細胞工程期末復(fù)習資料

1、細胞工程第一章 論緒1、細胞工程：按照一定的設(shè)計方案，通過在細胞、亞細胞或組織水平上進行實驗操作，獲得重構(gòu)的細胞、組織、器官及個體，創(chuàng)造優(yōu)良品種和產(chǎn)品的綜合性生物工程。(1)分類a.按生物類型分為：動物細胞工程、植物細胞工程、微生物細胞工程b.按實驗操作對象分為：細胞與組織培養(yǎng)、細胞融合、細胞核移植、染色體操作、轉(zhuǎn)基因工程。(2) 操作水平：細胞整體水平或細胞器水平(3) 目的：定向改變遺傳物質(zhì)或獲得細胞產(chǎn)品(4) 理論基礎(chǔ)：細胞全能性(5) 依據(jù)：生物體的每一個干細胞都包含有該物種所特有的全套遺傳物質(zhì)。2、 植物細胞工程包括：植物體細胞雜交、植物組織培養(yǎng)。3、 動物細胞工程包括：動物細胞融合

2、、動物細胞培養(yǎng)、單克隆抗體技術(shù)、核移植、胚胎移植。4、 細胞工程研究內(nèi)容(1) 細胞與組織培養(yǎng)（離體培養(yǎng)）：是細胞工程的最基本技術(shù)。(2) 細胞融合（細胞雜交）：自然融合、人工誘導融合。j試管嬰兒k單克隆抗體技術(shù)(3) 細胞核移植：克隆羊多莉(4) 染色體工程：多倍體育種(5) 胚胎工程：以生殖細胞和胚胎細胞為對象，包括體外受精、胚胎移植、胚胎切割。(6) 干細胞與組織工程：胚胎干細胞、組織細胞。人工培養(yǎng)的肌肉、器官。5、 細胞工程的應(yīng)用：a. 快速繁殖b. 種苗脫毒c. 動物胚胎工程快速繁殖優(yōu)良、瀕危品種d.利用動植物細胞培養(yǎng)生產(chǎn)活性產(chǎn)物、藥品（生物反應(yīng)器工程），如利用動物細胞融合形成單克隆

3、抗體，利用植物細胞培養(yǎng)次生代謝產(chǎn)物。e.新型動植物品種的培育f.供醫(yī)學器官修復(fù)或移植的組織工程g.珍稀動植物資源的保存與保護h.在遺傳學、發(fā)育生物學領(lǐng)域的理論研究第2章 細胞全能性與形態(tài)發(fā)生1、名詞解釋：u細胞全能性：細胞經(jīng)分裂和分化后仍具有形成完整個體的潛能或特性。v極性：指植物的器官、組織、甚至單個細胞在不同的軸向上存在的某種形態(tài)結(jié)構(gòu)以及生理生化上的梯度差異。w離體器官發(fā)生：培養(yǎng)條件下的組織或細胞團（愈傷組織）分化形成不定根、不定芽等器官的過程。x細胞分化：導致細胞形成不同結(jié)構(gòu)或引起功能改變或潛在發(fā)育方式改變的過程。y脫分化：離體培養(yǎng)條件下生長的細胞、組織或器官經(jīng)過細胞分裂或不分裂，逐漸失

4、去原來的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無組織結(jié)構(gòu)的細胞團或愈傷組織，或成為未分化細胞特性的過程。z再分化：離體培養(yǎng)的植物細胞和組織可以由脫分化狀態(tài)重新進行分化，形成另一種或幾種類型的細胞、組織、器官、甚至形成完整植株的過程。胚狀體：在植物組織培養(yǎng)中，起源于一個非合子細胞、經(jīng)過胚胎發(fā)生和胚胎發(fā)育過程形成具有雙極性的胚狀結(jié)構(gòu)，叫做胚狀體或體細胞胚胎。|愈傷組織：脫分化后的細胞經(jīng)過細胞分裂產(chǎn)生無組織、無明顯極性的松散的細胞團。2、植物的再生途徑：植物再生的各種途徑，與實驗材料和培養(yǎng)基、添加的激素有關(guān)。3、 愈傷組織的種類：a. 胚性愈傷組織：表面光滑、組織結(jié)構(gòu)緊湊、細胞小、再生力強。易形成胚狀體，所

5、以被稱為胚性愈傷組織。b. 非胚性愈傷組織：表面粗糙、組織結(jié)構(gòu)疏松、細胞大。4、 不定根：從莖、葉上生出的根叫做不定根。不定芽：不是從葉腋或枝頂發(fā)出，而是從葉子、根上或從樹干上發(fā)出的芽。5、 離體培養(yǎng)中通過器官發(fā)生形成再生植株大體上有三種方式：a. 先芽后根；如小麥，蘆薈、蘋果。b. 先根后芽；如枸杞、苜蓿等。c. 在愈傷組織的不同部位形成芽和根，再通過維管組織的聯(lián)系形成完整植株。如胡蘿卜、石刁柏。第3章 植物細胞工程常規(guī)技術(shù)1、 細胞工程實驗室一般由培養(yǎng)基制備室、無菌操作室、培養(yǎng)室、顯微觀察室和移栽馴化室。其中培養(yǎng)基制備室由洗滌間、制備間和消毒間3部分組成；無菌操作室通常由里外兩件組成，外間

6、是緩沖間，用于準備工作，內(nèi)間是接種間，用于接種；培養(yǎng)室可分為光照培養(yǎng)室和暗培養(yǎng)室。2、 常用的洗滌液類型（5種）：鉻酸洗液、堿性高錳酸鉀洗液、磷酸鈉洗液、硝酸-過氧化氫洗液、強堿洗液。3、滅菌的方法：1) 物理方法：干熱、濕熱、過濾(0.25微米）、紫外燈、超聲波等。2) 化學方法：使用滅菌劑或抗菌素，如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等。a. 干熱滅菌：適用于玻璃器皿和金屬器械。操作時間：j150，40min k120，120min160，90-120min（芽孢桿菌）b. 濕熱滅菌：適用于各種器皿、培養(yǎng)基、蒸餾水、棉塞、紙。操作時間：j120，20-30minc.

7、過濾滅菌：適用于某些生長因子、赤霉素、酶液、血清、玉米素、脫落酸、尿素、維生素。d. 射線滅菌：適用于實驗室操作臺。操作時間：j2030mine. 火焰灼燒滅菌：適用于接種器皿。f. 消毒劑：適用于外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚。4、外植體：指無菌條件下，離體培養(yǎng)于人工培養(yǎng)基上的、用于達到某種培養(yǎng)目的的原始植物材料。5、外植體消毒方法： 取材后將老的組織去掉自來水沖洗洗衣粉水洗（簡單殺菌）自來水沖洗70酒精處理消毒劑處理 滅菌蒸餾水沖洗35遍。 其中，消毒時采用的消毒劑及其濃度處理時間等，均應(yīng)根據(jù)材料的情況及對消毒劑的敏感性來定；消毒時間因植物老嫩程度不同而不同，一般，較老的材料相對殺菌時間

8、長，反之較短。 消毒劑種類有很多，如次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾姆林等。次氯酸鈉效果應(yīng)該比較好，無毒、無污染、但往往由于儲藏、運輸過程中不注意，見光氧化，影響殺菌效果。一般多用升汞。 一般殺菌，酒精10秒，升汞512分鐘。6、 外植體的選擇：P46 用于外植體分離的母體植物材料一般有3種來源：一是生長在自然環(huán)境下的植物；二是在溫室控制環(huán)境條件下生長的植物；三是無菌環(huán)境下已經(jīng)離體培養(yǎng)過的植物。（1）選擇優(yōu)良的基因型 試驗首先要明確目的。例如，蔬菜、作物等的脫毒快繁，是為了脫去病毒，提高產(chǎn)量和質(zhì)量，就應(yīng)選擇當?shù)卦耘啻_認的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的品種作為脫毒的材料，并且品種一定要可靠?；ɑ堋⒂^賞

9、植物的快繁，也應(yīng)選擇有價值的植物。 （2）取材 從生長旺盛、健壯、無病蟲害的植株上取材。母株代謝旺盛期切取的外植體再生能力強，試驗容易成功。（3）外植體大小選擇 因外植體不同而不同。如利用莖尖培養(yǎng)，莖尖大小對脫毒效果非常明顯。再如幼胚培養(yǎng)，胚齡也非常重要。 （4）選擇外植體的時期 外植體的生長動態(tài)往往與該物種的生長規(guī)律（生物鐘）有關(guān)。因此，最好在植物生長的最適宜時期取材培養(yǎng)。會得到較好的結(jié)果。7、外植體的處理：（1）取材母株的預(yù)處理 人工管理，促進母株生長旺盛、代謝活躍，從其上取材培養(yǎng)，容易成功。 （2）外植體休眠的處理 有些植物的種子、幼胚、或芽，存在休眠。為了打破休眠，可利用低溫處理，或赤

10、霉素等化學物質(zhì)處理。因植物不同處理溫度和時間有所不同。 （3）外植體的滅菌 大田或溫室植物材料，都帶有大量的細菌和真菌，這是組織培養(yǎng)的一大障礙，所以材料必須進行殺菌消毒（表面殺菌）組織內(nèi)生菌的處理（1）加入抗生素，注意抗生素的用量，高濃度容易造成培養(yǎng)物的死亡 （2）取生長期旺盛的生長點部位作為起始培養(yǎng)的外植體。 （3）取被內(nèi)生菌污染的培養(yǎng)物的莖尖不停的轉(zhuǎn)接。8、 培養(yǎng)基的組成和作用（1） 無機營養(yǎng)j大量元素：N（硝酸鹽或銨鹽）, P, K ,Ca, Mg, Sk微量元素：Fe, Mn, Zn, Mo, Cu, Cl（2） 有機營養(yǎng)（1） 維生素類物質(zhì)j硫胺素（VB1）：愈傷組織的產(chǎn)生和生活力有

11、關(guān)k煙酸（VB3、維生素PP）：促進胚的發(fā)育鹽酸吡哆醇（VB6）：促進根的生長其它：泛酸鈣（VB5）、生物素（VH）、鈷胺素（VB12）、葉酸（VBc）（2） 氨基酸類物質(zhì)j甘氨酸（Gly）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酰胺（Gln）k水解乳蛋白、水解酪蛋白（3） 糖類j蔗糖（植物）、葡萄糖（動物）、果糖、麥芽糖k作用：為細胞提供合成新物質(zhì)的碳骨架；為細胞的呼吸代謝提供底物和能量；維持滲透壓。（4） 其它有機物質(zhì)j肌醇：細胞壁的構(gòu)建物質(zhì)；參與細胞膜的組成；利于胚和芽的形成。k天然有機物：椰乳、番茄提取物、酵母提取物。（3） 植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)（1） 生長素類j吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）、

12、萘乙酸（NAA）、2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）k作用：a.促進細胞生長和細胞分裂 b.誘導受傷組織表面細胞恢復(fù)分裂能力 c.形成愈傷組織，促進生根 d.與一定量的細胞分裂素配合共同誘導不定芽的分化、側(cè)芽的萌發(fā)與生長、胚狀體 的誘導。（2） 細胞分裂素jKT/KIN、6-BA（最常用）、ZT（玉米素）、ZIPk作用：a.促進細胞的分裂和分化 b.誘導芽的分化 c.促進側(cè)芽的萌發(fā)和生長 d.抑制衰老分裂素/生長素比例高時產(chǎn)生芽,比例低時產(chǎn)生根（3） 赤霉素（GA3）不耐熱，應(yīng)采用過濾滅菌j作用：a.誘導莖的細胞伸長，對矮生型植物恢復(fù)成高生型特別有效，對根無效 b.對形成層的細胞分化有影響，往

13、往同生長素有協(xié)同作用。IAA/GA比值高有利于 木質(zhì)部的分化，比值低有利于韌皮部的分化。 c.破除種子、鱗莖、塊莖休眠，使之提前萌發(fā)。 d.對生長素和細胞分裂素的活性有增效作用（4） 脫落酸（ABA）j作用：a.抑制蛋白質(zhì)的合成 b.抵消和抑制生長素、細胞分裂素、GA的作用 c.誘導休眠、促進衰老和脫落（4） 附加物常用的附加物：瓊脂、活性炭、瓊脂糖、天然復(fù)合物（椰乳、酵母提取物等）等。9、 培養(yǎng)基的種類（按無機鹽濃度不同）（1） 高無機鹽含量培養(yǎng)基j鉀鹽、銨鹽和硝酸鹽含量較高，微量元素種類齊全，養(yǎng)分數(shù)量及比例比較合適，廣泛用于植物的器官、花藥、細胞及原生質(zhì)體的培養(yǎng)。kMS、LS、BL、BM、

14、ER培養(yǎng)基。（2） 高硝態(tài)氮培養(yǎng)基j含較高的硝酸鉀和VB1，氨態(tài)氮的含量低，適合于木本植物、十字花科植物和單子葉植物的組織和花藥培養(yǎng)。kB5、N6、SH培養(yǎng)基（3） 中等無機鹽含量培養(yǎng)基j大量元素約為MS培養(yǎng)基的一半，微量元素種類減少，但含量較MS的高，維生素種類比MS多，如增加了生物素、葉酸等。適合于花藥培養(yǎng)。kNitch，NT、H、Miller培養(yǎng)基（4） 低無機鹽含量培養(yǎng)基j大量元素含量大幅度降低而且種類減少，有機含量相對也很低。多數(shù)用于生根培養(yǎng)基。k White、Heller、WS、HE、HB培養(yǎng)基10、 初代培養(yǎng)：指用來第一次接種外植體的培養(yǎng)基。繼代培養(yǎng)：指用來接種繼初代培養(yǎng)物的培養(yǎng)

15、基。11、 根據(jù)其營養(yǎng)水平不同，培養(yǎng)基可分為基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基（就是通常稱呼的培養(yǎng)基）：主要有MS、White、 N6、B5 、改良MS、Heller、Nitsh、SH、 Miller等。完全培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，根據(jù)試驗的不同需要，附加一些物質(zhì)，如生長調(diào)節(jié)物質(zhì)和其他復(fù)雜有機物質(zhì)等。12、培養(yǎng)條件的選擇1 光照：培養(yǎng)中光照主要表現(xiàn)在光強、光質(zhì)、以及光周期等方面。 a.光周期的需要與否，應(yīng)根據(jù)植物種類、培養(yǎng)的目的來決定。最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。 愈傷組織誘導階段，一般采用三種做法：全暗、周期性光照、散射性光照。依據(jù)植物種類不同做法不同，多數(shù)植物適合全暗或周

16、期性光照；器官發(fā)生階段：一般給予周期性光照比較好。 b.光照強度對培養(yǎng)細胞的增殖和器官的分化有重要影響。一般來說，光照強度較強，幼苗生長的粗壯，而光照強度較弱幼苗容易徒長。高光量可以降低植物體內(nèi)生長素水平，低光量使植物體內(nèi)生長素素水平較高，容易生根 離體培養(yǎng)條件下常用的光量，一般為1000-4000lx（勒克斯）。離體培養(yǎng)中通常難以達到4000lx，一般光量在2000-3000lx。 c. 光質(zhì)對愈傷組織誘導，培養(yǎng)組織的增殖以及器官的分化都有明顯的影響。 離體培養(yǎng)條件下，一般用日光燈進行光照，光譜成分主要是藍紫光，波長為419-467nm。對芽分化有效光譜成分為藍紫光，根分化則受600-680

17、nm所刺激。2 溫度：培養(yǎng)都是在2327之間進行，一般采用25±2。3 濕度：組織培養(yǎng)中濕度的影響有兩個方面：a.培養(yǎng)容器內(nèi)的濕度條件，容器內(nèi)主要受培養(yǎng)基水分含量和封口材料的影響。 b. 環(huán)境的濕度條件。環(huán)境的相對濕度一般要求7080%。常用加濕器或經(jīng)常灑水的方法來調(diào)節(jié)濕度。4 PH值：不同的植物對培養(yǎng)基最適PH值的要求是不同的，大多在5.5-6.5左右，一般培養(yǎng)基皆要求5.8。 一般來說pH值高于6.5時，培養(yǎng)基全變硬；低于5時，瓊脂不能很好地凝固。因為高溫滅菌會降低pH值（約0.2-0.3個pH值）因此在配制時常提高pH值0.2-0.3單位。5 滲透壓：通常1-2個大氣壓對植物生

18、長有促進作用，2個大氣壓以上就對植物生長有阻礙作用，而5-6個大氣壓植物生長就會完全停止，6個大氣壓植物細胞就不能生存。滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)：糖、甘露醇、山梨醇 培養(yǎng)基各種物質(zhì)中，糖對培養(yǎng)基滲透壓起決定性作用。因此調(diào)節(jié)滲透壓往往從調(diào)節(jié)糖濃度著手。糖除了作為滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)外，還是培養(yǎng)基重要的碳源和能源。另外，甘露醇，山梨醇等也可以作為調(diào)節(jié)物質(zhì)。 6 氣體：氧氣是培養(yǎng)中必需的因素，瓶蓋封閉時要考慮通氣問題，可用附有濾氣膜的封口材料。通氣最好的是棉塞封閉瓶口，但棉塞易使培養(yǎng)基干燥，夏季易引起污染。固體培養(yǎng)基可加進活性炭來增加通氣度，以利于發(fā)根。培養(yǎng)室要經(jīng)常換氣，改善室內(nèi)的通氣狀況。液體振蕩培養(yǎng)時，要考慮振

19、蕩的次數(shù)、振幅等，同時要考慮容器的類型、培養(yǎng)基等。 13、 褐變：在植物組織培養(yǎng)中，外植體在誘導脫分化或再分化過程中，自身組織從表面向培養(yǎng)基釋放褐色物質(zhì)，以致培養(yǎng)基逐漸變成褐色，外植體也隨之進一步變褐而死亡的現(xiàn)象。褐變的主要原因：植物品種 研究表明，在不同品種間的褐變現(xiàn)象是不同的。由于多酚氧化酶，而有些花卉品種的外植體在接種后不容易褐變。因此，在培養(yǎng)過程中應(yīng)該有所選擇，對不同的品種分別進行處理。 生理狀態(tài) 由于外植體的生理狀態(tài)不同，所以在接種后褐變程度也有所不同。一般來說，處于幼齡期的植物材料褐變程度較淺，而從已經(jīng)成年的植株采收的外植體，由于含醌類物質(zhì)較多，因此褐變較為嚴重。一般來說，幼嫩的組

20、織在接種后褐變程度并不明顯，而老熟的組織在接種后褐變程度較為嚴重。 培養(yǎng)基成分 濃度過高的無機鹽會使某些觀賞植物的褐變程度增加，此外，細胞分裂素的水平過高也會刺激某些外植體的多酚氧化酶的活性，從而使褐變現(xiàn)象加深。 培養(yǎng)條件不當 如果光照過強、溫度過高、培養(yǎng)時間過長等，均可使多酚氧化酶的活性提高，從而加速被培養(yǎng)的外植體的褐變程度。褐變的防止措施：選擇合適的外植體。一般來說，最好選擇生長處于旺盛的外植體，這樣可以使褐變現(xiàn)象明顯減輕。 對外植體進行預(yù)處理。對較易褐變的外植體材料進行預(yù)處理可以減輕酚類物質(zhì)的毒害作用。選擇適宜的培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件。無機鹽成分、適宜的蔗糖濃度及激素水平、適宜溫度、在黑暗條件

21、下進行培養(yǎng)、及時繼代培養(yǎng)均可以減輕材料的褐變現(xiàn)象。添加褐變抑制劑與吸附劑。褐變抑制劑主要包括抗氧化劑和PPO的抑制劑，還原劑如抗壞血酸、半胱氨酸等，均能夠較為有效地避免或減輕很多外植體的褐變現(xiàn)象。另外，使用0.1%-0.5%的活性炭對防止褐變也有較為明顯的效果。改變培養(yǎng)方式。進行細胞篩選和多次轉(zhuǎn)移。在組織培養(yǎng)過程中，經(jīng)常進行細胞篩選，可剔除易褐變的細胞。14、 玻璃化苗：植物組織培養(yǎng)中出現(xiàn)的呈半透明狀的、畸形的試管植物，它不能移栽成活于土壤或其他基質(zhì)中。當植物材料不斷地進行離體繁殖時，有些培養(yǎng)物的嫩莖、葉片往往會呈半透明水漬狀，這種現(xiàn)象通常稱為玻璃化。它的出現(xiàn)會使試管苗生長緩慢、繁殖系數(shù)有所下

22、降。玻璃化為試管苗的生理失調(diào)癥。 克服玻璃化苗的防范措施：j適當控制培養(yǎng)基中無機營養(yǎng)成分，減少培養(yǎng)基中的氮素含量。k適當提高培養(yǎng)基中蔗糖和瓊脂的濃度。適當提高培養(yǎng)基中蔗糖的含量，可降低培養(yǎng)基的滲透勢，減少外植體從培養(yǎng)基中獲得過多的水分。而適當提高培養(yǎng)基中瓊脂的含量，可降低培養(yǎng)基的供水能力，造成細胞吸水阻遏，也可降低玻璃化。適當降低細胞分裂素和赤霉素的濃度。增加自然光照，控制光照時間?？刂坪脺囟取峒ぬ幚砜煞乐尾ＡЩ陌l(fā)生。改善培養(yǎng)器皿的通風。增加容器通風，降低瓶內(nèi)濕度及乙烯含量，改善氣體交換狀況，如使用棉塞、濾紙片或通氣好的封口膜封口，可有效防治試管苗玻璃化。在培養(yǎng)基中添加其他物質(zhì)，如添加間苯

23、三酚或根皮苷，可有效地減輕試管苗玻璃化。第4章 植物脫毒與離體無性繁殖技術(shù)1、 名詞解釋：j植物離體無性繁殖技術(shù)：利用離體培養(yǎng)技術(shù)，將來自優(yōu)良植物的莖尖、腋芽、葉片、鱗片等器官、組織和細胞進行離體培養(yǎng)，在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致植物的技術(shù)。k植物脫毒技術(shù)：利用植物莖尖組織培養(yǎng)，結(jié)合血清學病毒檢測技術(shù)，在防蚜傳毒條件下，將影響作物正常生長的植物病毒全部脫除的高新農(nóng)業(yè)技術(shù)。莖尖培養(yǎng)脫毒：采取莖尖分生組織離體培養(yǎng)獲取無病毒試管苗的方法。植物器官發(fā)生：離體培養(yǎng)的組織或愈傷組織分化成不定根、不定芽等器官的過程。植物細胞脫分化：已有特定結(jié)構(gòu)和功能的植物組織的細胞，在一定條件下被誘導改變原有的發(fā)育途徑，逐步

24、失去原有的分化狀態(tài)，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂蟹稚芰Φ呐咝图毎倪^程。外植體：無菌條件下，離體培養(yǎng)于人工培養(yǎng)基上的、用于達到某種培養(yǎng)目的的原始植物材料。P45 （植物體上切下來的進行培養(yǎng)的部分組織或器官 P74）無性系：一個品種通過無性繁殖可產(chǎn)生在遺傳上等同的多個拷貝，其中由一個個體通過無性繁殖產(chǎn)生的一個群體稱為一個無性系。2、植物組織培養(yǎng)的一般過程：（1） 材料的制備j植物材料（外植體）的制備：材料必須完全無菌，即植物組織必須先進行消毒；外植體大小和形狀一般沒有嚴格要求。k培養(yǎng)基的準備：MS培養(yǎng)基（基本培養(yǎng)基）（2） 愈傷組織的誘導愈傷組織的誘導形成可分為誘導期、分裂期和分化期。j誘導期的長短由植物種類、

25、外植體生理狀況和外部因素（光照、外源激素）決定。 誘導期特點：代謝活化了，細胞內(nèi)的合成代謝加強，但是細胞大小和外植體一樣，沒多大改變。k分裂期特點：外層細胞進行分裂，中間細胞常不分裂，細胞數(shù)目增加，體積變小，細胞核和核仁增到最大。分裂期特點：細胞分裂基本停止，細胞平均大小相對穩(wěn)定，細胞內(nèi)發(fā)生生理代謝等變化而開始形成一些不同形態(tài)和功能的細胞。 根據(jù)形態(tài)變化把愈傷組織的形成分為3個時期，但實際上它們并不是嚴格區(qū)分的，特別是分裂期和形成期往往可以出現(xiàn)在同一塊組織上。 雖然細胞脫分化的結(jié)果在大多數(shù)情況下是形成愈傷組織，但這絕不意味著所有的細胞脫分化的結(jié)果都必然形成愈傷組織。相反，脫分化后可直接分化為胚

26、性細胞而形成體細胞胚。（3） 繼代培養(yǎng)繼代培養(yǎng)：愈傷組織在培養(yǎng)基上生長一段時間后，由于營養(yǎng)物質(zhì)枯竭，水分散失，以及代謝產(chǎn)物的積累，必須轉(zhuǎn)移到新鮮培養(yǎng)基上培養(yǎng)。這個過程稱為繼代培養(yǎng)。 如果讓愈傷組織留在原培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)而不繼代，它們則不可避免地發(fā)生分化，產(chǎn)生新的結(jié)構(gòu)。通過繼代培養(yǎng)，可使愈傷組織無限期地保持在不分化的增殖狀態(tài)，即可無限制地進行細胞分裂，維持其不分化的狀態(tài)。（4） 愈傷組織的分化在愈傷組織培養(yǎng)物中，細胞分裂常以無規(guī)則方式發(fā)生，并產(chǎn)生無明顯形態(tài)或極性的無序結(jié)構(gòu)組織塊，這時雖然在愈傷組織中發(fā)生了細胞分化，形成維管化組織和瘤狀結(jié)構(gòu)，但并無器官發(fā)生。只有滿足某些條件，才可從愈傷組織發(fā)生再分

27、化而產(chǎn)生苗或根的分生組織，甚至胚狀體，進而使它發(fā)育成苗或完整植株。在組織培養(yǎng)中，從外植體形成器官或無性系的形態(tài)發(fā)生，有兩種方式：j不定芽方式：細胞或愈傷組織培養(yǎng)物，通過形成不定芽再生成植株，這是細胞核組織培養(yǎng)中常見的器官發(fā)生方式。k胚狀體方式：由培養(yǎng)細胞誘導分化出的具胚芽、胚根、胚軸的胚狀結(jié)構(gòu)，進而長成完整植株（5） 生根培養(yǎng)當材料增殖到一定數(shù)量后，就要使部分培養(yǎng)物分流到生根培養(yǎng)階段。若不能及時將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基上去，就會使久不轉(zhuǎn)移的苗子發(fā)黃老化，或因過分擁擠而使無效苗增多造成拋棄浪費。根培養(yǎng)是使無根苗生根的過程，這個過程目的是使生出的不定根濃密而粗壯。生根培養(yǎng)基：1/2或者1/4MS培養(yǎng)

28、基，全部去掉細胞分裂素，并加入適量的生長素(NAA、IBA等)。（6） 試管苗馴化與移栽試管苗由于是在無菌、有營養(yǎng)供給、適宜光照和溫度近100%的相對濕度環(huán)境條件下生長的，因此，在生理、形態(tài)等方面都與自然條件生長的正常小苗有著很大的差異。所以必須通過煉苗，例如通過控水、減肥、增光、降溫等措施，使它們逐漸地適應(yīng)外界環(huán)境，從而使生理、形態(tài)、組織上發(fā)生相應(yīng)的變化，使之更適合于自然環(huán)境，保證試管苗順利移栽成功。j移栽前煉苗k移栽和幼苗的管理a. 保持小苗的水分供需平衡b. 防止菌類滋生c. 一定的溫度、光照條件d. 保持基質(zhì)適當?shù)耐庑?、 快速繁殖：指利用組織培養(yǎng)的方法，使植物的部分器官、組織在人工

29、控制的適宜條件下，迅速擴大培養(yǎng)，并移植到溫室或農(nóng)田繁殖出大量幼苗的繁殖方法。(1)種類：植物組織培養(yǎng)快速繁殖、全光照育苗法、根莖扦插法(2)特點：j繁殖速度快；k使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時省工；節(jié)約空間有利于植物的工廠化生產(chǎn)；在無菌條件下進行，不受病蟲害侵害。(3)用途：j加速某些難繁或繁殖速度低的植物，特別是一些珍稀名貴的花卉，需要發(fā)展的瀕危植物的繁殖。k用有性繁殖的方法難以保持品種特性的異花授粉植物，如油棕、獼猴桃、非洲菊等。需要去除病毒的植物。原種很少，生產(chǎn)上又急需推廣的植物。(4)過程：無菌培養(yǎng)物的建立、芽的增殖、誘導生根、試管苗的移植。a.外植體的選擇：外植體選擇首先決定于第二階段

30、芽的增殖所采用的途徑。j通過腋芽的形成來增加芽的數(shù)量時，應(yīng)從帶有營養(yǎng)芽的部分得到外植體，如：u普通莖尖、芽或帶芽的莖切段（非脫毒繁殖）v芽已膨大但芽鱗片還未張開時最為合適w取頂芽或上部的芽作為分生組織或莖尖培養(yǎng)（草本植物如菊花）x使用部分返幼階段或年齡較低的根蘗苗或不定芽（多年生的木本植物）k通過不定芽途徑使芽增殖時，可根據(jù)不同的植物采用不同的外植體，如根、莖、葉或花器官的各部分，在自然界中能夠產(chǎn)生不定芽的器官應(yīng)當首先被采用。使用體細胞胚胎發(fā)生途徑使芽增殖時，常使用胚分生組織或生殖器官作為外植體。b.外植體的消毒c.芽的誘導及增殖：增殖的3條途徑：a.通過腋芽的形成和生長b.外植體或愈傷組織上

31、不定芽的形成c.胚狀體發(fā)生由于外植體種類的不同，在增殖時可能采用的途徑不同。j促進腋芽的形成和生長：細胞分裂素，但生長素過多易導致愈傷化。k誘導不定芽的形成：加入適當?shù)募毎至阉睾蜕L素。誘導胚狀體的形成：在自然界只有少數(shù)植物可以通過體細胞胚胎發(fā)生而產(chǎn)生胚狀體，先加入2，4-D誘導胚狀體的發(fā)生，后轉(zhuǎn)移到降低濃度至無生長素的培養(yǎng)基上使胚狀體成熟和生長。d.根的誘導：使第二階段通過腋芽生長和不定芽形成途徑得到的嫩枝生根產(chǎn)生小植株，以便移栽。u剪下無根苗轉(zhuǎn)接到生根培養(yǎng)基中，如MS、B5、White等培養(yǎng)基，都可用于誘導生根，但是其含鹽濃度要適當加以稀釋。注：j除White外，都富含N，P，K鹽，它們

32、都抑制根的發(fā)生。因此，應(yīng)將它們降低到1/2，1/3或1/4，甚至更低的水平。k生根培養(yǎng)基適當加大生長素的濃度，不用或少用細胞分裂素，生長素濃度在0.1-10mg/l，使用較多的是NAA，其次為IAA和IBA，生長素濃度過高時容易引起愈傷組織化和抑制根的生長。培養(yǎng)基中蔗糖的濃度降低到1.0-1.5%，以增強植株的自養(yǎng)能力。培養(yǎng)基不宜過硬以免影響生根，可在培養(yǎng)基中加入1%左右的活性碳。為提高小植株的光合能力，可將光強度增加到3000-10000lux，光周期可用24小時光照或16小時，8小時黑暗以利于光形成建成。v對較難誘導生根的植物，可先半無根苗浸泡在高濃度生長素（100mg/L）的無菌水中幾小

33、時到1天，用無菌水洗凈生長素后再接種到生根培養(yǎng)基?；蛟谏囵B(yǎng)基中加入適量的根皮苷或根皮酚（間苯三酚）以促進根的形成，濃度約150 mg/L。w嫁接到根系發(fā)達、抗逆性強的合適砧木上，如三倍體西瓜苗接到瓠子上。e.移栽4、 脫毒的方法：(1) 熱處理法a. 原理：根據(jù)病毒與寄生細胞對高溫的忍耐程度不同，選擇適當?shù)臏囟群吞幚頃r間，植物組織中的很多病毒被部分地或完全地鈍化而可控制其活動，但很少傷害甚至不上火寄主組織，從而讓植物細胞加快生長，使生長點附近不帶病毒，從而達到脫毒的目的。b.方式：j50左右的熱水浸泡30mink35-38熱空氣處理14-28h或更長變溫處理，32和38每隔8h變換一次。(

34、2) 抗病毒藥劑法a. 原理：抗病毒藥劑在三磷酸狀態(tài)下會阻止病毒RNA帽子結(jié)構(gòu)形成而達到除去病毒的效果。b. 常用抗病毒化學藥物：病毒唑、5-二氫尿嘧啶（DHT）、DA-DHT(3) 花藥培養(yǎng)法、莖尖嫁接脫毒法、愈傷組織培養(yǎng)法、胚珠培養(yǎng)法5、 脫毒苗的鑒定j植株直接測定法 k指示植物法 抗血清鑒定法 電鏡檢測法 酶聯(lián)免疫鑒定法6、 莖尖培養(yǎng)脫毒原理：植物體內(nèi)病毒靠維管束系統(tǒng)移動，分生組織中沒有維管束存在，病毒只靠胞間連絲移動，速度很慢，難以追上生長活躍的分生組織，所以旺盛生長的根尖、莖尖一般都無病毒或很少有病毒分布。7、 在切取莖尖時越小越好，但太小則不易成活，過大又不能保證完全除去病毒；不同

35、種類的植物和不同種類的病毒在莖尖培養(yǎng)時切取的莖尖大小也不相同。一般切取0.2-0.5m帶1-2個葉原基的莖尖進行培養(yǎng)即可。第5章 單倍體誘導和染色體加倍1、 花藥培養(yǎng)：是指用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，將花粉發(fā)育到一定階段的完整花藥，通過無菌操作技術(shù)，接種到人工培養(yǎng)基上，誘導形成單倍體再生植株。（屬于器官培養(yǎng)范疇）2、 花藥培養(yǎng)的基本程序：外植體選擇外植體（花蕾）預(yù)處理外植體消毒-剝?nèi)』ㄋ?接種-誘導培養(yǎng)-分化培養(yǎng)-植株再生。3、 花藥培養(yǎng)的方法(1) 花藥培養(yǎng)材料的選擇：花藥培養(yǎng)材料的選擇關(guān)鍵在于選取花粉處于一定發(fā)育期的花藥。一般來講，外觀上從現(xiàn)蕾初期到開花初期的成功率較高；解剖上，處于四分體時期到單

36、核期或單核靠邊期為好。(2) 材料滅菌：采集花蕾最好從健壯無病植株中選材，花藥在消毒前，應(yīng)先進行預(yù)處理，將花蕾剪下放入水中，在冰箱為4-5下保持3-4d，低溫貯藏后，進行花藥的滅菌消毒?；ㄋ幍臏缇荆簀選取所需的一種或幾種消毒劑，如70%乙醇、1%次氯酸鈉、0.5%新潔爾滅，備好待用；k去除花萼，滴入少許洗潔精，用自來水沖洗2-4h；在無菌條件下，用70%乙醇表面消毒30s后，再用不同消毒劑繼續(xù)消毒；用無菌水清洗4-5次；無菌濾紙吸干花蕾表面水分后，剝掉花瓣取下花藥，立即接種于無菌培養(yǎng)基上，一個10mL的試管接種20個花藥；在25的培養(yǎng)箱中進行暗培養(yǎng)；每隔3-5d觀察記錄一次，直到結(jié)果不再變

37、化為止。(3) 接種：在無菌條件下，將花藥從花蕾中取出并及時接種到培養(yǎng)基上。取花藥時，應(yīng)注意：j盡量避免損傷花藥（否則接種后易從受傷部分產(chǎn)生愈傷組織或胚狀體）k徹底去除花絲部分（否則不利于花藥內(nèi)小孢子的啟動及愈傷組織或胚狀體的形成）(4) 培養(yǎng)基的選擇與滅菌a. 培養(yǎng)基的選擇：花藥培養(yǎng)所常用的培養(yǎng)基為MS、B5、Nitsch、N6等，培養(yǎng)基的種類因植物種類不同而不同，附加成分主要為蔗糖和激素（主要是生長素類(2,4-D、NAA、IAA、IBA等)和細胞分裂素類(6-BA、KT、ZT)）。b. 培養(yǎng)基的滅菌：常規(guī)采用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌，121，滅菌15-20min。(5) 培養(yǎng)方式和培養(yǎng)條件a.

38、 培養(yǎng)方式：j在瓊脂固化培養(yǎng)基表面培養(yǎng)k在加入30%聚蔗糖（Ficoll)的液體培養(yǎng)基表面漂浮培養(yǎng)利用液-固雙層培養(yǎng)基培養(yǎng)b. 培養(yǎng)條件：u溫度：早期的工作多在25-28下進行培養(yǎng)，最初先在較高溫度培養(yǎng)更好。 v光照：愈傷組織的分化原則上都應(yīng)在光照條件下進行，但對光照溫度和光照 時間的要求則因物種而異。(6) 再生單倍體植株：通過花藥培養(yǎng)誘導單倍體植株再生模式有兩種途徑：j經(jīng)胚狀體的再生途徑k經(jīng)過愈傷組織、器官分化的再生途徑。兩條途徑并不是完全獨立的，許多植物可通過改變培養(yǎng)基種類及其添加成分而改變單倍體的誘導形成途徑或使兩種途徑并存。4、 花粉培養(yǎng)：是指當花粉發(fā)育到一定階段，從花藥中分離出單個

39、花粉粒，為獲得單倍體植株接種到特定培養(yǎng)基上，誘導其長出愈傷組織，再將愈傷組織移植到另一種特定的培養(yǎng)基上，誘導分化出根、莖、葉，成為完整植株的培養(yǎng)途徑。（是指將離體的花粉粒接種到培養(yǎng)基上，誘導形成單倍體再生植株的技術(shù)。）細胞培養(yǎng)范疇5、 花粉培養(yǎng)的方法(1) 花粉的分離：j機械分離法k散落花粉法擠壓法(2) 花粉的預(yù)處理：a. 低溫處理：取花粉處于適合發(fā)育期的花蕾，放在冰箱里4-10，進行1-15d的低溫處理，再轉(zhuǎn)移到25條件下培養(yǎng)。b. 高溫處理：先用較高溫度（32）培養(yǎng)游離小孢子3d后，再于25下進行正常的培養(yǎng)（蕓薹屬植物的花粉）。c. 藥劑預(yù)處理：u甘露醇預(yù)處理v乙烯利處理w高糖濃度預(yù)處理

40、x秋水仙素預(yù)處理d. 離心預(yù)處理：在花粉培養(yǎng)中，在從花蕾取出花藥前1h，5條件下進行低溫離心。e. 其它預(yù)處理：射線照射、磁場處理單核期的花蕾。(3) 培養(yǎng)基：一般選用Nitsch作為基本培養(yǎng)基，其中含有硝酸鈣、硫酸、檸檬酸鐵、酵母浸出液和椰乳等。(4) 花粉培養(yǎng)途徑:a.淺層液體培養(yǎng)途徑 b.看護培養(yǎng)途徑 c.微室培養(yǎng)途徑(5) 再生小植株的馴化和移植花粉和花藥培養(yǎng)均可產(chǎn)生再生單倍體植株，但花粉培養(yǎng)是通過胚狀體階段分化發(fā)育為單倍體植株；而花藥在誘導培養(yǎng)基上，先形成愈傷組織，再誘導分化成植株?；ㄋ幣囵B(yǎng)獲得的再生植株可能是花粉發(fā)育再生的單倍體也可能是來源于花藥壁、絨氈層等的體細胞再生的二倍體。要

41、順利通過這一關(guān)需采用逐步過渡的方式，使其適應(yīng)從易養(yǎng)到自養(yǎng)。j苗馴化：恢復(fù)葉綠體功能，各類試管苗的馴化期因植物種類的不同而不同。k培養(yǎng)基沖洗干凈，防止微生物侵染。從培養(yǎng)基到土壤，注意營養(yǎng)土配方的篩選。移植后保持高的空氣濕度和低的土壤濕度。6、 花藥培養(yǎng)和花粉培養(yǎng)的不同點：（1）培養(yǎng)概念不同：花藥培養(yǎng)是指用植物組織培養(yǎng)技術(shù)，將花粉發(fā)育到一定階段的完整花藥，通過無菌操作技術(shù)，接種到人工培養(yǎng)基上，誘導形成單倍體再生植株；花粉培養(yǎng)是指將離體的花粉粒接種到培養(yǎng)基上，誘導形成單倍體再生植株的技術(shù)。花粉培養(yǎng)不受花藥的藥壁、藥隔、花絲等體細胞的干擾。（2） 培養(yǎng)層次不同：花藥培養(yǎng)屬于器官培養(yǎng)范疇；花粉培養(yǎng)屬于細

42、胞培養(yǎng)范疇。（3）培養(yǎng)過程不同：花藥培養(yǎng)相對較容易，技術(shù)比較成熟，但最后需要對培養(yǎng)成的植株進行染色體倍數(shù)檢測；花粉培養(yǎng)雖沒有藥壁等二倍體細胞干擾，但技術(shù)更復(fù)雜，難度較大。7、染色體加倍的方法：適宜濃度的秋水仙素P114第6章 植物胚胎培養(yǎng)1、 植物胚胎培養(yǎng)：指采用人工方法把胚從種子、子房或胚珠中分離出來，再放在無菌條件下，讓其進一步生長發(fā)育，一直形成幼苗的過程。（包括成熟胚培養(yǎng)、幼胚培養(yǎng)，廣義還包括子房培養(yǎng)、胚乳培養(yǎng)、離體授粉等技術(shù)）(1)培養(yǎng)對象：成熟胚、幼胚、胚珠、子房2、 胚胎培養(yǎng)的意義：j克服遠緣雜交不親和性和幼胚敗育k打破種子休眠、提高種子萌發(fā)率、縮短育種周期成熟胚培養(yǎng)快速繁殖通過胚

43、胎培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)基因受體材料誘導胚性愈傷組織。3、 離體胚培養(yǎng)的發(fā)育途徑：a. 按正常胚胎發(fā)育途徑形成植株u成熟胚：正常發(fā)育形成小苗。v未成熟胚：維持胚的生長，進行正常的胚胎發(fā)育成熟，完成胚胎發(fā)育的全過程。b.脫分化形成愈傷組織 c.胚“早熟萌發(fā)”4、 胚胎培養(yǎng)的方法植物胚胎培養(yǎng)可分為成熟胚培養(yǎng)和幼胚培養(yǎng)。(1) 成熟胚培養(yǎng)：將子葉期以后的胚從母體上分離出來 ，放在無菌的人工環(huán)境條件下使其進一步生長發(fā)育形成幼苗的技術(shù)。一般指子葉期至發(fā)育成熟的胚的培養(yǎng)，屬于自養(yǎng)型，只需極簡單的含無機鹽和糖的培養(yǎng)基。(2) 幼胚培養(yǎng)：將子葉期以前的具胚結(jié)構(gòu)的幼小胚從母體上分離出來，放在無菌的人工環(huán)境條件下使其進一步生

44、長發(fā)育形成幼苗的技術(shù)。指胚齡處于原胚期、球形胚、心型期、魚雷型的培養(yǎng)，屬于異養(yǎng)性，培養(yǎng)基成分復(fù)雜。a. 培養(yǎng)方法：遠緣雜交幼胚培養(yǎng)雜交取材 消毒 剝?nèi)∮着呒敖臃N 培養(yǎng) 馴化移栽與染色體加倍b. 幼胚培養(yǎng)的生長方式：u胚胎發(fā)育：幼胚接種到培養(yǎng)基上后，仍按照在活體內(nèi)的發(fā)育方式發(fā)育，最后形成成熟的胚，然后再按種子萌發(fā)途徑出苗形成完整植株。v早熟發(fā)育：幼胚接種，離體胚不繼續(xù)胚性生長，而是在培養(yǎng)基上迅速萌發(fā)成幼苗，在大多數(shù)情況下，一個幼苗萌發(fā)成一個植株。w多數(shù)植物幼胚形成愈傷組織，再分化成胚狀體或形成芽苗，最后形成植株。一般由胚形成的愈傷組織大多為胚性愈傷組織，這種易分化形成植株。5、胚珠培養(yǎng)：指在人工

45、控制的條件下，對胚珠進行離體培養(yǎng)使其生長發(fā)育形成幼苗的技術(shù)。(1)種類：a.受精胚珠培養(yǎng) b.未受精胚珠培養(yǎng)：為試管受精提供雌配子體。6、胚乳培養(yǎng)：指將胚乳組織從母體上分離出來，提供離體培養(yǎng)技術(shù)，使其發(fā)育成完整植株的技術(shù)。(1)離體胚乳的發(fā)育及其植株的形成過程：j愈傷組織的誘導k愈傷組織的再分化胚乳苗的生根培養(yǎng)7、 子房培養(yǎng)：指將子房從母體植株上摘下，放在無菌的人工環(huán)境條件下，使其進一步生長發(fā)育形成幼苗的技術(shù)。(1) 種類：a. 授粉前子房培養(yǎng)：為了獲得孤雌生殖的單倍體植株，適用于那些胚囊分離特別困難的植物。b. 授粉后子房培養(yǎng)：適用于那些獲得種子特別困難，胚分離不易操作的植物，以獲得種子或果

46、實或植株。8、 離體受精：也稱試管受精，是指將雌蕊、子房或胚珠置于無菌條件下離體培養(yǎng)，在適宜時機進行人工授粉，使其受精形成具有生活力的種子。(1) 意義：可應(yīng)用于育種工作中克服自交不親和性和雜交不親和性，特別是克服花粉在柱頭上不萌發(fā)或萌發(fā)后不能進入花柱，或在花柱中生長緩慢，使配子不能如期融合方面有著極其重要的意義。(2) 方法：a. 子房試管受粉:j直接引入法k注射法b. 胚珠試管受粉:哺育法柱頭接近法c.人工分離卵細胞、精子：真正意義上的離體受精第7章 植物細胞培養(yǎng)與次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)1. 植物細胞培養(yǎng)：指在離體條件下對植物單個細胞或小的細胞團進行培養(yǎng)使其增殖的技術(shù)。(1) 分類：a. 根據(jù)研

47、究目的不同分為：誘變培養(yǎng)、次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)培養(yǎng)、突變體篩選培養(yǎng)。b. 根據(jù)培養(yǎng)規(guī)模不同分為：小規(guī)模培養(yǎng)、大批量培養(yǎng)。c. 根據(jù)培養(yǎng)方式不同分為：懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、飼喂細胞層培養(yǎng)。2. 細胞培養(yǎng)首先需要分離單細胞，用于細胞培養(yǎng)的細胞來源主要有兩個：j植物的組織或器官k離體培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織（1） 由植物組織或器官分離單細胞(1) 分離方法：a.機械法 b.酶解法由完整的植物器官分離單細胞，葉片是分離單細胞的最好材料。a. 機械法：適用于薄壁組織排列松散，細胞間接觸點很少的情況。法1 用刀片刮葉片：撕去下表皮，露出葉肉細胞，用解剖刀刮下細胞，直接接種于液體培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，獲得單細胞。法

48、2 葉片研碎、離心：選取無菌或經(jīng)過消毒的葉片、嫩莖等，將其剪碎并研磨成勻漿，通過過濾和離心再接種于液體培養(yǎng)基中（或?qū)⒀兴榈慕M織先進行懸浮培養(yǎng)，再對懸浮培養(yǎng)物進行過濾和離心處理，去除其中的雜質(zhì)和較大的細胞團），獲得單細胞。b. 酶解法：果膠酶優(yōu)點缺點機械法j避免細胞受到酶的傷害k細胞無需質(zhì)壁分離只適用于薄壁組織排列松散，細胞間的接觸點很少的情況酶解法j應(yīng)用廣 k效率高j所用的酶會對細胞造成一定的傷害k容易引起細胞質(zhì)壁分離（2） 由離體培養(yǎng)產(chǎn)生的愈傷組織分離單細胞(1) 步驟：先誘導產(chǎn)生愈傷組織；將其反復(fù)繼代，使組織不斷增殖，提高愈傷組織的松散性；將愈傷組織在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并置于搖床上進行振蕩

49、培養(yǎng)，建立懸浮培養(yǎng)物。(2) 注意:a. 選擇適宜的外植體：幼胚、胚軸、子葉是最常使用的外植體。b.選擇適宜的培養(yǎng)基：較高濃度激素濃度，特別是生長素，必要的附加物質(zhì)，例如水解酪 蛋白、Pro、Gln。c.多次繼代的目的：使愈傷組織不斷增殖，擴大其數(shù)量，并獲得均勻一致疏松的愈傷組織。3.細胞懸浮培養(yǎng)：是將單個游離細胞或小細胞團懸浮在液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)增殖的技術(shù)。(1) 特點：j細胞可以不斷增殖，形成高密度 的細胞群體，適于大規(guī)模培養(yǎng)。k能夠提供大量較為均勻的細胞，為研究細胞的生長、分化創(chuàng)造方法和條件。(2) 應(yīng)用：j人工種子k次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)離體的原生質(zhì)體突變種篩選植物體(3) 培養(yǎng)基：對于用

50、愈傷組織制備的懸浮細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基以原愈傷組織繼代時的培養(yǎng)基除去瓊脂為好。為了提高細胞的分散度，對于生長素和細胞分裂素的比例需要進行一些調(diào)節(jié)。常用于細胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基有：MS、B5、ER。(在細胞的起始培養(yǎng)密度約為5*104個/mL或更高時才適用。)當細胞密度較低時，在培養(yǎng)基中還需補加其他成分，使培養(yǎng)基組成更豐富，才能用于細胞的培養(yǎng)。因為培養(yǎng)基成分和起始細胞密度是決定細胞培養(yǎng)成敗的關(guān)鍵，起始細胞密度越高，越容易誘導細胞發(fā)生分裂，對培養(yǎng)基成分的要求越寬松。(4) 最低有效密度：在懸浮細胞培養(yǎng)中，使懸浮培養(yǎng)細胞能夠增殖的最少接種量。因培養(yǎng)材料、原種培養(yǎng)條件，原種保存時間長短、培養(yǎng)基的成分不同而有

51、差異，一般為104105細胞/ml。(5) 活細胞測定： 活細胞率（%）=（5個視野中的活細胞數(shù)/5個視野中的細胞總數(shù)）*100%測定方法：j醋酸酯熒光素（FDA）染色法：在熒光顯微鏡下觀察，可看到活細胞發(fā)紅色熒光，死細胞和破損細胞則無。 FDA既不發(fā)熒光也不具極性，可自由進出細胞，在活細胞內(nèi)被酯酶裂解并能釋放出熒光素，由于熒光素不能自由穿越質(zhì)膜，因而在完整的活細胞內(nèi)積累。k酚藏紅花染色法：在光學顯微鏡下觀察，染成紅色的是死細胞，無色的是活細胞。(6) 在分批培養(yǎng)中，細胞數(shù)目增長變化情況表現(xiàn)為一條“S”形曲線，其生長周期為延滯期、對數(shù)生長期、穩(wěn)定期、衰亡期。(延滯期、對數(shù)生長期、直線生長期、減

52、慢期、靜止期)(7) 細胞生長量的測定方法：j細胞計數(shù)k細胞密實體積細胞鮮重和干重細胞有絲分裂指數(shù)的測定細胞計數(shù)：一般用血球計數(shù)板進行，先用鉻酸或果膠酶對細胞和細胞團進行處理，使其分散。(8) 細胞的同步化：指同一懸浮培養(yǎng)體系的所有細胞都同時通過細胞周期的某一特定時期。（指在培養(yǎng)中大多數(shù)細胞都能同時通過細胞周期的各個階段(G1、S、G2和M)）P143一般情況下，懸浮培養(yǎng)細胞都是不同步的，為取得一定程度的同步化，常用的處理方法有：a. 物理法：j分選法(濾膜過濾)k冷處理法b. 化學法：j饑餓法（斷絕供應(yīng)一種細胞分裂所必須的營養(yǎng)成分或激素） k抑制劑法（DNA合成抑制劑，羥基脲） 有絲分裂阻抑

53、（秋水仙素） 在進行同步化處理之前，細胞必須進行充分的活化培養(yǎng)。用于處理 的細胞系最好處于對數(shù)生長期。4、 單細胞培養(yǎng)技術(shù)(1) 植物細胞培養(yǎng)，按培養(yǎng)細胞數(shù)量的多少分為：單細胞培養(yǎng)、多細胞懸浮培養(yǎng)。按培養(yǎng)方法分為：懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、看護培養(yǎng)、微室培養(yǎng)、液體淺層培養(yǎng)等。(2) 植物單細胞培養(yǎng)的意義：j建立單細胞無性系k排除體細胞的干擾利于對細胞活動跟蹤觀察。(3) 單細胞培養(yǎng)方法：a.平板培養(yǎng)：將制備好的單細胞懸浮液，按照一定的細胞密度與一定量的瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，并倒入培養(yǎng)皿使之形成一薄層進行培養(yǎng)的方法。植板：將1份已調(diào)整好密度的單細胞懸浮液與4份35的固體培養(yǎng)基充分混合均勻，然后均勻的平鋪

54、與培養(yǎng)皿中，其厚度為1-2mm。待植板后的培養(yǎng)基完全凝固后，用石蠟或parafilm封口膜將培養(yǎng)皿封嚴以防污染。在25黑暗條件下培養(yǎng)3周即可長出肉眼可見的愈傷組織。植板率()(每平板形成的細胞團數(shù)/每平板接種的細胞數(shù))×100形成的細胞團數(shù)的計數(shù)法：j直接計數(shù)法k感光法（暗室的紅光下）b.看護培養(yǎng)：用一塊愈傷組織或植物離體組織看護單細胞使其生長增殖的一種單細胞培養(yǎng)方法c.微室培養(yǎng)：通過人工制造一個小室，將單細胞置于小室中的少量培養(yǎng)基上進行培養(yǎng)，使其分裂增殖形成細胞團的方法。(如使用帶凹穴的載玻片并加蓋玻片構(gòu)建微室)d.液體淺層培養(yǎng)：將含有單細胞的懸浮培養(yǎng)液置于一定培養(yǎng)器皿中，并使之在底部形成一薄層的靜止液體的培養(yǎng)方法。（淺層厚度以1mm為宜，最后用石蠟?zāi)し忾]器皿開口，置墊有濕濾紙的封閉容器內(nèi)進行培養(yǎng)）e.其他單細胞培養(yǎng)技術(shù)：j飼養(yǎng)層培養(yǎng)基技術(shù)k雙層濾紙植板培養(yǎng)方法(飼喂細胞層法和條件培養(yǎng)法)條件培養(yǎng)基：將細胞以最適的培養(yǎng)密度在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)一段時間，然后將培養(yǎng)液中的懸浮細胞去除，保留下來培養(yǎng)液與一定量的新培育基混合，制得的培養(yǎng)基即為條件培養(yǎng)基。5.培養(yǎng)植物細胞生產(chǎn)有用物質(zhì)的意義：j有些植