生物檢驗(yàn)技術(shù)論文

1、酶分析法摘要：蛋白質(zhì)屬性的酶是高效、高度專一的生物催化劑，它和生命活動(dòng)密切相關(guān)。因?yàn)槊笇W(xué)在生產(chǎn)實(shí)踐基礎(chǔ)理論研究方面，都起著非常重要的作用。酶分析法則是其中的重要內(nèi)容，也是目前發(fā)展較為迅速的一個(gè)領(lǐng)域。酶的選擇性及其在低濃度下能催化底物反應(yīng)的能力，對(duì)化學(xué)分析有很大的用處。關(guān)鍵詞：特征 意義 方法 應(yīng)用引言：酶的催化反應(yīng)早已用于底物、激活劑、抑制劑以及酶本身的測(cè)定。在19世紀(jì)中葉已采用酶法來(lái)測(cè)定糖類。20世紀(jì)40年代初，Warburg曾介紹了一項(xiàng)基于使輔酶還原而用光度法來(lái)測(cè)量NAD和NADP的方法。最新的發(fā)展是電化學(xué)法與熒光法的應(yīng)用。所以，酶分析法已成為一項(xiàng)公認(rèn)的分析技術(shù)。酶分析法包括兩種類型：一種

2、是以酶作為分析對(duì)象，根據(jù)需要對(duì)樣品進(jìn)行酶含量或活力的測(cè)定，通常稱為“酶活力測(cè)定”。另一種是以酶作為分析試劑，用以測(cè)定樣品中用一般化學(xué)方法難于檢測(cè)的物質(zhì)，如酶的底物、抑制劑、活化劑和輔因子等，一般稱為“酶法分析”。兩者檢測(cè)的對(duì)象雖有所不同，但原理和方法都是以酶能專一而高效地催化化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)，通過(guò)酶反應(yīng)速度的測(cè)定來(lái)檢測(cè)相應(yīng)物質(zhì)的含量。此外，為了獲得準(zhǔn)確可靠的結(jié)果，它們都需要選擇適宜的反應(yīng)條件和測(cè)定方法。 酶的特征1酶分析法具有高度的選擇性。原則上講，一種酶只催化一種反應(yīng)，或者說(shuō)只能催化某種特定的化合物或?qū)μ囟ǖ幕瘜W(xué)鍵起作用。這是由酶本身的高度專一性作用的特點(diǎn)所決定的。2靈敏度很高。一般可測(cè)到01

3、umol·L-1(10-7mol·L-1)。如果與熒光法聯(lián)用，可高達(dá)1nmol·L-1(10-9mol·L-1)左右。 3作用一般比較迅速。大多數(shù)酶促反應(yīng)在30分鐘以內(nèi)可以完成。反應(yīng)條件很溫和，如在常溫、常壓和pH近中性的條件下，反應(yīng)速度很快。4酶用量甚微，所以比較經(jīng)濟(jì)。 5精確度一般。這主要取決于微量吸管誤差，如1ul以下的量，取樣誤差較大。 同時(shí)也與組合方式有關(guān)。 6適用范圍有一定局限性。 只限于酶、底物、輔酶、活化劑或抑制劑的測(cè)定。 7簡(jiǎn)便程度較差。必須具有酶學(xué)知識(shí)的操作訓(xùn)練，通常要求盡量減少人為誤差，盡可能使所有反應(yīng)體系條件一致。如加樣量、溫度、

4、反應(yīng)時(shí)間等都要求比較準(zhǔn)確。最適反應(yīng)條件(如溫度、pH等)的確定很重要，一個(gè)熟練的酶學(xué)工作者，會(huì)考慮各種因素，設(shè)計(jì)的實(shí)驗(yàn)比較合理，而且重現(xiàn)性好；未經(jīng)過(guò)專門訓(xùn)練的人，往往容易出錯(cuò)。 酶分析法的意義 酶的應(yīng)用大致可分為四個(gè)方面：(1)用以制造某些產(chǎn)品；(2)用以去除某些物質(zhì)；(3)用以識(shí)別某種化合物；(4)用以測(cè)定某種物質(zhì)。其中(3)和(4)屬于酶分析法的范疇。從應(yīng)用面來(lái)看，(1)和(2)最為廣泛。例如用酶法生產(chǎn)可的松，用凝乳酶制造乳酪，用果膠酶澄清果汁等。這類事例很多，今后還會(huì)日益增加。但另一方面，(3)和(4)的應(yīng)用也正在迅速擴(kuò)大.其原因之一是由于酶工業(yè)的發(fā)展，許多酶能夠充分供用。以前酶主要是從

5、動(dòng)物臟器(如胰臟、心臟、肝臟等)和植物種子中得到。這樣，除了原料困難外，同時(shí)需要花費(fèi)大量的勞動(dòng)力和較長(zhǎng)的時(shí)間進(jìn)行分離精制。因而酶的價(jià)格十分昂貴，不可能用酶作為分析試劑去測(cè)定其它物質(zhì)，但是隨著微生物發(fā)酵酶制劑工業(yè)的發(fā)展，利用各種突變株，已生產(chǎn)出大量的酶。這使得酶的供應(yīng)從質(zhì)量和種類上都有了飛躍的發(fā)展、酶的價(jià)格顯善下降。因此，用作分析試劑已成為可能。 酶分析法迅速擴(kuò)展的第二個(gè)原因提由于酶應(yīng)用形式的發(fā)展。由于近十年來(lái)酶的圃定化技術(shù)有了很快的發(fā)展，使酶的反復(fù)使用和連續(xù)使用成為可能。固定化酶的品種已有不少，它們一方面和自動(dòng)化測(cè)定技術(shù)相結(jié)合，促使酶自動(dòng)化分析法的迅速普及。另一方面也正在進(jìn)一步簡(jiǎn)便化，或制成含

6、酶的試紙，或制成酶試劑包出售，一般只需要加一定量的水就可以直接使用。由于上述原因，酶分析法正在臨床診斷、食品加工和發(fā)酵等方面廣泛應(yīng)用。如用葡萄糖氧化酶(EC1134)測(cè)定血液葡萄糖是臨床檢驗(yàn)中常用的方法，而測(cè)定某些酶含量也是臨床診斷的重要指標(biāo)。 酶分析法的分類 應(yīng)用酶作為分析工具的酶分析法可以對(duì)酶的底物、輔酶、活化劑或抑制劑進(jìn)行定量分析。常用的方法有動(dòng)力學(xué)分析法、終點(diǎn)測(cè)定法和-酶標(biāo)免疫鍘定法。其中終點(diǎn)測(cè)定法應(yīng)用最為普遍。所謂終點(diǎn)測(cè)定法是借助某種酶作用，使被測(cè)物質(zhì)定量地進(jìn)行轉(zhuǎn)變，然后在轉(zhuǎn)化完成后，測(cè)定底物、產(chǎn)物或輔酶物質(zhì)等的變化量。它分為單酶反應(yīng)定量法和偶聯(lián)酶反應(yīng)定量法。 一、終點(diǎn)測(cè)定法單酶反應(yīng)

7、定量法單酶反應(yīng)只需要一種催化酶，如下式所示，用這種反應(yīng)作底物定量時(shí)，可以測(cè)定底物的減少量，也可以測(cè)定產(chǎn)物的增加量。對(duì)含有輔酶的酶，測(cè)定輔酶的變化量也是有效的方法： 底物減少量的測(cè)定在待測(cè)物質(zhì)為底物的酶反應(yīng)中，如果底物能接近完全地轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物(當(dāng)有99轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物時(shí)，則認(rèn)為反應(yīng)完全)，而且底物又具有某種特征性質(zhì)(如具有特殊的吸收光譜)時(shí)，就有可能直接測(cè)定底物的減少量而定量待測(cè)物。根據(jù)這個(gè)原理能進(jìn)行定量的物質(zhì)有胞嘧啶(胞嘧啶脫氨酶反應(yīng)280nm處吸光度的減少)，腺嘌呤(腺嘌呤脫氨酶反應(yīng)，280nm處吸光度的減少)以及尿酸等。 產(chǎn)物增加量的測(cè)定 在被測(cè)物作為底物的酶促反應(yīng)中，如果底物基本上都能轉(zhuǎn)變成為產(chǎn)

8、物，而產(chǎn)物又具有可專一性進(jìn)行定量測(cè)定的物質(zhì)，那么，根據(jù)產(chǎn)物的增加量就能檢測(cè)底物的量。如各種氨基酸類(LLys、LArg、L一Tyr、LHis、LGlu、LAsp等)和草酸等。都可借助相應(yīng)的專一性脫羧酶的作用，用Warburg呼吸測(cè)定生成的C02。還有一類物質(zhì)在某種酶的作用下，形成的產(chǎn)物具有特征的，吸收譜帶。因麗也能甩此法定量。如黃嘌呤和次黃嘌呤(黃嘌呤氧化酶反應(yīng)，293nm處吸光度增加)以及CoA(磷酸轉(zhuǎn)乙?；阜磻?yīng)，233nm處暖光度增加)等。對(duì)于微量物質(zhì)的分析，還可在反應(yīng)體系中加入帶放射性同位素的第二底物，然后檢測(cè)產(chǎn)物中放射性物質(zhì)的參入量，這樣可進(jìn)行高靈敏度的定量。 由輔酶變化量進(jìn)行底物定

9、量NADH和lNADPH在340nm、處有特征最大吸收峰，其摩爾吸光系數(shù)=622×l06，NAD+和NADP+在340nm處沒(méi)有吸收。所以以NAD+或NApP+為輔酶的脫氧酶反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定340am處吸光度的變化，就可以對(duì)相應(yīng)脫氫酶的底物作定量分析此法應(yīng)用范圍很廣. 輔酶的定量 輔酶種類很多，由于它們?cè)诿赶到y(tǒng)中非常重要，因而經(jīng)常妻對(duì)它們作定量分析：?jiǎn)蚊阜磻?yīng)可測(cè)定的輔酶有多種，例如，CoA可用磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA，乙酰CoA：正磷酸乙?；D(zhuǎn)移酶，EC 2318)進(jìn)行測(cè)定：乙酰CoA在233nm有吸收峰，根據(jù)反應(yīng)生成乙酰CoA，由A233的升高計(jì)算CoA含量?？耸纤缶?Ckluyveri

10、)來(lái)源的酶已有商品，它作用CoA的Km為56×1-4mol·L-1；NH4+其激活劑。FAD可用豬腎D一氨基酸氧化酶(EC 1433)進(jìn)行測(cè)定：由測(cè)壓法測(cè)定耗氧率可以計(jì)算FAD含量。NAD+通常用醇脫氫酶(EC 1111)進(jìn)行定量： 此反應(yīng)的平衡常數(shù)有利于左向反應(yīng)，但在高pH(910)和高乙醇濃度下，或再以肼捕獲乙醛，則反應(yīng)向右邊進(jìn)行。因此由A340上升值可計(jì)算NAD+含量。單酶定量分析的用酶量 當(dāng)采用終止法單酶反應(yīng)作定量分析時(shí)，為了使底物或輔酶等被測(cè)物質(zhì)完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物，可以根據(jù)一級(jí)動(dòng)力學(xué)作近似處理，以，估算用酶量。這時(shí)，若測(cè)定底物S的含量，反應(yīng)速度為dESdt=kS，積分

11、得到t=2.3/k*logS0/S,S0為反應(yīng)開(kāi)始前t=0時(shí)的底物濃度，s為反應(yīng)終止時(shí)的底物濃度。通常認(rèn)為，當(dāng)99的底物變?yōu)楫a(chǎn)物時(shí)，即算反應(yīng)接近完全（測(cè)定誤差1），因而logS0/S=log100=2。于是t=4.6/k。在一級(jí)反因時(shí)有v=（Vm/Km）*S=kS,k=Vm/Km,故Vm=kKm=（4.6/t）*Km。當(dāng)Km以mmol*L-1表示時(shí)，此即是每ml反應(yīng)液的用酶量單位（U）的估算依據(jù)。 偶聯(lián)酶反應(yīng)定量法當(dāng)單酶反應(yīng)產(chǎn)物和原始底物用物理化學(xué)手段無(wú)法區(qū)分時(shí)，往往可借助另一酶作為指示酶，通過(guò)偶聯(lián)反應(yīng)進(jìn)行定量_分析。如：可分為兩類： 以脫氫酶作指示酶 用作偶聯(lián)指示酶的酶中，應(yīng)用最廣的是以NA

12、D+或NADP+為輔酶的脫氫酶類。有些指示酶可和多條途徑偶聯(lián)發(fā)揮作用。 如 上述前三個(gè)反應(yīng)，都可以生成G-6-P，所以它們都能以(743)式中G-6-P脫氫酶作為指示酶反應(yīng)。通過(guò)與它偶聯(lián)，并在340hm處測(cè)吸光度，算出NADPH的變化量，從而分別對(duì)葡萄糖、葡萄糖-1-磷酸或果糖進(jìn)行定量分析。已糖激酶專一性不高。可作用于葡萄糖，也作用于果糖。但是借助指示酶反應(yīng)偶聯(lián)法，仍然能夠?qū)ζ咸烟呛凸欠謩e進(jìn)行定量。因?yàn)槠咸烟侵恍枰烟羌っ福湍苌蒅-6-P，并可與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶進(jìn)行偶聯(lián)測(cè)定。而果糖除了需要己糖激酶外，還需要磷酸葡萄糖異構(gòu)酶才能生成G-6-P。例如，G-1-P的定量測(cè)定 在這個(gè)反應(yīng)中

13、，G-1-P和G-6-P很難用物理化學(xué)等手段區(qū)分。要測(cè)定二者的含量都很困難。當(dāng)與葡萄糖-6-磷酸脫氫酶反應(yīng)偶聯(lián)后,NADPH的生成量很容易從A340的吸光度變化算出。而且NADPH的生成量=G-6-P的消耗量=G-1-P的消耗量 如果反應(yīng)完全，則可定量測(cè)定G-1-P。應(yīng)當(dāng)說(shuō)明：反應(yīng)體系中磷酸葡萄糖變位酶需要葡萄糖-1，6-二磷酸為輔酶，但它的Km值很低(0.5umol·L-1)在制備的樣品中就含有微量的G-1，6-DP，所以，不需要再加。 以脫氫酶以外的酶作指示酶除了脫氫酶可作為指示酶以外，還有些酶也能作為指示酶。如葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化生成的H2O2可與過(guò)氧化物酶偶聯(lián)。這里的過(guò)

14、氧化物酶就是指示酶。這里DH2為還原型色素，D為氧化型色素。氧化型色素如鄰聯(lián)(二)茴香胺，二氨基聯(lián)苯胺在420470nm處有吸收峰。所以，用分光光度法測(cè)定D的生成量，就可計(jì)算出G的量。這樣就能對(duì)葡萄糖進(jìn)行定量分析。 偶聯(lián)酶分析法中工具酶的用量一在偶聯(lián)酶分析法中，(739)式中的E1的用量，可以按單酶法計(jì)算，E2的用量如何確定?如果E2純凈而價(jià)廉，可以大量使用，使k2->這樣就可以使中間產(chǎn)物B不能積累，而在測(cè)定時(shí)間內(nèi)使99的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物C。這時(shí)C的濃度用c表示，若以99的A完全由B變成產(chǎn)物C(測(cè)定誤差1)的濃度，用c表示，定義cc=,稱為接近度.動(dòng)力學(xué)分析指出，的值取決于兩步反應(yīng)的速度常

15、數(shù)比=k2/k1和時(shí)間t的取值。當(dāng)偶聯(lián)二步反應(yīng)以一級(jí)反應(yīng)作近似處理時(shí)，t=4.6/k,故由t的取值，可計(jì)算出k。在一般酶法分析中，為簡(jiǎn)化討論，取t=5min，這時(shí)，若=2，則k1=0.92，k2=1.84，可計(jì)算出=0.990；=5時(shí)，k2=46，=0.997，可以認(rèn)為反應(yīng)接近完全。因此，指示酶用量可由下式估算即可： Vm=1.84Km(u*ml-1) (7一46)實(shí)際分析時(shí)，只要將反應(yīng)時(shí)間稍稍延長(zhǎng)(例如7分鐘)，就可以使99的底物轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物了。對(duì)于雙底物的反應(yīng)，只要將另-底物過(guò)量，也可以用擬一級(jí)反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。二、酶循環(huán)分析法酶循環(huán)分析法是在上述酶分析法基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種超微量分析法。具有極

16、高的靈敏度，可測(cè)定飛(fermto-)(10-5)摩爾水平的生物物質(zhì)。它本身就是為適應(yīng)神經(jīng)生化等測(cè)定單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞中的酶及其它超微量物質(zhì)的需要而發(fā)展起來(lái)的。從理論上講，此法可以對(duì)一個(gè)酶分子或其它物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。此外，酶循環(huán)分析法的循環(huán)反應(yīng)機(jī)制本身，可能就是生物機(jī)體代謝反應(yīng)的一種模型系統(tǒng)，故研究它具有重要的理論意義。 酶循環(huán)分析法是利用在專一性上相互關(guān)聯(lián)的兩種酶反應(yīng)進(jìn)行組合、循環(huán)，使微量的酶活性或其它物質(zhì)增幅放大，以達(dá)到定量測(cè)定目的的分析方法。下面以CoA為例，簡(jiǎn)介其分析原理。 為了使待測(cè)物質(zhì)CoA得以循環(huán)放大，先要選擇兩種相關(guān)的酶反應(yīng)：磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(PTA)反應(yīng)和檸檬酸縮合酶(CS)反應(yīng)。在過(guò)量的

17、乙酰磷酸和草酰乙酸存在的條件下，CoA由于PTA的作凋而乙?；癁橐阴oA，并生成和CoA等量的磷酸；另一方面在CS作用下，乙酰CoA又脫?；?。與此同時(shí)也生成與CoA等量的檸檬酸。如此循環(huán)，n次以后，就會(huì)積累相當(dāng)于n倍CoA的檸檬酸與磷酸。也就是說(shuō)CoA得到n倍的放大。此系統(tǒng)再以蘋果酸脫氫酶(MDH)為指示酶偶聯(lián)，在過(guò)量NAD+和蘋果酸存在下，積累起來(lái)的檸檬酸，就可以由NAD+定量地消耗而測(cè)出，并計(jì)算出輔酶A的量。 圖7一5（b)是酶循環(huán)分析的原理模型。酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的分析指出，為了用酶循環(huán)分析法檢測(cè)極微量的底物S(如圖75中的CoA-SH和CoA-S-Ac）反應(yīng)系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)滿足以下要求：(1)底物

18、A1和A2必須遠(yuǎn)大于它們的Km值，這時(shí)由米-孟氏方程v=VmS/(Km+S)可知，vVm,反應(yīng)循環(huán)得以高速運(yùn)行；(2)對(duì)被測(cè)底物Si或S而言，其濃度必須遠(yuǎn)小于它們的Km值，此時(shí)v=(Vm/Km)*S=kS，反應(yīng)速度才與底物濃度呈一級(jí)反應(yīng)關(guān)系，k為一級(jí)反應(yīng)速度常數(shù)；(3)酶E1和E2的濃度也必須十分低，因?yàn)槊?孟氏方程的基本假設(shè)之一就是sE，此時(shí)才有v=Vm=kE的相關(guān)。 在實(shí)際應(yīng)用中，因?yàn)锳1是大大過(guò)量的，因此對(duì)S1而言，是一個(gè)擬單底物反應(yīng)。由于S1反應(yīng)的米氏常數(shù)km1一般在10-6_10-5molL-1水平(常例中多為5200umolL-1)，而被測(cè)底物S1的濃度在10-9mol·

19、L-1水平，符合SKm的要求。但酶E1的濃度往往達(dá)到10-710-5mol*L-1，而大于S1的濃度，不能滿足E1S1的條件，即不符合米一孟氏方程推導(dǎo)時(shí)的基本假設(shè)。因而需要采用Cha等的修正公式處理。 V=Vm1S1/(Km1+S1+E1) (7-47) 此時(shí)由于s1Km1，因而反應(yīng)速度仍可近似地用一級(jí)反應(yīng)描述，即 ： V=Vm1S1/(Km1+E1)=k1S1 (7-48)這里 k1=Vm1/(km1+E1) (749)而最大反應(yīng)速度Vm1取決于E1，而不是S1,若E1-S1復(fù)合物生成產(chǎn)物S2的反應(yīng)速度常數(shù)，用kc1示(相當(dāng)于米一孟氏方程推導(dǎo)時(shí)的k2)，則應(yīng)有Vmkc1E1，于是 K1=kc

20、1E1/km1+E1 (750)此式表明，當(dāng)E1<<Km1時(shí)，k1將隨E1增大而按比例地增大；但若E1接近于Km1或大于Km1時(shí),則k1不再隨E1比例增大，而如米一孟氏方程v一S關(guān)系那樣，按雙曲線關(guān)系逼近某一定值。故有第(3)條要求，E必須十分低。對(duì)于E2的反應(yīng)也可得到相同的結(jié)果。動(dòng)力 學(xué)分析指出，只要S1和S2的濃度一定時(shí)，產(chǎn)物P1和P2的生成速度也為一定。當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行t分鐘(一般為3060分鐘)后，Pl和P2的濃度可由下式確定： 式中s為t=0時(shí)的S1和S2濃度之和，而 稱為循環(huán)率.不難看出，當(dāng)k1+k2為定值時(shí)，只有k1=k2時(shí)，循環(huán)率k才能達(dá)到最大值。k由k1和k2求取。由(

21、7-49)式可知，當(dāng)E1<<Km時(shí)，k1Vm1/Km1。改變S1的濃度，測(cè)得對(duì)應(yīng)的反應(yīng)速度v，再通過(guò)Lineweaver-Burk作圖求得Vm1和Km1，就可計(jì)算k1。同理也可求算k2。為了達(dá)到最大的循環(huán)率，必須k1=k2，由（7-50）式k1E1/(km1+E1),當(dāng)E1<<Km1時(shí)，k1=kc1E1/Km1;同理，k2=kc2E2/km2,當(dāng)k1=k2時(shí)，則有：此式就是選擇酶循環(huán)法最佳循環(huán)率的依據(jù)。Km可以由酶學(xué)手冊(cè)查得，也可以由實(shí)驗(yàn)求得，kc也可由實(shí)驗(yàn)求得。因而可以由此選擇最佳E1與E2的比例。酶循環(huán)分析法的應(yīng)用正如：CoA的循環(huán)分析所代表的那樣，對(duì)于其它輔因子的

22、超微量分析都是適用的。例如，NAD和NADP的測(cè)定，用分光光度法只能達(dá)到10-8mol*ml-1水平，用較靈敏的熒光光度法也只能達(dá)到10-12mol·ml-1平，但用酶循環(huán)法則可達(dá)到10-15mol·ml-1水平。因此，著名的酶法分析專家GGGuilbault指出，輔因子的再生對(duì)酶分析來(lái)說(shuō)，意義可能和固定化酶的應(yīng)用一樣重要。RBaricos等(1975)總結(jié)了輔因子酶促循環(huán)(再生)的文獻(xiàn)，根據(jù)再生所要求的條件，將酶的輔因子分為三種類型： 類型I(自我再生)，包括輔酶B12、FAD、FMN、谷胱甘肽、磷酸吡哆醛和焦磷酸硫胺素。類型(O2為唯一消耗性底物)，包括FAD、FMN、

23、NAD、NADP。類型(需要除O2以外的消耗性底物)，包括ATP、CoA、CoB12、FADH、FMNH、NADH、NADPH和UTP。 固定化酶在酶分析中的應(yīng)用固定化酶是20世紀(jì)60年代發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新技術(shù)。此項(xiàng)技術(shù)剛一興起，就被應(yīng)用于酶分析之中。關(guān)于固定化酶的技術(shù)將在第十章敘述。固定化酶主要因其可以反復(fù)使用，具有較大的穩(wěn)定性和干擾較小三個(gè)優(yōu)點(diǎn)，而受到酶分析工作者的青睞。應(yīng)用固定化酶，還可以使酶分析實(shí)現(xiàn)簡(jiǎn)便化、連續(xù)化和自動(dòng)化，這更是符合分析工作現(xiàn)代化要求的優(yōu)勢(shì)所在。固定化酶可以多種方式廣泛地應(yīng)用于分析技術(shù)：酶電極、酶試紙、酶柱、酶管、試劑組等等。例如，將酶和相關(guān)的物，質(zhì)固定于紙片或其它載體薄

24、層上，用以檢謨4樣品中某些物質(zhì)的大致含量，雖不準(zhǔn)確，但簡(jiǎn)便快速。畢竟固定于紙片上的酶不夠穩(wěn)定，定量也不夠準(zhǔn)確，實(shí)用面不廣，故這方面注意不多。酶(膜)電極是研究最早、資料最豐富的一種應(yīng)用方式；酶牲或酶管已用于各種自動(dòng)化系統(tǒng)，使用標(biāo)準(zhǔn)的分光光度法、熒光法或電化法來(lái)跟蹤反應(yīng)產(chǎn)物和反應(yīng)物的變化，因而有很廣的應(yīng)用范圍。下面分別介紹這兩種方式的作用原理。 酶(膜)電極酶電極主要由選擇性電極（電子感應(yīng)器)和覆蓋在上面的酶膜組成。酶膜由專一性作用于待測(cè)物的酶，經(jīng)物理的或化學(xué)的方法制備，此即酶的固定化。然后，選擇一個(gè)適宜的基礎(chǔ)電極，它能夠?qū)Υ郎y(cè)物|的反應(yīng)產(chǎn)物或反應(yīng)物作“反應(yīng)”(在儀器分析技術(shù)中稱為“響應(yīng)”，re

25、sponse).這個(gè)基礎(chǔ)電極，可以是氣體電極，用以測(cè)定所有消耗O2的反應(yīng)、釋放NH3或CO2的反應(yīng)；可以是玻璃電極，用以跟蹤產(chǎn)酸、產(chǎn)NH4+反應(yīng)過(guò)程H+濃度的變化；也可以是鉑電極，用以鑒定所有涉及電學(xué)活性物質(zhì)或O2濃度變化的酶反應(yīng)；還可以是某種其它的離子選擇電極，例如，CN一電極、NH4+電極、I-電極、S2-電極等。將酶膜貼附于電極的先端感應(yīng)部位；再剪取一塊直徑約為電極上酶膜兩倍的賽璐玢(玻璃紙)透析膜圓片，將酶膜覆蓋包扎起來(lái)，一支酶電極就制備成了。更簡(jiǎn)便的方法是，將酶粉用水或緩沖溶液調(diào)成糊狀，均勻涂布于電極感應(yīng)部位，再用賽璐玢膜包扎即成。 將酶加于能聚合成凝膠的物質(zhì)(如聚丙烯酰胺凝、角叉菜

26、膠等)中，制成酶溶膠，涂布于薄尼龍紗上，使其紗孔中都充滿溶膠，然后貼附于電極上，待膠聚合后，再用透析膜覆蓋包扎，即成物理包埋電極。 將酶溶液直接滴于玻璃電極韻感應(yīng)性膜部位，低溫下待溶劑揮發(fā)后，再滴加雙功能試劑(如戊二醛)溶液，低溫放置l2小時(shí)，使酶與試劑反應(yīng)而被交聯(lián)，再小心地用水漂洗除去未反應(yīng)的酶和試劑，這是一種化學(xué)方法制備酶電極的例子。 酶電極制成后，放在緩沖液中浸泡數(shù)小時(shí)或過(guò)夜，以便緩沖液滲入酶膜，并使膜中空氣溢出。應(yīng)用的間隙期間亦應(yīng)保存于緩沖液中。一支酶電極一般可以反復(fù)多次使用，化學(xué)結(jié)合法制備的酶電極，使用壽命最長(zhǎng)，物理包埋的次之，酶粉直接涂布的，使用數(shù)次則工作穩(wěn)定性下降，但制備簡(jiǎn)單方便

27、。穩(wěn)定性好的酶電極可以使用上千次，一般包埋法酶電極也?？墒褂?00次左右。 所有的酶電極能感應(yīng)的底物濃度范圍，一般為10_-210-4mol·L-1，有的可高到10-1mol·L-1，或低到10-5mol·L-1酶電極對(duì)酶反應(yīng)作出響應(yīng)所需的時(shí)間，稱為響應(yīng)時(shí)值(response-time)。這與不同的基礎(chǔ)電極、制作方法、底物性質(zhì)和濃度、以及pH值、溫度、攪拌等操作條件有關(guān)。酶膜中的酶量不僅影響電極響應(yīng)時(shí)間，而且影響電極的響應(yīng)值(response value)。經(jīng)驗(yàn)表明，1020單位膜的酶量，一般就可以獲得較為滿意的響應(yīng)值。 酶電極及其反應(yīng)，可由圖76葡萄糖氧化酶電極

28、示意看出一斑。其反應(yīng)的工作原理，通常著重從待測(cè)物(如底物)和反應(yīng)產(chǎn)物在反應(yīng)系統(tǒng)中的擴(kuò)散作用對(duì)反應(yīng)速度影響方面討論。由于一般酶電極檢測(cè)的底物濃度是低的，因此，物質(zhì)轉(zhuǎn)化可用一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)處理。酶惦記反應(yīng)系統(tǒng)的擴(kuò)散作用，既包括酶膜內(nèi)的內(nèi)擴(kuò)散，又包括酶膜外表面的外擴(kuò)散。將圖76中酶膜部分放大，可用圖7-7表示。圖中Nernst層指樣品液在膜表面不受攪拌影響的滯留液膜層，示其厚度，L示酶膜厚度，x示物質(zhì)在膜中移動(dòng)距離，S為底物濃度，P為產(chǎn)物濃度，S和P在液-膜系統(tǒng)中的分布，分別由實(shí)線和虛線表示。 式中E為感應(yīng)器的電極電位，E。為參比電極的電位；A為Nernst系數(shù)，即2.3×RTF，R為氣體常數(shù)，T為開(kāi)氏溫度，F(xiàn)為法拉第常數(shù)；Sb為底物在外溶掖中的濃度；B為其它離子影響值；G為反應(yīng)動(dòng)力學(xué)分析中與擴(kuò)散因素、酶膜厚度、Nernst層厚度、酶的最大反應(yīng)速度、Km等有關(guān)的綜合因子(數(shù)學(xué)式見(jiàn)上述參考文獻(xiàn))。當(dāng)BG小于Sb時(shí),E和logSb在一定范圍內(nèi)成線性關(guān)系，這就是酶電極用于物質(zhì)濃度分析的基礎(chǔ)。但是，當(dāng)Sb濃度大于酶的Km時(shí)，酶反應(yīng)已偏離一級(jí)反應(yīng)，則線性關(guān)系不再存在。這是酶電極應(yīng)用中應(yīng)當(dāng)注意的事項(xiàng)。由于式中G牽涉到酶電極反應(yīng)系統(tǒng)的多種復(fù)雜的影響因素，而其