生物化學(xué)及分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)考試

1、一、 實(shí)驗(yàn)原理步驟：1、 分子克隆總流程：分子克隆：在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用體外重組方法將它們插入克隆載體，形成重組克隆載體，通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式，引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增，然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體，可以得到插入DNA的許多拷貝，從而獲得目的基因的擴(kuò)增。流程：（1）帶有目的基因的DNA片段的獲得PCR引物設(shè)計，PCR獲得。（2）重組DNA分子的構(gòu)建與載體酶切連接。（3）重組DNA分子的轉(zhuǎn)化和重組克隆的篩選轉(zhuǎn)化，培養(yǎng)，篩選（4）檢測菌落PCR檢測，粗提質(zhì)粒檢測，酶切檢測，精提質(zhì)粒，測序。2、質(zhì)粒DNA的提取及鑒定堿裂解法

2、原理：根據(jù)共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA和線性染色體DNA在拓?fù)鋵W(xué)上的差異來分離質(zhì)粒DNA。 在，線性的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而被變性，盡管在這樣的條件下，質(zhì)粒DNA的氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈仍緊密結(jié)合。 當(dāng)加入pH4.8的KAc高鹽緩沖液中和pH至中性時，共價閉合環(huán)狀的質(zhì)粒DNA復(fù)性迅速而準(zhǔn)確，而線性的染色體DNA的兩條互補(bǔ)鏈彼此已完全分開，復(fù)性慢，纏繞形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。通過離心，染色體DNA與RNA、蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物等一起絮狀沉淀下來而被除去。步驟：1、細(xì)菌培養(yǎng)和收集 將3ml含Kan的LB液體培養(yǎng)基加入到試管中，接入含質(zhì)粒的大腸桿菌，37振蕩培養(yǎng)過夜。（已完成） 取2.5mL培養(yǎng)物倒入微量離心管（E

3、P管）中, 10000rpm離心1min，吸去培養(yǎng)液。2、細(xì)菌裂解及質(zhì)粒的提取 將細(xì)胞沉淀懸浮于100ul溶液I中,充分震蕩混勻。 加200ul溶液II(新鮮配制),蓋緊管蓋,輕輕混勻內(nèi)容物,將離心管放冰上5min。 加150ul溶液III(冰上預(yù)冷),蓋緊管口,輕輕顛倒數(shù)次使混勻。冰上放置10min。 12000rpm離心10min,將上清轉(zhuǎn)至另一EP管（作好標(biāo)記）中。3、質(zhì) 粒 的 純 化 向上清中加入等體積（450ul）酚:氯仿(1:1) （注意下層是有機(jī)相）,反復(fù)混勻。 12000rpm,離心2分鐘,將上清小心地轉(zhuǎn)移到另一離心管（標(biāo)記?。┲?加入等體積（450ul）氯仿:異戊醇 (24

4、:1),反復(fù)混勻。 12000rpm,離心2分鐘，取上清液于新的EP管中。4、質(zhì)粒的濃縮 加入2倍體積（900ul）無水乙醇,混勻后,室溫放置10-15min。 12000rpm離心5分鐘，倒去上清液,把離心管倒扣在吸水紙上,吸干液體。 用1ml 70%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀, 振蕩并離心, 12000rpm離心2分鐘，倒去上清液, 空氣中干燥510min。5、質(zhì)粒的溶解和保存及電泳檢測 加20ul TE緩沖液,其中含有100ug/ml的胰RNA酶,使DNA完全溶解。 -20保存 1%膠，恒壓150V,電泳10-20分鐘要點(diǎn)：載體定義：基因工程中攜帶目的基因進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。類

5、型：大腸桿菌中的質(zhì)粒、l噬菌體、M13噬菌體、噬菌粒外，還有酵母人工染色體載體及動、植物病毒載體等。條件：復(fù)制子、咸志梅單一識別位點(diǎn)、標(biāo)記基因、適合的拷貝數(shù) 堿解法、煮沸法（cDNA、pDNA變性、復(fù)性不同） 苯酚抽提法（酸性、低離子強(qiáng)度時超螺旋在水相分布） CsCl法（EB插入造成DNA浮力密度不同） SDS 裂解法（高鹽濃度下大分子沉淀，質(zhì)粒在上清） 玻璃纖維膜法(試劑盒)EDTA螯合Mg離子，抑制DNA酶活性，3、質(zhì)粒DNA的酶切鑒定及電泳檢測原理：DNA分子在高于等電點(diǎn)的溶液中帶負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中時有電荷效應(yīng)和分子篩效應(yīng)。 在一定的電場強(qiáng)度下, DNA

6、分子的遷移速度取決于分子篩效應(yīng).具有不同的相對分子質(zhì)量的DNA片段泳動速度不一樣.凝膠電泳不僅可分離不同分子質(zhì)量的DNA, 也可以分離分子質(zhì)量相同,但構(gòu)型不同的DNA分子。超螺旋 線型 開環(huán)步驟：1、酶切：無菌ddH2O 4 l 1 10xbuffer O 1 l 2 質(zhì)粒DNA 3 l 3 BamHI 1 l 4 NotI 1 l 5 總體積 10 ul混勻后,點(diǎn)動（Short）離心， 37酶切60分鐘2、制膠1%，上樣，電泳4、目的基因片段的回收玻璃纖維柱法原理：利用特殊硅基質(zhì)材料，在一定高鹽（消除DNA 和硅基質(zhì)的負(fù)電排斥）緩沖系統(tǒng)下高效、專一地吸附DNA的原理（DNA磷酸基團(tuán)與基質(zhì)硅烷

7、醇基團(tuán)形成氫鍵），配備設(shè)計獨(dú)特的離心吸附柱式結(jié)構(gòu)，快速高效回收DNA片段。步驟1、110V ，1%膠電泳分離2、 切膠，12000離心1min3、 純化：溶膠:估計凝膠的體積,按照100µl膠加入500µl的溶膠液(Gel-lysis Buffer 溶膠液,6M NaI)65水浴溶膠,其間偶爾搖動,至膠完全溶解(熔膠要充分) 裝柱: 將溶液冷卻至室溫,裝柱(做標(biāo)記),10000rpm離心30秒,濾液可以重新上柱,重復(fù)離心一次后棄濾液 漂洗：500µL漂洗液(Washing Buffer漂洗液,含75%乙醇)漂洗,12000rpm離心30秒,去掉廢液 重復(fù)漂洗：重復(fù)

8、漂洗一次,棄廢液 干燥：再12000rpm離心2min(離心要充分,徹底去除乙醇) 洗脫:在柱子中央加入120µl洗脫緩沖液(elution buffer)或ddH2O,室溫放置2分鐘,轉(zhuǎn)入新的EP管中(標(biāo)記),12000rpm離心1分鐘,收集濾液 沉淀:向?yàn)V液中加入15µl的3MNaAC溶液,混勻,然后再加入270µl的無水乙醇,-20保存?zhèn)溆?下次實(shí)驗(yàn)材料)5、大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化原理：l 感受態(tài)（Competence)： 細(xì)菌處于容易吸收外源DNA的狀態(tài)l 轉(zhuǎn)化（transformation)： 異源DNA分子導(dǎo)入受體細(xì)胞的過程l 致敏過程

9、： 用理化方法誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入感受態(tài)的操作在0的CaCl2低滲溶液中，細(xì)菌細(xì)胞發(fā)生膨脹，同時CaCl2使細(xì)胞膜磷脂層形成液晶結(jié)構(gòu)，促使細(xì)胞外膜與內(nèi)膜間隙中的部分核酸酶解離開來，誘導(dǎo)大腸桿菌形成感受態(tài)。Ca2+能與加入的DNA分子結(jié)合，形成抗DNA酶(DNase)的羥基-磷酸鈣復(fù)合物，并黏附在細(xì)菌細(xì)胞膜的外表面上。當(dāng)42熱刺激短暫處理細(xì)菌細(xì)胞時，細(xì)胞膜的液晶結(jié)構(gòu)發(fā)生劇烈擾動，并隨之出現(xiàn)許多間隙，為DNA分子提供了進(jìn)入細(xì)胞的通道。篩選：抗性或藍(lán)白班：又稱藍(lán)白斑篩選法，質(zhì)粒上LacZ基因編碼的肽鏈與受體菌中編碼的半乳糖苷酶C端突變體互補(bǔ)，形成有功能的半乳糖苷酶，在特定培養(yǎng)基上顯藍(lán)斑，這種現(xiàn)象稱為互補(bǔ)。如

10、果有外源DNA片段插入質(zhì)粒上的LacZ基因中，則半乳糖苷酶失活，顯白斑。步驟：（1）、大腸桿菌DH5感受態(tài)的制備1、接單菌落到5ml LB液體培養(yǎng)基中，37、190rpm振蕩培養(yǎng)過夜。2、1%（50 µl) 菌液接種到含5 ml LB的試管中，37 振蕩培養(yǎng)1-2小時，至。（已完成）3、將1.5mL菌液轉(zhuǎn)移到離心管中。4、離心 5000rpm，4，3min。5、倒出培養(yǎng)液上清。6、用冰預(yù)冷的1ml 0.1M的CaCl2處理、輕輕懸浮細(xì)胞。7、冰上靜置20min。8、5000rpm，4離心5min，倒出上清。9、100µl CaCl2輕輕懸浮，冰浴待用。 （2）、質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化1

11、. 100µl的感受態(tài)細(xì)胞分成2管(50µl/EP管)2. 實(shí)驗(yàn)樣品: 將2µl質(zhì)粒DNA加入到50µl感受態(tài)細(xì)胞EP管中，用槍頭輕輕混勻(勿吹打)（標(biāo)記P+）3. 陰性對照：將2µl無菌水加入到50µl感受態(tài)細(xì)胞EP管中，用槍頭輕輕混勻(勿吹打)（標(biāo)記P-）4. 冰浴20min5. （熱擊）42，90sec，靜置，勿搖動6. 迅速放到冰上,冰浴2min7. （復(fù)蘇）加入950µl LB液體培養(yǎng)基（無抗性），標(biāo)明組號，37，200rpm搖床培養(yǎng)30min8. 連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化管：4000rpm離心5分鐘，吸出棄去800uL上清液

12、后，輕輕混勻菌體，將剩余200uL菌液均勻涂布在Kan平板上。 （注意編號!）37培養(yǎng)6、菌落PCR鑒定重組克隆子原理：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) Polymerase Chain Reaction, PCR 在體外中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增一段目的基因的技術(shù)。以單鏈DNA為模板、4種dNTP為底物,在模板3末端引物存在的條件下,利用酶進(jìn)行互補(bǔ)鏈的延伸。經(jīng)變性、退火和延伸多次循環(huán)能使微量的模板DNA得到極大程度的擴(kuò)增。Ø 變性：雙鏈DNA解鏈成為單鏈DNAØ 退火：部分引物與模板的單鏈DNA的特定互補(bǔ)部位相配對和結(jié)合Ø 延伸：以目的基因?yàn)槟０?合成互補(bǔ)的新DNA鏈 (延伸

13、時間：1kb/min)步驟：1、DNA模板的制備(挑取細(xì)菌沉淀)2、引物設(shè)計與合成(教師已做)3、PCR擴(kuò)增GFP基因4、瓊脂糖電泳檢測，1%膠，110V7、重組克隆子的酶切鑒定原理：試劑盒抽提質(zhì)粒，用限制酶切割，瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定大小不等的酶解片段。步驟：1、挑選陽性克隆子培養(yǎng)(已做)2、抽提質(zhì)粒 1.5-5ml過夜培養(yǎng)菌液,倒入EP管中(標(biāo)記), 10000rpm離心1min,棄上清。 加入250µl 溶液I（含RNase A），充分混勻。 加入250µl 溶液II，輕輕混勻，室溫放置2min。 加入350µl 溶液III，輕輕混勻，13000g離心10m

14、in。 將上清液轉(zhuǎn)移至純化柱中（標(biāo)記），13000g離心1min，倒去收集管中的流穿液。 在純化柱中加700µl DNA漂洗液（含70%乙醇），13000g離心1min，倒去收集管中的流穿液。 重復(fù)步驟6。 再次13000g離心2min,用于干燥純化柱。 丟掉下層收集管，將純化柱放入新的1.5ml EP管（標(biāo)記）。 小心加入30ul 50-60度預(yù)熱的Elution Buffer（T buffer or 純H2O）（要加到柱子正中間，是液體均勻擴(kuò)散到DNA吸附填料上），室溫放置2min，13000g離心1min，下層新EP管中液體為所純化的質(zhì)粒DNA。3、酶切分析，10ul體系4、電

15、泳鑒定，1%膠，110V8、轉(zhuǎn)化BL21同DH59、蛋白質(zhì)的誘導(dǎo)表達(dá)原理：E.coli BL21(DE3)：DE3是整合在細(xì)菌基因組上的一種攜帶T7 RNA聚合酶基因和lacI基因的噬菌體lacI產(chǎn)生的阻遏蛋白與lac操縱基因結(jié)合，從而不能進(jìn)行外源基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，即T7基因不表達(dá)，此時宿主菌正常生長。IPTG為乳糖的結(jié)構(gòu)類似物，不能被細(xì)胞利用，特異結(jié)合阻遏蛋白，阻遏蛋白不能與操縱基因結(jié)合，則外源基因大量轉(zhuǎn)錄并高效表達(dá)。步驟：1. 原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)菌株中。2. 挑取單菌落于2mL Kan+ LB培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜。(已做)3. 以5%的比例轉(zhuǎn)接于20mL Kanr LB培養(yǎng)基中

16、(加20µLKan)，培養(yǎng)約1小時至約OD600，即可開始誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)。4. 取1.5mL菌液,制樣作為未誘導(dǎo)對照。5. 三角瓶中加入IPTG 20µL(0.2M)至終濃度為0.2mM，繼續(xù)培養(yǎng)。取樣：分別于培養(yǎng)后，40min，80min,120min取1mL菌液制樣。(0min樣品處理一致)制樣： 12000rpm離心1min,去掉上清。 加入25µL ddH2O,重懸(充分分散細(xì)胞)。 加入25µL 2×SDS凝膠加樣緩沖液，混勻。 沸水浴5min(蛋白質(zhì)變性),取出后立即置于冰上。 冷卻后,冰箱冷藏,備用。待純化樣品的收集和制備：l

17、 收集10ml誘導(dǎo)好的菌液（180min）于15ml 離心管中，5000g離心5min。l 倒掉上清液，用1.0ml lysis buffer（洗滌緩沖液）重懸菌體，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管。l 10000rpm離心2min，去上清。細(xì)菌凍存-20備用。10、蛋白質(zhì)的純化原理：親和層析法his標(biāo)簽和Ni填料 利用his標(biāo)簽和Ni填料結(jié)合，利用不同條件洗去雜質(zhì)，并改變條件將蛋白洗脫收集。步驟：一、收集菌體（已完成）1. 取10mL IPTG誘導(dǎo)3小時的細(xì)菌培養(yǎng)液至一支15mL離心管中，平衡，5000g 離心5min，棄上清。2. 用1mL Lysis Buffer將菌體重懸，轉(zhuǎn)移至一個1.5mL

18、EP管中，12000rpm離心1min，棄上清。將菌體沉淀置20冰箱保存。二、裂解細(xì)胞1. 將上次保存的菌體取出，室溫解凍后加入613uL Lysis Buffer，7uL PMSF（100mM），重懸。2. 向重懸液中加入70uL 溶菌酶（10mg/mL）、7uL RNase A（1mg/mL） 、3.5uL DNase （1mg/mL） ，輕輕混勻后30孵育15min，其間每隔半分鐘輕輕搖動一次混合液。3. 15000g離心10min，將裂解上清轉(zhuǎn)移至另一離心管中。三、蛋白純化1. 向裂解上清中加入 Ni-IDA Resin懸液100uL（注意：吸取前充分混勻），輕柔混勻，冰上放置30min，其間每1min輕輕顛倒一次。2. 將裂解上清與Ni-IDA Resin的混合液轉(zhuǎn)移至一個廢舊的DNA吸附柱中。3. 500g “short”離心10s，棄流穿液。4. 向柱中加入600uL Wash Buffer，500g “short”離心10s，棄流穿液。5. 重復(fù)第“4”步兩次。6. 將吸附柱放在一個干凈的1.5mL EP管上，向柱中的Resin加入50uL Elution Buffer，靜置2min。500g “short”離心10s。7. 將流穿液重新吸回至吸附柱，重復(fù)洗脫2次?？稍谧贤鉄粝掠^察洗脫效果。8. 將吸附柱及Resin交回給老師，洗脫下來的蛋白做