粗多糖含量測定方法學(xué)驗(yàn)證(范本)

1、粗多糖含量測定方法學(xué)研究資料一、儀器與試藥1二、方法的研究11.檢測波長的測定22.樣品及對(duì)照制備方法2三、方法學(xué)驗(yàn)證31.線性32.精密度實(shí)驗(yàn)43.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)44.重復(fù)性試驗(yàn)45.重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)56.準(zhǔn)確度試驗(yàn)5芪參顆粒粗多糖含量測定方法起草說明標(biāo)志性成分粗多糖含量測定的方法來源于保健食品功效成分檢測方法白鴻主編（中國中醫(yī)藥出版社)的第二法，該方法的原理是：多糖經(jīng)乙醇沉淀分離后，去除其他可溶性糖及雜質(zhì)的干擾，糖與硫酸在沸水浴中加熱脫水生成羥甲基呋喃甲醛（羥甲基呋喃糠醛），再與蒽酮縮合成藍(lán)綠色化合物，其顯色強(qiáng)度與溶液中糖的濃度成正比，在625nm波長下比色測定。主要研究資料如下：一、儀器與試藥1、

2、儀器(1) 離心機(jī)（湘南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號(hào)TD25-WS）；(2) 離心管：50ml；(3) 水浴鍋（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，型號(hào) DK-S26）；(4) 旋渦混合器（DioCote，SA8）；(5) SHIMADZU UV-1800 紫外可見光分光光度計(jì)；(6) JB760-68 石英比色皿 （宜興市偉鑫儀器有限公司）；(7) TU-1901 雙光束紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；2、試藥(1) 葡萄糖：廣州化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)為20110602-1；(2) 無水乙醇：西隴化學(xué)股份有限公司，分析純，批號(hào)為160802 1；(3) 蒽酮：國藥集團(tuán)化學(xué)試

3、劑有限公司，分析純，批號(hào)為20131127；(4) 硫酸：廣州化學(xué)試劑廠，分析純，批號(hào)為20150404-1；(5) 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：標(biāo)準(zhǔn)稱取干燥恒重的分析純級(jí)葡萄糖0.5000g，加水溶解，并定容至50ml，此溶液1ml含10mg葡萄糖，用前稀釋100倍為使用液（0.1mg/ml）。(6) 0.1%蒽酮硫酸溶液（W/V）：準(zhǔn)確稱取0.1g蒽酮置于燒杯中，緩緩加入100ml 80%硫酸溶解，溶解后呈黃色透明溶液。現(xiàn)用現(xiàn)配。3、試樣(1) 樣品顆粒：XXXXX有限公司提供。二、方法的研究粗多糖含量測定的方法來源于保健食品功效成分檢測方法白鴻主編（中國中醫(yī)藥出版社)的第二法，本研究針對(duì)葡萄糖對(duì)照以及

4、樣品的的吸光度進(jìn)行檢測波長測定，如下所示：1.檢測波長的測定取葡萄糖對(duì)照品溶液、樣品溶液進(jìn)行紫外光譜掃描，結(jié)果顯示對(duì)照品和樣品均在625nm波長附近有最大吸收。序號(hào)波長吸光度1625.000.3602509.500.2713422.500.262序號(hào)波長吸光度1760.000.0552624.500.154芪參顆粒樣品溶液紫外波長吸收圖葡萄糖對(duì)照品紫外波長吸收圖2.樣品及對(duì)照制備方法（1）樣品提?。悍Q取混合均勻的固體樣品2.0g，置于100ml容量瓶中，加水80ml左右，于沸水浴中加熱1小時(shí)，冷卻至室溫后補(bǔ)加水至刻度（V1），混勻后過濾，棄去初濾液，收集余下濾液供沉淀粗多糖。（2）沉淀粗多糖：

5、準(zhǔn)確吸取上濾液（或液體樣品）5.0ml（V2），置于50ml離心管中（或2.0ml于15ml具塞離心管中），加入無水乙醇20ml（或8ml），混勻，于4冰箱靜置4小時(shí)以上，以4000r/min離心5min，棄去上清液，殘?jiān)?0%（V/V）乙醇溶液數(shù)毫升洗滌，離心后棄去上清液，反復(fù)操作3次。殘?jiān)盟芙獠⒍ㄈ葜?0ml（V3）。（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：準(zhǔn)確吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2ml（相當(dāng)于葡萄糖0mg、0.02mg、0.04mg、0.06mg、0.08mg、0.10mg、0.12mg）置于10ml比色管中，補(bǔ)加水2.

6、0ml，加入0.1%蒽酮硫酸溶液6ml，在旋渦混合器上混勻，置沸水浴中加熱10min，取出，在流水中冷卻20min后，用分光光度計(jì)在625nm波長處以試劑空白為參比，1cm比色皿測定吸光度值。以葡萄糖質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（4）樣品測定：準(zhǔn)確吸取樣品待測液2.0ml（含糖量20100g），按標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制步驟于625nm波長下測定吸光度值并求出樣品含量。三、方法學(xué)驗(yàn)證1.線性取適量葡萄糖對(duì)照品，精密稱定，加水制成0.1094mg/ml的葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液，分別精密吸取葡萄糖對(duì)照品儲(chǔ)備溶液0ml、0.20ml、0.40ml、0.60ml、0.80ml、1.0ml、1.2m

7、l，置于10ml比色管中，補(bǔ)加水2.0ml，依法測定。得標(biāo)準(zhǔn)曲線儲(chǔ)備液。依法測定，分別制成含葡萄糖為0、21.88g、43.76g、65.44g、87.52g、109.40g、131.28g的溶液，以吸光度（Y）為縱坐標(biāo)，葡糖糖對(duì)照品的含量（X）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見下圖，其回歸方程為： y=0.00507x+0.0048（r=0.99989），試驗(yàn)表明葡萄糖對(duì)照品在0131.28g范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系。見表1。表1 線性考察結(jié)果含量（g）021.8843.7665.4487.52109.40131.28吸光度（Y） -0.0007 0.1111 0.2209 0.3372 0.4431

8、0.55610.6635回歸方程 y=0.00507x+0.0048 r=0.9999粗多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如下：粗多糖對(duì)照在0131.28g內(nèi)成良好的線性關(guān)系。2.精密度實(shí)驗(yàn)取一供試品溶液，連續(xù)測定6次，記錄吸光度，結(jié)果見表2。試驗(yàn)結(jié)果RSD2.0（RSD0.44，n6），說明儀器精密度良好。表2 儀器精密度試驗(yàn)測定結(jié)果序號(hào)吸光度平均吸光度RSD10.33980.34180.4420.341430.340740.343550.343660.34193.穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取同一樣品，按以下時(shí)間測定，記錄吸光度，結(jié)果見表3。表3 粗多糖穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果時(shí)間0min30min1h2h3h4h吸光度0.3437 0.

9、3409 0.3397 0.3370 0.3342 03313 1hRSD(%)0.602hRSD(%)0.82 4hRSD(%)1.35 結(jié)果表明供試品溶液在顯色反應(yīng)完成后4小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。4.重復(fù)性試驗(yàn)取同一供試品，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，并按樣品及對(duì)照制備方法測定粗多糖含量，結(jié)果見表4。表4 粗多糖重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果（單位：mg/100g）樣品編號(hào)123456含量(mg/100ml)348343335330335338平均含量338RSD（%）1.91結(jié)果表明6份供試品溶液按照粗多糖的檢測方法測定重復(fù)性好。5.中間精密度實(shí)驗(yàn)取同一供試品(批號(hào)：150401)，由另一操作者于不同時(shí)

10、間、不同儀器操作，按供試品制備方法制備6份供試品溶液，并按樣品及對(duì)照制備方法測定粗多糖含量，結(jié)果見表5。表5 粗多糖中間精密度試驗(yàn)測定結(jié)果（單位：mg/100g）標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果：含量（g）020.3240.6460.9681.28101.6121.92吸光度（Y） 0 0.098 0.196 0.296 0.394 0.506 0.575回歸方程 y=0.0048x+0.0015 r=0.9992樣品測定結(jié)果：樣品編號(hào)123456含量(mg/100ml)294285297273297287平均含量289RSD（%）3.20結(jié)果表明6份供試品溶液按照粗多糖的檢測方法測定進(jìn)行的中間精密度實(shí)驗(yàn)精密度良

11、好。6.準(zhǔn)確度試驗(yàn)采用加樣回收法，精密稱取本品（批號(hào)：150401，平均含量：338mg/100g，平均吸光度：0.3449）2.0g各6份，按照樣品及對(duì)照制備方法中制備得樣品待測液6份，分別從6份待測液中吸取1ml置于10ml比色皿中，再分別精密加入1ml 100%濃度的對(duì)照品溶液（濃度：0.03402mg/ml），依法進(jìn)行測定，記錄吸光度，以吸光度計(jì)算回收率，結(jié)果見表6。6份樣品回收率均在95%105%之間，平均回收率為103%，RSD=0.78%，該方法準(zhǔn)確度符合要求。表6 粗多糖回收率試驗(yàn)結(jié)果編號(hào)取樣量 (g)樣品吸光度 對(duì)照品加入量對(duì)照加入對(duì)照后回收率平均值（%）RSD（mg）測得吸光度總吸光度（%）（%）12.0027 0.1724 0.03402 0.1688 0.3441102 103 0.78 22.0030 0.17