核盤菌病毒dsRNA提取方法分析解析

1、湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課程實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)書實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目名稱：核盤菌病毒dsRNA提取方法學(xué)生信息：姓名班級生安一班學(xué)號指導(dǎo)老師姓名：。學(xué)生所在學(xué)院：植物保護(hù)學(xué)院聯(lián)系電話：生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)課程組二0一三年五月制核盤菌病毒dsRNAil取方法前言1-5主要包括：（1）為什么要寫這篇實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，要解決什么問題；（2）本設(shè)計(jì)在學(xué)科領(lǐng)域中所占的地位，有什么意義和價(jià)值；（3）本設(shè)計(jì)所涉及的界限、規(guī)模和范圍；理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)設(shè)備基礎(chǔ)；（5）預(yù)期目標(biāo)；（6）概念和術(shù)語的定義。核盤菌（Sclerotiniasclerotiorum（Lib.）deBary）是一種重要的植物病原真菌，在我國常年嚴(yán)重

2、為害油菜、向日葵和大豆等油料作物及多種蔬菜作物。由于該菌在病殘?bào)w上形成的菌核可以在土壤中頑固存活，給防治帶來了極大的困難。目前核盤菌引致的作物（包括蔬菜）菌核病仍然依賴于化學(xué)農(nóng)藥防治，化學(xué)農(nóng)藥防治在一定程度上可確保作物的產(chǎn)量，但也造成了嚴(yán)重的后果，其主要有兩個(gè)方面：（1）由于長期大量使用農(nóng)藥，核盤菌群體中已出現(xiàn)了抗藥性菌株；（2）農(nóng)藥給環(huán)境（空氣、水和土壤）造成了嚴(yán)重的污染，特別是直接污染了食品（食用油和蔬菜等）?？紤]到'農(nóng)業(yè)持續(xù)性發(fā)展的要求，環(huán)境問題的緊迫性及食品衛(wèi)生等諸多因素，降低化學(xué)農(nóng)藥使用劑量和頻次勢在必行。利用抗病品種和生物防治是替代化學(xué)農(nóng)藥防治菌核病的最佳途徑。但目前這兩種

3、措施均沒有取得突破性進(jìn)展，其主要原因是對核盤菌的認(rèn)識不夠。深入了解核盤菌的致病機(jī)理及病菌致病力（毒力）衰退的機(jī)理將為菌核病的防治研究提供新的思路和線索。真菌在生命之樹上占據(jù)了極其重要的地位，具多樣性及進(jìn)化地位已獲得充分認(rèn)識肯定（劉慧泉，2011）。真菌病毒是一類能感染真菌并且能在真菌中有效復(fù)制的病毒，雖被證實(shí)廣泛存在于各類真菌中，與動物病毒和植物病毒相比而言，研究卻相當(dāng)滯后，與分布廣泛的真菌類群形成鮮明對比。目前關(guān)于真菌病毒分布及寄主范圍的研究報(bào)道很少，基因組已被測序和報(bào)道的真菌病毒就更加少之又少，究其原因，主要是由于大部分已知的真菌病毒對寄主真菌造成的表型影響非常微小，難以被發(fā)現(xiàn)，不容易引起

4、研究者的注意；另一方面，伴隨著弱毒菌株現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)，真菌病毒學(xué)者開始對能夠?qū)е轮参锊≡婢虏×档偷恼婢《井a(chǎn)生興趣，對此類病毒的研究投入了極大的精力，以期將其開發(fā)成能對抗真菌病害的生防制劑，或作為研究工具來探究真菌宿主的生理機(jī)制（Ghabrialetal,2009b;Pearsonetal,2009）有關(guān)真菌病毒的首次報(bào)道是在1962年，英國科學(xué)家Hollings等在雙抱蘑燕里發(fā)現(xiàn)了三種真菌病毒粒體。此后從許多真菌中先后發(fā)現(xiàn)了多種病毒存在，據(jù)估計(jì)至少有30%的真菌中攜帶有病毒，說明真菌病毒的分布較廣泛（Lemke,1979;Buck,1986到目前為止，所發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)真菌病毒粒子是球形的，

5、除此之外還有線狀、棒狀、桿狀、有囊膜的桿狀以及皰疫病毒等形狀存在（Pearsone/a/.,2009）。真菌病毒基因組核酸大多是dsRNAliE（+）ssRNA其巾以dsRNA為主（Buck,1986）,于曉等在2010年首次報(bào)道了真菌巾存在ssDNA真菌病毒。真菌病毒分布廣泛，幾乎存在于所有的真菌中，但關(guān)于病毒分類的研究卻還處于起步階段，根據(jù)基因組片段數(shù)目，目前所發(fā)現(xiàn)的dsRNA真菌病毒可分為以下四大類：Reoviridae（呼腸孤病毒科卜Totiviridae（單分病毒科卜Chyroviridae（產(chǎn)黃青霉病毒科）和Parirsviridae砥分病毒科），而ssRNA病毒可分為Hypovi

6、ridae（弱毒病毒科）、Namavirida（裸露病毒科）和桿菌狀核糖核酸病毒科（Bamaviridae）。近期在植物上發(fā)現(xiàn)了單分體dsRNA病毒，進(jìn)化上介于單分病毒科病毒和雙分病毒科病毒之間（Martinetal.,2011;Sabanadzovicetal,2009）在白紋羽病菌巾發(fā)現(xiàn)了一種大型的雙分體dsRNA病毒，與單分病毒科和產(chǎn)黃青霉科成員的親緣關(guān)系較近，這都證明了部分真菌病毒與植物病毒具有一定的同源性。真菌病毒核酸序列已測定的還很少而針對真菌病毒基因組相關(guān)分子生物學(xué)特性的廣泛研究，病毒的核酸序列也成了真菌病毒分類的重要依據(jù)之一（Honge?a/.,1999）。目前還有部分真菌病毒

7、的分類地位未確定，因此，發(fā)現(xiàn)新的真菌病毒并測定其核酸序列，對真菌病毒的研究非常重要大多數(shù)的真菌均被證實(shí)里面含有病毒，而對真菌病毒傳染性檢測的缺乏，使得由病毒引起的表型變化難以確定，目前，僅有部分病毒已被證明確鑿導(dǎo)致一個(gè)特定的表型。真菌病毒無處不在，但缺乏使寄主表型明顯變化的效果，導(dǎo)致數(shù)研究者認(rèn)為真菌病毒，真菌生物學(xué)沒有發(fā)揮作用。但我們目前研究的真菌病毒數(shù)量有限，因此，如果僅憑所得到的一些數(shù)據(jù)而做出對所有病毒的假設(shè)是很容易出現(xiàn)錯(cuò)誤的，只有盡量多的研究不同的真菌病毒，才能得到更詳盡更準(zhǔn)確的結(jié)論。隨著分子生物學(xué)的迅速發(fā)展，許多生物化學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)被應(yīng)用于植物病毒的診斷鑒定，給病毒分類鑒定提供了豐

8、富可靠的依據(jù)。1979年Motris和Dodds從感染RNA病毒的植物和真菌組織內(nèi)提取了病毒dsRNA這些dsRNA完全對應(yīng)于RNA病毒基因組信息，并且理化性質(zhì)穩(wěn)定，對酶具有一定的抗性，而正常植物中一般不存在大分子dsRNA該方法可以用來檢測植物RNA病毒。在病毒研究的過程中，病毒的提取質(zhì)量是病毒檢測和基因組克隆的關(guān)鍵。因?yàn)閐sRNA的特殊性。目前尚未像總DNA和總RNA提取有現(xiàn)成的試劑盒或快速簡便的提取方法。提取技術(shù)是利用纖維素能在一定的酒精濃度下特異吸附的原理而發(fā)展起來的。目前的dsRNA分析法還不完善，沒有一套公認(rèn)的特別有效的抽提方法，有待于研究與實(shí)踐。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆仗崛sRNA實(shí)驗(yàn)

9、技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對RNA病毒的檢測、鑒定等實(shí)驗(yàn)?zāi)繕?biāo)或應(yīng)用。二、實(shí)驗(yàn)原理DoublestrandedRNA（dsRNA#RNA病毒復(fù)制過程的中間產(chǎn)物，這些dsRNA的大小對應(yīng)于RNA病毒的基因組，而正常的植物或真菌組織不含有或僅產(chǎn)生小分子量的dsRNA,RNA病毒復(fù)制過程會產(chǎn)生長度與基因組RNA相似的dsRNA,某些dsRNA病毒的子代基因組也是dsRNA并且這些dsRNA相對于ssRNA穩(wěn)定得多。dsRNA分析方法是利用CF11纖維素能在一定的酒精濃度下特異吸附dsRNA的原理而發(fā)展起來的。因此可通過提取dsRNA對該類病毒進(jìn)行檢測、鑒定等方面的研究。三、實(shí)驗(yàn)流程圖6PlaiL infected w

10、ith and SDSa RNA virusAddEtOHSTESTEto 1?%+CaitnfljgaiionNAssRNA式arw四、主要實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備（設(shè)備注明廠家型號，器皿耗材標(biāo)明規(guī)格）低溫高速離心機(jī)皚心機(jī)型號：TG18G凱達(dá)集團(tuán)），電泳儀（JY600D1用型電泳儀），渦震儀（型號VM-10）.五、實(shí)驗(yàn)材料及試劑6(含材料的預(yù)處理和試劑的配制方法等)化學(xué)試劑CF-11(Sigma)SDS(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)，酚-氯仿-異戊醇混合液(酚：氯仿：異戊酉!的體積比為25:24:1，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司).其他試劑均購自北京天根生物有限公司10XSTENaCl58.5

11、0gTris-Cl(1mol/L,pH8.0)100.0mlEDTA(0.5mol/L,pH8.0)20.00ml定容至1000ml,高壓滅菌。10%SDSSDS10.00g加熱至68c溶解，定容至100ml,pH7.20TE緩沖液Tris-Cl(1mol/L,pH8.0)5.0mlEDTA(0.5mol/L,pH8.0)1.00ml定容至500ml,高壓滅菌。樣品：經(jīng)過搖瓶培養(yǎng)后的核盤菌，用滅菌的紗布過濾并用濾紙吸干水分備用六、實(shí)驗(yàn)操作步驟6-101 .稱取0.5克菌核組織，在液氮中充分研磨至粉末狀；2 .加入500仙L,2倍體積的STE(PH為8.0)、500仙L酚-氯仿-異戊醇混合液、5

12、0nL體積分?jǐn)?shù)為10%SDSffi15nLB-琉基乙醇，渦旋3min,加入試劑量隨生物組織量而定。3 .在4c下12000r/min離心3min,收集上清液，用無水乙醇將其濃度調(diào)至17%,并加入6080彈纖維素，渦旋混勻；4 .在4c下10000r/min離心3min。5 .棄上清，力口1ml含17%乙醇的IxSTE渦旋混勻；6.10000g,離心5min,棄上清；7 .重復(fù)5、6步驟2次；8 .加0.3mlIxSTE渦旋?M勻，10000g,離心5min,取上清；9 .加0.4ml1xSTE渦旋?M勻，10000g,離心5min,取上清；10 .合并兩次上清，加等體積預(yù)冷的異丙醇，-20C下

13、靜置1h。11 .在4c下15000g,離心15min,棄上清；12 .用150仙L70%勺乙醇洗沉淀，15000g,離心3min;13 .用200仙L70%醇洗沉淀，真空干燥3min:14沉淀及時(shí)溶解于30叱LTE中，一20c保存；15.取5仙L在瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分析。根據(jù)凝膠電泳所顯示的dsRNA條帶的大小，與己知RNA病毒dsRNA或相應(yīng)DNA分子量Marker進(jìn)行比較，確定待檢測病毒基因組RNA種類和大小。七、實(shí)驗(yàn)方法討論11-13（本設(shè)計(jì)采用的實(shí)驗(yàn)方法與其他同類方法的比較分析）此項(xiàng)技術(shù)有幾點(diǎn)優(yōu)于其它病毒診斷方法之處。在傳統(tǒng)的植物病毒診斷中，通常面臨寄主成份復(fù)雜、病毒或病毒RNA不

14、穩(wěn)定的難題，dsRNA分析方法克服了這些問題。此項(xiàng)技術(shù)簡單、相對經(jīng)濟(jì)，且獲得的dsRNA排除了寄主的干擾，可在相對較短的時(shí)間內(nèi)得到結(jié)果。這項(xiàng)技術(shù)可以檢測其它診斷方法未必檢出的復(fù)合侵染，而且dsRNA技術(shù)主要根據(jù)病毒基因組的大小來分辨不同病毒，因此可區(qū)分病毒的不同株系，如攜帶衛(wèi)星RNA的CMV株系與不攜帶衛(wèi)星RNA的CMV株系，也可純化不穩(wěn)定病毒的dsRNA還可根據(jù)病毒產(chǎn)生的dsRNA檢測新的病毒，純化的dsRNA可用于分子克隆或制備探針以及抗體。dsRNA技術(shù)也存在缺陷，只有RNA病毒可以被檢出，并且要求實(shí)驗(yàn)者具備不同種屬RNA病毒基因組的大小和數(shù)量的知識。某些植物含有潛隱病毒或細(xì)胞自身產(chǎn)生的

15、大小類似于ssRNA病毒產(chǎn)生的dsRNA某些病毒如Luteovirus和potyvirus,只產(chǎn)生少量的dsRNA也給診斷工作帶來困難。而且有時(shí)田間樣品和溫室接種的植物中dsRNA的含量相對較低。為了快速可靠地診斷病情，RNA病毒的其它檢測技術(shù)不斷得到改進(jìn)，但dsRNA分析方法還是適用于大多數(shù)植物病毒初步篩檢，可作為其它技術(shù)的補(bǔ)充。八、注意事項(xiàng)（安全風(fēng)險(xiǎn)，易導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出問題的因素，提高成功率的技巧）RNA提取過程中最重要的注意事項(xiàng)是防止RNA酶的污染導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。筆者總結(jié)一下技巧，幫助大家提取更高質(zhì)量的RNA。一，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程都要佩戴一次性手套。因?yàn)槠つw經(jīng)常帶有的細(xì)菌霉菌等微生物及人體自然脫落下

16、來的皮屑，都可能成為RNA酶的來源。使用滅菌的一次性的塑料器皿抽取RNA,避免使用公共儀器，公共儀器或多或少都會含有RNA酶，特別是DNA操作時(shí)有時(shí)要加入RNA酶，消化DNA樣品中所含的RNAo二，操作時(shí)勤換手套，冰上操作，戴手套口罩，動作要迅速。最關(guān)鍵的一步也是決定RNA質(zhì)量的一步是：加氯仿里1型年后，出現(xiàn)分層，RNA在上清中，中間的是DNA,下面是蛋白。吸取上清時(shí)一定要小心，防止將中間的DNA混入，以免影響RNA的質(zhì)量。乙醇清洗后，一定要完全除去乙醇（至無乙醇味）,否則會影響電泳上樣。異丙醇一20C沉淀RNA30m1n以上。在這過程中有一個(gè)小技巧，就是再加入氯仿離心后，一般上清液的量約占總

17、體積的50%。為了提高RNA的質(zhì)量和產(chǎn)率，離心后并不馬上吸取含有RNA的上清液，而是移取中層的DNA和下層的蛋白。余下1015%的下層油相，經(jīng)短暫高速離心后在吸取上清中含有RNA的水相。因?yàn)楫?dāng)下層油相占很少體積時(shí)，上下層的界面所占的體積少，不會浪費(fèi)太多的水相，吸取中間蛋白相和下層油相的可能性也小。其實(shí)這技巧可用于所用的分層液相的實(shí)驗(yàn)，如酚抽提DNA的實(shí)驗(yàn)，回收膠中DNA的實(shí)驗(yàn)。參考文獻(xiàn):1 馮探，何建，聶振朋，等.RT-PC或術(shù)及其在馬鈴薯病毒檢測中的應(yīng)用J.南方農(nóng)業(yè)，2007,1(6):62-642 李賀，代紅艷，張志宏，等.草莓植株中病毒dsRNA的分離和鑒定J.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006,3

18、9(1):145-152.3 姜道宏核盤菌EpIPN菌株毒力衰退及生防潛能的研究D.華中農(nóng)業(yè)大教10504)博士學(xué)位論文4 張姝聰，核盤菌菌株JX-A4生物學(xué)特性及其真菌病毒研究D.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文5 杜磊,核盤菌致病力衰退相關(guān)病毒SsDRWJ治油菜菌核病的研究D.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文6 陳紅,黃瓜花葉病毒dsRNA的研究D.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院碩士學(xué)位論文.7 牛建新，陳萍,李西平，等.葡萄卷葉病毒mRTPCR檢測技術(shù)研究J.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2004,13(1):28-32.8 陳開英，梁平彥.我國栗疫病菌體中dsRNA的初步研究J.森林病蟲通訊,1990,(1):23259 淳俊,鄭彥峰，王勝華