蛺蝶科遺傳多樣性及分子系統(tǒng)發(fā)育研究報告

1、.蛺蝶科遺傳多樣性及分子系統(tǒng)發(fā)育研究【摘要】：蛺蝶科Nymphalidae隸屬鱗翅目Lepidoptera鳳蝶總科Papilionoidea,為蝶類中較大的科,具有很高的觀賞價值和經(jīng)濟價值,但其幼蟲絕大多數(shù)專以植物體為食料,蟲口密度大,是糧食作物、果樹、蔬菜、纖維作物、林木、竹類、藥用植物以及綠肥牧草等的主要害蟲。對蛺蝶科物種的分類研究由來已久,早期主要以形態(tài)特征為依據(jù)進行分類,近來,有學(xué)者采用分子生物學(xué)的方法來重建蛺蝶科部分物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。然而,由于蛺蝶科物種形態(tài)多變且生活史各不相同,該科物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系一直比較混亂,成為昆蟲分類學(xué)家爭論的焦點。此外,由于蛺蝶科內(nèi)各亞科、族及屬間的系統(tǒng)

2、發(fā)育關(guān)系并未澄清,以致無法闡明諸多研究結(jié)果的進化意義。研究該科物種的遺傳多樣性和系統(tǒng)分類學(xué)關(guān)系不僅具有理論意義,也對其生物多樣性保護和農(nóng)業(yè)植保實踐中的防治具有較為重要的應(yīng)用價值。RAPD(隨機擴增多態(tài)性DNA)技術(shù)是1990年由Willianms和Welsh同時提出的一項DNA分子水平的多態(tài)性檢測技術(shù),因其簡捷、成本低且信息含量豐富,被廣泛用于生物類群種屬分類鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、物種親緣關(guān)系和種群遺傳學(xué)等領(lǐng)域的研究。該方法很快被昆蟲學(xué)家所認(rèn)可,廣泛用于種群遺傳學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育研究。線粒體DNA基因和核基因的序列分析是重建物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系及進化研究的有效分子標(biāo)記,早已被廣泛用于研究種群結(jié)構(gòu)、基因缺失

3、、雜交后代、生物地理學(xué)和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。本文采用RAPD技術(shù)探討了蛺蝶科閃蛺蝶亞科大紫蛺蝶和粉蝶科菜粉蝶不同地理種群之間的遺傳多樣性;采用線粒體DNA細胞色素b(Cytb)、細胞色素c氧化酶亞基(COI)和核延長因子(EF-1)基因作為分子標(biāo)記,對我國閃蛺蝶亞科、蛺蝶亞科、線蛺蝶亞科和蛺蝶科部分物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進行初步的探討;結(jié)合GenBank下載序列和自測序列(Data),采用NJ、ML和Bayesian方法分別構(gòu)建蛺蝶科部分物種系統(tǒng)發(fā)育樹,并將后翅臀角斑、眼狀斑和后翅外緣突起這3個形態(tài)性狀標(biāo)記在ML系統(tǒng)發(fā)育樹上,對這3個形態(tài)性狀進行進化分析,為更好地開展蛺蝶科系統(tǒng)分類學(xué)研究、生物多樣性保護

4、和防治提供了分子生物學(xué)的實驗依據(jù)。此外,基于自行測定的和GenBank收錄的線粒體COI基因和核EF-1基因序列(Data)蛺蝶科亞科間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系,結(jié)合眼蝶亞科、蛺蝶亞科和Dynaminealexaen物種的化石資料,進一步計算出蛺蝶科所有12個亞科間的首次分歧時間。本文的研究內(nèi)容主要包括以下幾個方面:1.主要采用實驗室保存的干標(biāo)本,比較了酚-氯仿法和飽和NaCl法提取蝶類干標(biāo)本胸部、腹部和中后足肌肉基因組DNA的效果及對RAPD-PCR和線粒體Cytb、COI基因及核EF-1基因部分序列擴增結(jié)果的影響。研究結(jié)果表明:兩種DNA提取方法從干制標(biāo)本中后足肌肉提取的基因組DNA帶型整齊,無拖尾

5、;兩種方法得到的基因組DNA均適用于RAPD-PCR擴增,而酚-氯仿法得到的基因組DNA在隨后的線粒體Cytb、COI基因及核EF-1基因部分序列擴增中效果更好。2.采用RAPD技術(shù)分析了大紫蛺蝶三個地理種群的遺傳多樣性,并以同屬的黑紫蛺蝶指名亞種及近緣屬種黑脈蛺蝶指名亞種為外群,探討了它們之間的親緣關(guān)系及RAPD技術(shù)在蛺蝶屬種間的適用性。經(jīng)篩選的10個隨機引物對供試的58只蝶類標(biāo)本共產(chǎn)生200條擴增譜帶,這些譜帶具有明顯的屬、種間多態(tài)性。根據(jù)Neis遺傳距離,分別用UPGMA和NJ法對其進行聚類,構(gòu)建了分子系統(tǒng)樹。聚類結(jié)果表明:大紫蛺蝶三個地理種群親緣關(guān)系的遠近與地理距離存在一定的相關(guān)趨勢,

6、XX種群與XX種群間存在一定的基因交流。聚類結(jié)果與Neis遺傳距離均表明:大紫蛺蝶與黑紫蛺蝶的親緣關(guān)系較近,而黑脈蛺蝶與上述兩物種的親緣關(guān)系較遠。聚類圖所顯示物種間親緣關(guān)系與傳統(tǒng)的形態(tài)分類結(jié)果基本一致。3.采用12條10bp的隨機引物,對菜粉蝶不同種群共75個個體的基因組DNA進行擴增,共產(chǎn)生143條清晰、穩(wěn)定的譜帶。Neis遺傳距離表明菜粉蝶5個種群間的遺傳距離差異較小。用UPGMA和NJ兩種聚類方法對菜粉蝶5個種群所有個體構(gòu)建聚類圖,除XX種群和XX種群的位置有所不同外,聚類結(jié)果基本一致。UPGMA結(jié)果顯示:代縣種群和夏縣種群最先相聚,隨后這兩個種群與XX種群聚為一支,XX種群再與上述三個

7、種群相聚,XX種群與其余四個種群親緣關(guān)系最遠。菜粉蝶種群間遺傳距離與其地理距離之間不存在相關(guān)性。4.測定了重要林業(yè)害蟲閃蛺蝶亞科11屬16種蝶類的線粒體細胞色素氧化酶基因的部分序列,并結(jié)合由GenBank下載的該亞科4種蝶類的相應(yīng)序列進行分析,探討了閃蛺蝶亞科各屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。以玉杵帶蛺蝶,白斑眼蝶,忘憂尾蛺蝶和白帶螯蛺蝶作為外群,采用PAUP*v4.0b4a軟件構(gòu)建了閃蛺蝶亞科的MP和NJ分子系統(tǒng)樹。在所構(gòu)建的系統(tǒng)樹中,由分子數(shù)據(jù)得到的蛺蝶亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)分類學(xué)的基本一致,其中迷蛺蝶屬為單系群;累積蛺蝶為明窗蛺蝶的姐妹群且支持兩物種親緣關(guān)系近的自展置信度很高;支持將白斑迷蛺蝶,迷蛺

8、蝶,夜迷蛺蝶,栗鎧蛺蝶,黃帶鎧蛺蝶,鉑鎧蛺蝶以及銀白蛺蝶等物種由閃蛺蝶屬中移出的修訂。5.參照周堯中國蝶類志中蛺蝶亞科的分類系統(tǒng),通過測定蛺蝶亞科15屬24種蝶類的線粒體細胞色素氧化酶基因部分序列,并結(jié)合由GenBank下載的該亞科8種蝶類的相應(yīng)序列,首次基于分子數(shù)據(jù)研究了國內(nèi)蛺蝶亞科部分物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用NJ,ML和Bayesian三種方法分別構(gòu)建了蛺蝶亞科的分子系統(tǒng)樹,所產(chǎn)生的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致且置信度高。在所構(gòu)建的分子系統(tǒng)樹中,由分子數(shù)據(jù)得到的蛺蝶亞科系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與傳統(tǒng)分類學(xué)觀點存在一些分歧,其中發(fā)現(xiàn)蛺蝶族和斑蛺蝶族非單系類群;支持將眼蛺蝶屬由蛺蝶族移置斑蛺蝶族(=眼蛺蝶族)中;盛蛺

9、蝶屬和蜘蛺蝶屬與蛺蝶族內(nèi)其余屬的關(guān)系較遠;而蛺蝶族中各屬間的關(guān)系為(蛺蝶屬+琉璃蛺蝶屬)+鉤蛺蝶屬)+麻蛺蝶屬)+紅蛺蝶屬)+(盛蛺蝶屬+蜘蛺蝶屬),為我國蝶類分子系統(tǒng)發(fā)育研究提供了新的資料。6.為了探討線蛺蝶亞科(參照Harvey的分類系統(tǒng),1991)的分類地位,根據(jù)自行測定的和GenBank收錄的線粒體COI基因和核EF-1基因序列構(gòu)建了線蛺蝶亞科、閃蛺蝶亞科、蛺蝶亞科、眼蝶亞科、斑蝶亞科、絹蛺蝶亞科、秀蛺蝶亞科、螯蛺蝶亞科、摩爾福蝶亞科和喙蝶亞科(參照Harvey的分類系統(tǒng),1991)部分物種的NJ、ML和Bayesian系統(tǒng)樹。系統(tǒng)樹顯示曾被Harvey歸為苾蛺蝶族、線蛺蝶族、絲蛺蝶族

10、和秀蛺蝶族的物種各自聚為相應(yīng)的聚類簇,且線蛺蝶族的物種與其余3個族的親緣關(guān)系很遠,支持將苾蛺蝶族、線蛺蝶族、絲蛺蝶族和秀蛺蝶族分別變更為相應(yīng)亞科的分類學(xué)觀點。此外,根據(jù)重新界定的線蛺蝶亞科分類群,測定了該亞科9屬21種蝶類的線粒體細胞色素氧化酶基因的部分序列,并結(jié)合由GenBank下載的該亞科17種蝶類的相應(yīng)序列進行分析,首次探討了線蛺蝶亞科各屬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。結(jié)果與傳統(tǒng)分類學(xué)的觀點基本一致,支持線蛺蝶亞科的單系性,并對線蛺蝶亞科中各族間的系統(tǒng)學(xué)關(guān)系給出了合理的假設(shè)。7.實驗測定蛺蝶科(參照周堯的中國蝶類志)9亞科51種蝶類的線粒體細胞色素b基因的部分序列,以鳳蝶科金鳳蝶作為外群,采用PAUP

11、*v4.0b4a軟件構(gòu)建了蛺蝶科的NJ系統(tǒng)樹。系統(tǒng)樹顯示各亞科均為非單系類群,各屬種間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較為混亂,多數(shù)分支的自展支持率很低?？赡苡捎诒緦嶒炈鶞y定線粒體DNACytb基因的片段較短,加上線粒體基因進化速率相對較快,密碼子第三位點可能存在堿基替換飽和的現(xiàn)象,導(dǎo)致信息含量偏低而不能正確反應(yīng)所研究類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。因此,我們基于線粒體DNACOI基因和核EF-1基因部分序列的聯(lián)合數(shù)據(jù)構(gòu)建蛺蝶科部分物種的系統(tǒng)發(fā)育樹,以期揭示蛺蝶科各亞科間更為真實可靠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。采用Data和Data數(shù)據(jù)集構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹均表明蛺蝶科部分亞科關(guān)系為:(蛺蝶亞科+閃蛺蝶亞科)+(絲蛺蝶亞科+苾蛺蝶亞科)+

12、秀蛺蝶亞科)+(袖蛺蝶亞科+線蛺蝶亞科)。比較采用Data和Data數(shù)據(jù)集構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果顯示應(yīng)將摩爾福蝶亞科歸入眼蝶亞科中,而閃蛺蝶亞科中的各物種科分為兩個族:閃蛺蝶族和鎧蛺蝶族。8.基于自行測定的和GenBank收錄的線粒體COI基因和核EF-1基因部分序列(Data數(shù)據(jù)集)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,并將后翅臀角斑、眼狀斑和外緣突起這3種形態(tài)性狀標(biāo)記在基于Data數(shù)據(jù)集構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹上。結(jié)果表明這3個性狀在蛺蝶科內(nèi)可能是多次起源的。9.基于自行測定的和GenBank收錄的線粒體COI基因和核EF-1基因部分序列(Data數(shù)據(jù)集),應(yīng)用最大似然法、貝葉斯推斷法及馬爾可夫鏈蒙特卡羅方法構(gòu)建世

13、界蝶類最大科蛺蝶科亞科間的系統(tǒng)發(fā)育樹,并對該科分子系統(tǒng)發(fā)育樹各分支間的進化速率進行了差異顯著性檢驗。結(jié)合眼蝶亞科、蛺蝶亞科和Dynaminealexaen物種的化石資料,計算獲得了蛺蝶科所有12個亞科間的首次分歧時間的平均估計值為44.2-87.1百萬年前(MYA)。結(jié)果有助于人們深入了解該科的起源與進化以及估計蝶類和其它復(fù)雜類群的分歧時間?！娟P(guān)鍵詞】：蛺蝶科RAPD線粒體DNA核基因系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系【學(xué)位授予單位】：XX大學(xué)【學(xué)位級別】：博士【學(xué)位授予年份】：2008【分類號】：Q96【目錄】：中文摘要10-14英文摘要14-20第一章前言20-461.1蝴蝶概述20-251.1.1蝴蝶分類概述

14、20-211.1.2蛺蝶科生物學(xué)特性、分類及系統(tǒng)關(guān)系21-221.1.3國內(nèi)外蛺蝶科研究現(xiàn)狀22-251.2分子系統(tǒng)學(xué)研究25-351.2.1分子系統(tǒng)學(xué)概述25-261.2.2分子系統(tǒng)學(xué)基本原理26-281.2.3研究方法28-331.2.4蝶類物種分子系統(tǒng)學(xué)研究現(xiàn)狀33-351.3遺傳多樣性研究35-401.3.1遺傳多樣性研究的方法36-391.3.2蝶類物種遺傳多樣性研究現(xiàn)狀39-401.4分子鐘40-411.5系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建方法41-441.5.1距離法421.5.2最大簡約(MP)法42-431.5.3最大似然(ML)法431.5.4貝葉斯(Bayesian)法43-441.6本課

15、題研究的目的和意義44-46第二章大紫蛺蝶和菜粉蝶的遺傳多樣性研究46-732.1引言46-472.1.1大紫蛺蝶及其相關(guān)物種的概述462.1.2菜粉蝶概述46-472.2材料與方法47-562.2.1實驗材料47-512.2.2實驗方法51-562.3實驗結(jié)果56-702.3.1引物篩選結(jié)果562.3.2蝶類干標(biāo)本不同部位基因組DNA的提取結(jié)果56-572.3.3大紫蛺蝶三個地理種群的遺傳多樣性分析57-652.3.4菜粉蝶XX省內(nèi)5個地理種群的遺傳多樣性分析65-702.4分析與討論70-722.4.1蝶類干標(biāo)本不同部位的基因組DNA提取702.4.2大紫蛺蝶三個地理種群的遺傳多樣性分析7

16、0-712.4.3菜粉蝶XX省內(nèi)5個地理種群的遺傳多樣性分析71-722.5小結(jié)72-73第三章閃蛺蝶亞科、蛺蝶亞科和線蛺蝶亞科部分物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究73-1183.1引言73-753.1.1閃蛺蝶亞科的概述733.1.2蛺蝶亞科的概述73-743.1.3線蛺蝶亞科的概述74-753.2材料和方法75-853.2.1實驗材料75-813.2.2實驗方法81-853.3實驗結(jié)果85-1113.3.1PCR擴增產(chǎn)物檢測853.3.2PCR回收樣品的檢測85-873.3.3測序873.3.4閃蛺蝶亞科部分物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究87-963.3.5蛺蝶亞科主要分類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系96-973.3.6線蛺蝶亞科主要分類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系97-1113.4分析與討論111-1163.4.1閃蛺蝶亞科部分物種系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究111-1133.4.2蛺蝶亞科主要分類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系113-1143.4.3線蛺蝶亞科主要分類群的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系114-1163.5小結(jié)116-118第四章蛺蝶科部分物種系統(tǒng)進化研究118-1364.1引言1184.2材料和方法118-1254.2.1實驗材料118-1224.2.2實驗方法122-1254.