分光光度法測定蔗糖酶的米氏常數(shù)

1、精選優(yōu)質(zhì)文檔-傾情為你奉上分光光度法測定蔗糖酶的米是常數(shù)一實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?1. 用分光光度法測定蔗糖酶的米是常數(shù)和最大反應(yīng)速率。2. 了解底物濃度與酶反應(yīng)速率之間的關(guān)系3. 掌握分光光度計(jì)的使用方法二實(shí)驗(yàn)原理：酶是由生物體內(nèi)產(chǎn)生的具有催化活性的蛋白質(zhì)。它表現(xiàn)出特異的催化功能，因此叫生物催化劑。酶具有高效性和高度選擇性，酶催化反應(yīng)一般在常溫、常壓下進(jìn)行。在酶催化反應(yīng)中，底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過酶的濃度，在指定實(shí)驗(yàn)條件時(shí)，酶的濃度一定時(shí)，總的反應(yīng)速率隨底物濃度的增加而增大，直至底物過剩此時(shí)底物的濃度不再影響反應(yīng)速率，反應(yīng)速率最大。Michaelis應(yīng)用酶反應(yīng)過程中形成中間絡(luò)合物的學(xué)說，導(dǎo)出了米氏方程，給出了酶

2、反應(yīng)速率和底物濃度的關(guān)系：米氏常數(shù)是反應(yīng)速率達(dá)到最大值一半時(shí)的底物濃度。測定不同底物濃度時(shí)的酶反應(yīng)速率，為了準(zhǔn)確求得，用雙倒數(shù)作圖法，可由直線方程：以為縱坐標(biāo)，為橫坐標(biāo)，作圖，所得直線的截距是，斜率是，直線與橫坐標(biāo)的交點(diǎn)為。本實(shí)驗(yàn)用的蔗糖酶是一種水解酶，它能使蔗糖水解成葡萄糖和果糖。該反應(yīng)的速率可以用單位時(shí)間內(nèi)葡萄糖濃度的增加來表示，葡萄糖與3,5-二硝基水楊酸共熱后被還原成棕紅色的氨基化合物，在一定濃度范圍內(nèi)，葡萄糖的量和棕紅色物質(zhì)顏色深淺程度成一定比例關(guān)系，因此可以用分光光度計(jì)來測定反應(yīng)在單位時(shí)間內(nèi)生成葡萄糖的量，從而計(jì)算出反應(yīng)速率。所以測量不同底物（蔗糖）濃度的相應(yīng)反應(yīng)速率，就可用作圖法

3、計(jì)算出米氏常數(shù)值。三儀器與試劑：高速離心機(jī)一臺(tái)；分光光度計(jì)一臺(tái)；恒溫水浴一套；比色管（25ml）9支；稱液管（1ml）10支；稱液管（2ml）4支；試管（10ml）10支；3,5-二硝基水楊酸試劑（即DNS）；0.1mol.dm-3醋酸緩沖溶液；蔗糖酶溶液；蔗糖（分析純）；葡萄糖（分析純）。四實(shí)驗(yàn)步驟： 蔗糖酶的制取。在50ml的錐形瓶中加入鮮酵母10g，加入0.8g醋酸鈉，攪拌15-20min后使塊團(tuán)溶化，加入1.5ml甲苯，用軟木塞將瓶口塞住，搖動(dòng)10min，放入37的恒溫箱中保溫60h。取出后加入1.6ml的4mol/L的醋酸和5ml水，使PH為4.5左右?；旌衔镆悦糠昼?000轉(zhuǎn)的離心

4、機(jī)離心灶小時(shí)，混合物形成三層，將中層移出，注入試管中，為粗制酶液。 溶液的配制。（）0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（1mg/mL）：先在90下將葡萄糖烘1h，然后準(zhǔn)確稱取1g于100ml燒杯中，用少量蒸餾水溶解后，定量移至1000ml容量瓶中。（2）3,5-二硝基水楊酸試劑（即DNS）：6.3gDNS和262ml的 2mol/LNaOH加到酒石酸鉀鈉的熱溶液中（182g酒石酸鉀鈉溶于500ml水中），再加5g重蒸酚和5g亞硫酸鈉，微熱攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容到1000ml，貯于棕色瓶中備用。（3）0.1mol/L的蔗糖液：準(zhǔn)確稱取34.2g蔗糖溶解后定容至1000容量瓶中。 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作。在

5、9個(gè)50ml的容量瓶中，加入不同量0.1%葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液及蒸餾水，得到一系列不同濃度的葡萄糖溶液。分別吸取不同濃度的葡萄糖溶液1.0ml注入9支試管內(nèi)，另取一支試管加入1.0ml蒸餾水，然后在每支試管中加入1.5mlDNS試劑，混合均勻，在沸水浴中加熱5min后，取出以冷水冷卻，每支內(nèi)注入蒸餾水2.5ml，搖勻。在分光光度計(jì)上用540nm波長測定其吸光度。由測定結(jié)果作出標(biāo)準(zhǔn)曲線。 蔗糖酶米氏常數(shù)的測定。在支試管中分別加入0.1mol/L蔗糖液、醋酸緩沖溶液，總體積達(dá)2ml，于35水浴中預(yù)熱，另取預(yù)先制備的酶液在35水浴中保溫10min，依次向試管中加入稀釋過的酶液各2.0ml，準(zhǔn)確作用5min后，按次序加入0.5ml 2mol/L的NaOH溶液，搖勻，令酶反應(yīng)中停止，測定時(shí)，從每支試管中吸取0.5ml酶反應(yīng)液加入裝有1.5mlDNS試劑的25ml比色管中，加入蒸餾水，在沸水中加熱5min后冷卻，用蒸餾水稀至刻度，搖勻，540nm波長測定其吸光度。實(shí)驗(yàn)所需儀器設(shè)備五數(shù)據(jù)處理：由各反應(yīng)液測得的吸光度值，在葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的葡萄糖濃度，結(jié)合反應(yīng)時(shí)間計(jì)算其反應(yīng)速率，并將對(duì)應(yīng)的底物（蔗糖）濃度，一并用表格形式列出，將對(duì)作圖，