木聚糖酶活力特性研究-惠泉啤酒

1、木聚糖酶活力特性研究鄭翔鵬福建省燕京惠泉啤酒股份概況木聚糖酶分子只含一個亞基，分子量在830kD間的為堿性蛋白，分子量在 30145kD間的為酸性蛋白。PI值為310.5,穩(wěn)定pH值為310，反響最適pH值在47之間，最適溫 度為4060C。離子通過改變酶的構象影響木聚糖酶的穩(wěn)定性，一般情況下，Ag+ 離子濃度1 mmol - L - 1 ,抑制酶活達100%、Hg2 + 離子濃度1 mmol L - 1 ,抑制酶活達7013%、 Cu2 + 離子濃度2. 00 mg - ml- 1 ,抑制酶活達25. 42% 等離子抑制木聚糖酶的活性 ,Mg2 + 離子濃度2. 00 mg - ml- 1

2、,提高酶活達6% 、Mn2+ 離子濃度1 mmol - L - 1 ,提高酶活 達24% 等離子那么能提高木聚糖酶的活性。Ag+ 、 Hg2 + 、 Cu2 +等離子主要通過改變酶分子中2SH基團的復原態(tài)或直接攻擊酶分子中的某些氨基酸殘基，改變酶的構象來抑制木聚糖酶的活性， Mg2 + 、 Zn2 +等那么通過影響酶與底物的結合及解離狀態(tài), 提高酶的活性 , 其具體機制還有待進一步研究。木聚糖酶的分子結構由功能結構域和連接區(qū)構成。 其中， 功能結構域由催化結構域和纖 維素結合結構域構成， 纖維素結合結構域可改變酶對可溶或不溶底物的活力。 根據結構域的 相似性， 木聚糖酶可通過結構域的改組和隨后

3、結構域的修飾而進， 許多木聚糖酶具有纖維素 酶的活性。木聚糖酶與木聚糖的結合利用離子間的靜電作用。木聚糖含有的4-0-甲基葡糖醛酸帶負電，木聚糖酶在 pH低于PI時帶正電荷，易于結合，而在 pH值高于PI時，那么不易 結合。其反響為典型的酸堿親核水解反響。木聚糖酶特性分析在對木聚糖酶的特性分析中， 著重分析酶活力與溫度、 PH 值、 鈣離子對酶活力的影響。1.1 木聚糖酶活力分析對于木聚糖酶活力的分析， 國標中沒有相應的推薦方法。 目前， 主要采用分光比色測定反響 液顏色的強度來定量分析酶的活力。木聚糖酶活力單位是指在 50C、pH值為5.3的條件下，每分鐘從濃度為10mg/ml的木聚糖溶液中

4、降解釋放 1卩mol復原糖所需要的酶量為一個酶活 力單位 U。1.1.1 分析原理木聚糖酶能將木聚糖降解成寡糖和單糖。 具有復原性末端的寡糖和有復原基團的單糖在沸水 浴條件下可以與DNS式劑發(fā)生顯色反響。反響液顏色的強度與酶解產生的復原糖量成正比， 而復原糖的生成量又與反響液中木聚糖酶的活力成正比。1.1.2 主要試劑略1.1.3 標準曲線的繪制吸取水1.0ml，參加DNS式劑3.0ml，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，制成標準空 白樣。分別吸取木糖溶液 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，分別用水定容至 100ml，配制 成濃度為 0.100.50mg/ml 木糖標

5、準溶液。 分別吸取上述濃度系列的木糖標準溶液各 1.00ml 做二個平行，分別參加到刻度試管中，再分別參加3mlDNS試劑。電磁振蕩 3s，沸水浴加熱5min。然后用自來水冷卻到室溫，以標準空白樣為對照調零，在540nm處測定吸光度OD值。以木糖濃度為 Y軸、吸光度OD值為X軸，繪制標準曲線。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標準曲線。1.1.4 樣品制備固體試樣應粉碎或充分碾碎，然后過60目篩孔徑為0.25mm。液體試樣可直接稱取。稱取試樣，精確至 0.001g。參加250ml乙酸-乙酸鈉緩沖溶液。磁力攪拌30min，再用緩沖溶液定容至500ml，在4C條件下避光保存12h，過濾。再用緩沖溶

6、液做二次稀釋稀釋后的待測酶液中木聚糖酶的活力最好能控制在0.040.08U/ml之間。測定吸取10.0ml木聚糖溶液，50C平衡10min。吸取10.0ml經過適當稀釋的酶液，50C平衡10min。吸取1.00ml經過適當稀釋的酶液已經過50 C平衡，參加到刻度試管中，再參加1.0ml木聚糖溶液，50C保溫30min，立即參加3.0ml的DNS溶液混勻，沸水浴加熱5min 從 試管放入重新沸騰時算起。用自來水冷卻至室溫，在540nm處測定吸光度 A。吸取1.00ml木聚糖溶液已經過 50C平衡，參加到刻度試管中，50C精確保溫30min。參加3.0mlDNS 試劑和1.00ml經過適當稀釋的酶

7、液，混勻，以終止酶解反響。沸水浴加熱5min 從試管放入重新沸騰時算起，用自來水冷卻至室溫，在540nm處測定吸光度Aq。計算rx Df木聚糖酶活力U/g = x 1000150.14x t式中：r :通過OD值從標準曲線上查得與標準木糖溶液相對應的濃度ug/ml ;150.14 :木糖的相對分子質量；t :酶解反響時間，min;Df :稀釋倍數酶活力的計算值保存三位有效數字。結果分析本研究分析了 8種各酶制劑廠家提供的復合木聚糖酶的活力，具體見表1。木聚糖酶的活力含量在125982402 ug/ml之間，差異相當大。其中，在菌落總數總數方面，只有37.5%小于 50000cfu/ml 。表1

8、各酶制劑廠家提供的復合木聚糖酶的活力廠家樣品木聚糖酶活力ug/ml 或ug/g 備注菌落總數cfu/ml或cfu/g A12598V 50000B8540不計其數C9329V 50000D11246不計其數E4216不計其數F5488V 50000G4309不計其數H2402不計其數總平均68912.2溫度、PH值對木聚糖酶活力影響選擇表1中A、B、C三種酶進行相關分析。其中，對溫度影響參數選擇為：底物濃度0.5%sigma 木聚糖，PH6.5，反響時間30min，溫度范圍為3575C,具體見圖1。從圖1中分析可見， 三種酶根本在5060 C之間有酶活相對較高值，具體溫度點差異較大，分別為60

9、 C、50C、55C，在60C至75C，酶活力呈直線下降，約降為到2030%之間?？梢?，溫度對酶活力影響，特別是高溫對其有著較大迫害作用。354045505560657075圖1不同溫度對木聚糖酶的相對酶活在不同PH條件下影響參數選擇為：底物濃度0.5%sigma木聚糖，反響時間30min，溫度50C, PH值范圍為3.57.5,具體見圖2。從圖2中分析可見，三種酶 PH值得在4.55.5之間酶活 相對較高值，但個體差異較大，約為10%左右，PH值從5.5到7.0之間，酶活下降趨勢較大，約為5060%之間，后趨為平穩(wěn)。可見，PH值對酶活力影響，特別是高PH值對其有著較大迫害作用。綜合上溫度和P

10、H值兩因素對木聚糖酶活力的影響分析，判斷為敏感因素，在實施應用過程 中因為主要控制點。OOOOOOOOOOO%活酶對相*ABL：- CPH4.55.56.57.5圖2不同PH對木聚糖酶的相對酶活2.3鈣離子濃度對對木聚糖酶活力影響鈣離子在啤酒糖化過程中有著重要的作用，也是啤酒中主要的金屬離子之一。 其中鈣離子對a淀粉酶活力的影響我們以前進行了詳細的研究。在研究中選擇表1中A、B、G三種酶進行相關分析。其中，參數選擇為：底物濃度0.5%sigma木聚糖，PH6.5，反響時間30min，溫度為50C,鈣離子添加濃度依次為0、20、40、60、80、100ppm,具體見圖3。在圖中分析中，A酶相對活

11、力高點為鈣離子濃度20ppm和60ppm B酶相對活力高點為鈣離子濃度40ppm和80ppm,C酶相對活力高點為鈣離子濃度40ppm和60ppm,而相對酶活力低點都為鈣離子濃度0ppm和100ppm,可見在高濃鈣離子與無鈣溶液對酶活力都有抑制作用，而在各產品酶活對鈣離子濃度的差異化上，本研究認為是各產品在制備過程中某些參數與工藝的差異引起的，鈣離子濃度控制20-80ppm可使各木聚糖酶活力發(fā)揮到最正確點。綜合上分析，在實驗的過程中， 需對鈣離子濃度對對木聚糖酶活力影響進行試驗，尋找鈣離子最正確添加量。o o O10 91 1%活酶對相ABC三80706050鈣離子ppm204060 80 100圖3鈣離子對木聚糖酶的相對酶活總結在對木聚糖酶活力以及