆、表達(dá)和鑒定.docx

1、678X2010Oct；27(5)廣西醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)JOURNALOFGUANGXIMEDICALUNIVERSITY幽門螺桿菌外膜蛋白基因omp22克隆、表達(dá)和鑒定基金項(xiàng)目：河南省毆學(xué)創(chuàng)新人才基金資助項(xiàng)B(No.2000-84):河南省科技廳科技攻關(guān)項(xiàng)目基金資助課題(No.0424410035)通信作者:E-mail:gcduan©public,zz.ha.cm電話：0371-669128691廣西壯族自治區(qū)疾病鎮(zhèn)防控制中心南寧5300282鄭州大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院流行病學(xué)教研室鄭州450001收稿日期,2009-05-10黃學(xué)勇李永紅I段廣才范清堂2都園林2(河南省疾病預(yù)防控制中心鄭州

2、450016)摘要目的：克隆幽門螺桿菌外膜蛋白基因。mp22構(gòu)建幽門螺仟菌。mp22基因與麥芽糖結(jié)合蛋白基因融合表達(dá)載體.并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，鑒定融合蛋白免疫原性，為幽門螺桿菌疫苗研究提供依據(jù)。方法：利用PCR技術(shù)從Helicobacterpylori鄭州分離株MEL-Hp27染色體DNA上擴(kuò)增omp22基因.并將其克隆到表達(dá)載體pMAL-c2X中.轉(zhuǎn)化大腸桿菌(E.coliTB1),用IPTG誘導(dǎo)目的基因表達(dá)，SDSPAGE方法對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析，Westernblot鑒定其免疫原性。結(jié)果:PCR方法擴(kuò)增的omP22基因長度約為540bp°經(jīng)酶切鑒定，插入到表達(dá)載體的基因片段與預(yù)期目的

3、DNA片段相一致；SDS-PAGE結(jié)果顯示表達(dá)產(chǎn)物分子量約為22ku.融介蛋白的表達(dá)最約占全菌總蛋白的26%。結(jié)論：成功克隆并構(gòu)建了omp22基因高效原核表達(dá)系統(tǒng).為幽門螺桿菌基因JL程組分疫苗的研究奠定基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞幽門螺桿菌;omP22基因克隆基因表達(dá)中圖分類號:R378.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1005-930X(2010)05-0678-03CLONING,EXPRESSIONANDIDENTIFICATIONOFOUTMEMBRANEPROTEINomp22GENEOFHELICOBACTERPYLORIHuangXueyong,LiYonghong,DuanGuangcai,eta

4、l.(HenanProvincialCenterforDiseasePreventionandControl»Zhengzhou450016China)AbstractObjective：Tocloneandexpresstheomp22geneofHelicobacterpyloriandtoidentifytheimmunogenicityofexpressedproteininordertobuildabasisfortheinvestigationworkofvaccineanddiagnosticantigen.Methods：omp22geneoftheHelicobac

5、terpyloriMEL-Hp27wasamplifiedbyPCR.andinsertedintoexpressionvectorpMALc2X.ThepositiverecombinantsweretransferredintoE.coliTB1,thegeneticallyengineeredbacteriaincludingpMAL-c2X-omp22plasmidswereinducedbyIPTG,andtheexpressionproductswereanalyzedbySDS-PAGEandWesternblot.Results：omp22geneof540bpwasobtai

6、nedfromtheHelicobacterpyloristrainsMEL-HP27genomeDNAThegenesegmentinsertedintotherecombinantvectorwasidentifiedbyusingrestrictionenzymedigestion.PlasmidpMAL-c2X-omp22couldexpressaspecificapproximative65kufusionprotein(omp2222kuandMBP42.5ku)inE.coliTB1andthefusionproteinaccountedfor26%ofthetotalprote

7、inofrecombinantbacterial.Conclusion：omp22genehasbeenclonedandaprokaryotichighexpressionsystemforomp22genesuccessfullyconstructed,whichwillhelptodevelopgenerecombinantvaccineagainstHelicobacterpyloriinfection.KeywordsHelicobacterpylori；omp22gene；cloning；expression幽門螺肝菌(HelicobacterpyloriHp)是一種能長期定植于人

8、體胃黏膜的致病菌.流行病學(xué)調(diào)查顯示,全世界感染率之高是前所未有的，而我國普通人群的感染率為50%80%.每年仍有遞增趨勢。自然感染Hp后機(jī)體的免疫反應(yīng)不但不能清除細(xì)菌反而會導(dǎo)致胃黏膜的慢性免疫病理損害.因此要消除該致病菌的危害僅僅被動治療是難以實(shí)現(xiàn)的目前大房實(shí)驗(yàn)研究表明.免疫接神蛋白質(zhì)亞單位疫苗能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性細(xì)胞和體液免疫反應(yīng).可以預(yù)防甚至治療Hp感染其中Hp的外膜蛋白(Outermembraneprotein.OMP)可作為潛在的靶標(biāo).能夠在人體保護(hù)性免疫反應(yīng)中起到重要的作用.并為該菌的共有抗原成分.以其制備的抗原可使實(shí)驗(yàn)動物獲得保護(hù)5。本研究采用鄭州Hp臨床分離株MEL-HP27,

9、對外膜蛋白OMP22編碼基因(omp22)進(jìn)行克隆和表達(dá),為進(jìn)一步純化及大重制備重組OMP22蛋白，并進(jìn)行OMP22免疫原性和相關(guān)功能的研究奠定基礎(chǔ).1材料與方法L1材料:HpMEL-HP27株由本研究室從鄭州市慢性萎縮性胃炎患者體內(nèi)分離并保種。表達(dá)質(zhì)粒PMAL-c2X和E.coliTB1購自NewEnglandBiolabs公司iPyrobestDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHI和PstI,T4DNA連接酶等購自寶生物公司IDNA純化試劑盒為Vitagene公司產(chǎn)品。1.2方法2.1PCR擴(kuò)增：參考GenBank收錄的Helicobacterpylori國際標(biāo)準(zhǔn)株J99和26695的基因序

10、列，應(yīng)用Primer5.0設(shè)計(jì)Hp外膜蛋白o(hù)mp22基因的PCR引物：上游5x-cgggatccat-gaagagatcttc-3;下游5z-cgcctgcagttacttcactaattt-3,.分別在上、下游引物引入BamHl和Pst1酶切位點(diǎn)，該引物由賽百盛公司合成。PCR擴(kuò)增體系:10XBuffer5、L,4XdNTP4 mL（各200pmol/L）,MEL-HP27DNA模板2.5pL,引物各2mL（0.25pmol/L）,PyrobestDNA聚合酶0.4/J.（l.25U）,最后加MilliQ4（）至50PCR擴(kuò)增條件：95C預(yù)變性min,然后按以下參數(shù)進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，94C變性

11、50*45X?退火45s,72X：延伸50方最后一個(gè)循環(huán)72X?反應(yīng)10min。PCR產(chǎn)物3/在1.0g/L瓊脂糖凝膠（含EB）中電泳.凝膠圖像分析儀照像。1.2.2omp22表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建:PCR產(chǎn)物和表達(dá)質(zhì)粒pMALc2X分別用BamHI和PstI雙酶切,酶切產(chǎn)物分別用Vitagene掇膠問收試劑盒回收，凝膠圖像分析儀定量。omp22與pMALc2X酶切產(chǎn)物以6:1的mol比例進(jìn)行混合，T4DNA酶16C過夜連接。取連接產(chǎn)物10/1L.轉(zhuǎn)化TB1感受態(tài)細(xì)胞將轉(zhuǎn)化菌均勻涂布于含X-gal和IPTG的LB氨*青篝素固體培養(yǎng)基上.37K培養(yǎng)1216h。挑選白色菌落,接種于5mL含氨卡青霉素的LB

12、液體培養(yǎng)基中，371、220r/min培養(yǎng)過夜，堿裂解法提取質(zhì)粒進(jìn)行單、雙酶切和PCR擴(kuò)增鑒定。陽性重組質(zhì)粒命名為pMAL-c2X-omp22質(zhì)粒。1.2.3目的基因的誘導(dǎo)表達(dá)與SDSrPAGE分析：將已鑒定為陽性克隆菌落接種于含氛苯青霉素（100mg/L）的LB液體培養(yǎng)基中.37°C.200r/min搖菌過夜。取50L菌液加入到5mLLB液體培養(yǎng)基中，371,240r/min,搖菌1.5h,加入終濃度為0.4mmol/L的1PTG,誘導(dǎo)表達(dá)4h。取菌液樣品1mL.4000g離心5min,棄上清.加入100ML2XSDS-PAGE上樣緩沖液，于100水浴5min,10000離心10m

13、in.取10上清加樣。采用0.5mg/L的濃縮膠和1.2mg/L的分離膠電泳約2.5h.凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色。1.2.4表達(dá)產(chǎn)物的westernblot分析：SD&PAGE電泳后.凝膠和硝酸纖維素膜在轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡15min.于半式電轉(zhuǎn)印儀中20V轉(zhuǎn)印30min。硝酸纖維素膜用蒸儒水洗3次.PBS洗1次，轉(zhuǎn)入封閉液封閉3h.與Hp病人血清（1:50）反應(yīng)2h.洗膜后.與弟抗人血清（1«2000）反應(yīng)1h,DAB（二氨基聯(lián)苯胺）顯色。2.1 omp22基因克隆:PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳.結(jié)果顯示擴(kuò)增產(chǎn)物長度約540bp（見圖1）,獲得預(yù)期大小目的基因片段。該基因序列

14、已被GenBank收錄（收錄號：DQ499023）。12圖1Hpomp22基因的PCR反應(yīng)產(chǎn)物1：DNAmarker：2、3：omp22基因擴(kuò)增產(chǎn)物2.2 omp22重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定結(jié)果：重組表達(dá)質(zhì)粒分別用BamHI和PstI單，雙酶切以及PCR擴(kuò)增均獲得相應(yīng)大小的DNA片段，表明重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2Xomp22構(gòu)建成功（圖2）。15OCX)hp5000bp2S00bpI000hp15OCX)hp5000bp2S00bpI000hp250bp圖2重組表達(dá)載體的酶切鑒定1：DNAmarker,2：pMAL-c2X雙酶切13:pMAL-c2X-omp22單酶切b4：PMAL-c2X-o

15、mp22雙酶切j5：以pMALc2Xomp22為模板擴(kuò)增omp22誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果：將重組菌TB1（PMALc2X-omp22）和對照菌TB1（PMAL-c2X）以及TB1誘導(dǎo)后的粗提蛋白進(jìn)行SDSPAGE電泳.重組前體蛋白在約65ku處出現(xiàn)一條特異蛋白帶（圖3）.正好是標(biāo)簽蛋白MBP（分子最42.5ku）與OMP22的分子斌（22ku）的總和.經(jīng)GeneGenius凝膠圖像分析儀分析.融合蛋白的表達(dá)量約占全菌蛋白的26%,該蛋白分子量與預(yù)期融合表達(dá)蛋白分子景一致。初步證實(shí)本研究構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒PMAL-c2X-omp22口J以高效表達(dá)融合蛋白MBP-CMP22。97400

16、6620043(XX)3100020100974006620043(XX)3100020100MRP-OMP22圖3TBl(pMAL-c2X-omp22)誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的SDSPAGE分析1:proteinmarker；2：E.coliTB1誘導(dǎo)；3：TB1(pMALc2X)誘知4,5,6：TB1(pMAL-c2X-omp22)誘導(dǎo)4表達(dá)產(chǎn)物的Westernblot分析：重組菌TB1(pMAL-c2X-omp22)表達(dá)產(chǎn)物與Hp陽性病人血清進(jìn)行Westernblot分析.在約65ku處產(chǎn)生特異雜交帶(圖4),進(jìn)一步證實(shí)獲得了月的蛋白的表達(dá)。圖4r()MP22免疫原性的Westernblot分析1

17、：健康人血清，2：Hp病人血清3討論Hp是世界性分布的病原前.它的感染是目前人類發(fā)生率最高的慢性細(xì)菌感染之一,已被確認(rèn)為消化性潰瘍和慢性胃炎的重要病因，并與胃癌和胃淋巴瘤的發(fā)病密切相關(guān)兀。近年來的研究顯示.應(yīng)用Hp疫苗防治其感染已成為公認(rèn)的最為經(jīng)濟(jì)有效的措施*。有研究表明.革蘭陰性細(xì)筒外膜中的一些蛋白成分具有良好的抗原活性.可誘導(dǎo)出很強(qiáng)的菌株特異性免疫反應(yīng).這些外膜蛋白作為抗體和免疫細(xì)胞攻擊的主要靶標(biāo),可以介導(dǎo)對細(xì)前最直接有效的殺滅作用.是決定免疫反應(yīng)是否對人體具有保護(hù)性的關(guān)健因素。Hp基因組中含有34個(gè)功能有待進(jìn)一步研究的外膜蛋A(outermembraneprotein,CMP)基因.一些

18、實(shí)驗(yàn)研究已證實(shí)部分外膜蛋白分子如Lpp20、OMP26、()MP27及OMP25等具有良好的免疫活性9.提示外膜蛋白分子可以成為Hp疫苗研究良好的候選抗原。本研究選擇的OMP22也是Hp的一種外膜蛋白.這種蛋白在菌體內(nèi)的生理功能尚不清楚，但已有研究表明其能夠分泌表達(dá)于細(xì)萌表面，并能引起Thl細(xì)胞較高的免疫反應(yīng)口。.對OMP22進(jìn)行深入研究有希望發(fā)現(xiàn)更有效的Hp疫苗抗原和診斷抗原。通過PCR方法獲得鄭州分離Hp菌株MEL-HP27的omp22基因,進(jìn)一步將克隆到的omp22基因酶切、純化、連接入融合原核表達(dá)載體pMAL-c2X,成功構(gòu)建了表達(dá)OMP22蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2X-omp2

19、2°通過IPTG誘導(dǎo)和SDS-PAGE蛋白電泳，發(fā)現(xiàn)重組細(xì)菌在分子量約65ku處出現(xiàn)一條特異蛋白帶，正好是標(biāo)簽蛋白MBP(分子量42.5ku)與OMP22的分子最(22ku)的總和,與預(yù)期融合蛋白分子最相符。這就為進(jìn)一步的OMP22重組蛋白的抗原性和免疫保護(hù)性研究以及Hp基因工程疫苗和臨床診斷試劑研制奠定r重要基礎(chǔ)。參考文獻(xiàn)：1 DelchierJC,LamarqueD,LevyM,etal.Helicobacterpyloriandgastriclymphoma：highseroprevalenceofCagAindiffuselargeB-celllymphomabutnotin

20、low-gradelymphomaofmucosa-associatedlymphoidtissuetypeJ.AmJGastroenterol.2001,96(8)：2324-2328.2 FockKM,AngTL.EpidemiologyofHelicobacterpyloriinfectionandgastriccancerinAsiaJ.J(iastroen-terolHepatol,2010,25(3):479-486.3 SachsG,WenYScottDR.GastricinfectionbyHelicobacterpyloriCJJ.CurrGastroenterolRep,2

21、00911(6)：455-461.4 JiangZ,HuangAL.TaoXHetal.ConstructionandcharacterizationofbivalentvaccinecandidateexpressingHspAandMrl8000()MPfromHelicobacterpylcriJ.WorldJ(jastroenteroL2003,9(8)：1756-1762.5 姜政.余劍平Y(jié)新渝.等,人幽門螺桿菌外膜蛋白18000DNA疫苗的構(gòu)建及表達(dá)J.中國免疫學(xué)雜志，2005.21(2):134-138.6 李良仁.王繼德，白楊，等.幽門螺桿菌外膜蛋白25基因的克窿及序列分析口.中國微生態(tài)學(xué)雜志<2005,17(4)：763-765.7 LahnerE<Be