細菌噬菌體的遺傳分析

1、一、轉(zhuǎn)化（transformation）：概念：某些細菌通過其細胞膜攝取周圍供體的染色體片段，將此外源DNA片段通過重組整合到自己染色體組的過程。1928年，格里費斯(Griffith F.)在肺炎雙球菌中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象。1944年，阿委瑞(Avery O. T.) 進行肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化試驗；證實遺傳物質(zhì)是DNA；轉(zhuǎn)化是細菌交換基因的方法之一。轉(zhuǎn)化的條件：細菌活躍攝取外源DNA分子；具備重組程序所必需的酶。轉(zhuǎn)化三種細菌：肺炎雙球菌；枯草桿菌；流感嗜血桿菌。轉(zhuǎn)化的兩個例子：.用兩個帶有不同抗性的肺炎雙球菌群體混合可以發(fā)現(xiàn)帶有雙抗性的細菌。細菌裂解DNA殘留其它細菌攝取轉(zhuǎn)化。.枯草桿菌活細胞表面分泌D

2、NA，可被其它細胞攝取。、供體與受體的互作：.轉(zhuǎn)化片斷的大?。悍窝纂p球菌轉(zhuǎn)化：DNA片斷至少有800個堿基對；枯草桿菌的轉(zhuǎn)化：DNA片斷至少有16000個堿基對。.供體DNA分子存在的數(shù)目：供體DNA分子數(shù)目與特定基因的成功轉(zhuǎn)化有關(guān)。鏈霉素抗性基因轉(zhuǎn)化：每個細胞含有10個DNA分子之前，抗性轉(zhuǎn)化體數(shù)目一直與DNA分子存在數(shù)目成正比。原因：細菌的細胞壁或細胞膜上有固定數(shù)量的DNA接受座位，故一般細菌攝取的DNA分子數(shù)10個。受體的生理狀態(tài)：感受態(tài)是處于剛停止DNA合成、而蛋白質(zhì)合成繼續(xù)活躍進行時的狀態(tài)?；钴S合成的蛋白質(zhì)可使細菌細胞壁易于接受轉(zhuǎn)化DNA。只有感受態(tài)受體細胞才能攝取并轉(zhuǎn)化外源DNA，

3、而這種感受態(tài)也只能發(fā)生在細菌生長周期的某一時間范圍內(nèi)。、轉(zhuǎn)化DNA的攝取和整合過程：.結(jié)合與穿入： DNA分子結(jié)合在接受座位上(可逆)，可被DNA酶降解；接受座位飽和性。DNA攝取(不可逆)，不受DNA酶破壞。穿入后，由外切酶或DNA移位酶降解其中一條鏈。.聯(lián)會：按各個位點與其相應(yīng)的受體DNA片段聯(lián)會。親緣關(guān)系越遠，聯(lián)會越小、轉(zhuǎn)化的可能性越小。整合(重組)：是指單鏈的轉(zhuǎn)化DNA與受體DNA對應(yīng)位點的置換穩(wěn)定地進入到受體DNA。對同源DNA具有特異性。異源DNA，視親緣關(guān)系遠近也可發(fā)生不同頻率整合。 黎德伯格等用枯草桿菌進行轉(zhuǎn)化和重組試驗：DNA 片段進入受體細胞后，可與受體染色體發(fā)生重組。緊密

4、連鎖的兩個基因有較多的機會在同一個DNA片段中同時整合到受體染色體中。三者并發(fā)轉(zhuǎn)化的頻率高，故這3個基因是連鎖的，其中his2和tyr1連鎖最為緊密：單交換時，染色體開環(huán)易降解，故不存在單交換類型；只有雙交換和偶數(shù)的多交換才有效。二、接合（conjugation）：1.概念：是指原核生物的遺傳物質(zhì)從供體轉(zhuǎn)移到受體內(nèi)的過程。特點：需通過細胞的直接接觸。右圖為原核生物的轉(zhuǎn)移。2實例：黎德伯格和塔特姆（1946年）：不同營養(yǎng)缺陷型的大腸桿菌：A菌株：Met- bio- thr+ leu+，需加甲硫氨酸和生物素。B菌株：Met+ bio+ thr- leu-，需加蘇氨酸和亮氨酸。A菌株和B菌株營養(yǎng)缺陷

5、型，不能在基本培養(yǎng)上生長。A+B菌株混合培養(yǎng)，在完全培養(yǎng)基上，幾小時后離心，涂布基本培養(yǎng)基上，長出原養(yǎng)型(Met+ bio+ thr+ leu+)菌落。左下圖為A菌株、B菌株實驗。這種原養(yǎng)型細胞如何出現(xiàn)？培養(yǎng)基上一邊加壓和吸引使培養(yǎng)液充分混合結(jié)果任何一臂的培養(yǎng)基上均未長出原養(yǎng)型細菌。直接接觸(接合)是原養(yǎng)型細胞出現(xiàn)的必要條件。海斯（Hayes W.,1952)證明：接合過程是一種單向轉(zhuǎn)移，A菌株遺傳物質(zhì)B菌株，從供體（donor）到受體（receptor）。、F因子及F向F的轉(zhuǎn)移：F 因子：致育因子(性因子)，是一種附加體。攜帶F因子的菌株稱為供體菌或雄性，用F表示。未攜帶F因子的菌株為受體菌

6、或雌性，用F表示。F因子的組成：染色體外遺傳物質(zhì)，環(huán)狀DNA； 40-60個蛋白質(zhì)基因；2-4個/細胞(雄性內(nèi))。F因子的三種狀態(tài)：以大腸桿菌為例：沒有F因子，即F；一個自主狀態(tài)F因子，即F；一個整合到自己染色體內(nèi)的F因子，即Hfr。 自主狀態(tài)時F因子獨立進行分裂。 、Hfr細胞的形成及染色體的轉(zhuǎn)移： 部分二倍體：當F或Hfr的細菌染色體進入F后，在一個短時期內(nèi)，F(xiàn)細胞內(nèi)的某些位點就會成為二倍體DNA。 部分二倍體中發(fā)生交換:單數(shù)交換：打開環(huán)狀染色體，產(chǎn)生一個線性染色體，這種細胞是不能成活的。偶數(shù)交換：產(chǎn)生可遺傳的重組體和片段。、中斷雜交試驗及染色體連鎖圖：50年代，雅科（Jacob F.）和

7、沃爾曼（Wollman E.）： 中斷雜交試驗：發(fā)現(xiàn)接合時遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移是直線進行。其方法為：Hfr菌株與F菌株混合培養(yǎng)。Hfr菌株：strs a+ b+ c+ d+對鏈霉素敏感F-菌株：strr a- b- c- d-抗鏈霉素不同時間取樣攪拌器中斷雜交稀釋含鏈霉素完全培養(yǎng)基殺死Hfr細菌抗str細菌菌落影印培養(yǎng)法：鑒定a+b+c+d+各基因轉(zhuǎn)移時間。實例：Hfr菌株：蘇氨酸(thr+)、亮氨酸(leu+)、抗疊氮化物(azir)、抗T1噬菌體(tonr)、半乳糖(galb+)、乳糖(lac+)。F-菌株：thr-、leu-、azis、tons、galb-、lac-型。8分鐘時：thr+進入F-

8、細胞；8.5分鐘時：leu+進入F-細胞；9分鐘時：出現(xiàn)疊氮化物抗性的菌落，少數(shù)azir基因進入F-細胞；11分鐘時：出現(xiàn)抗噬菌體T1的F-細菌；18和25分鐘時：分別出現(xiàn)乳糖和半乳糖發(fā)酵基因，即lac+和galb+進入F-細胞。重組體中各標志基因進入F- 細胞中時間不同，達到最高水平的時間也不同；隨時間的推遲，某個基因的重組率增加；一定程度后，重組率便不再增加。如：10tonr首次出現(xiàn)， 15時40%、25后80%。Hfr中基因是按一定的線性順序依次進入F-菌株的。 下圖為以基因出現(xiàn)的時間為標準作出E. coli的遺傳連鎖圖。三、性導(dǎo)（sexduction）: 性導(dǎo)：指接合時由F因子所攜帶的

9、外源DNA整合到細菌染色體的過程。F因子整合過程：可逆，發(fā)生環(huán)出時，F(xiàn)因子又可重新離開染色體（下右圖）。Adelberg和Burns(1959)：*F因子偶爾在環(huán)出時不夠準確，會攜帶出染色體上的一些基因，這種因子稱為F因子。*F因子攜帶染色體的節(jié)段大?。簭囊粋€標準基因到半個細菌染色體（下中圖）。F因子使細菌帶有某些突出的特點：F因子轉(zhuǎn)移基因頻率極高，如同F(xiàn)+因子轉(zhuǎn)移頻率；F因子自然整合率極高，并且整合在一定的座位上（下左圖）。攜帶與細菌染色體一樣的同源區(qū)段；而正常F因子可在不同座位整合。四、轉(zhuǎn)導(dǎo)（transduction）： 1.概念：是指以噬菌體為媒介進行細菌遺傳物質(zhì)重組的過程，是細菌遺傳物

10、質(zhì)傳遞和交換方式之一。2.特點：以噬菌體為媒介細菌的一段染色體被錯誤地包裝在噬菌體的蛋白質(zhì)外殼內(nèi)通過感染轉(zhuǎn)移到另一個受體細胞內(nèi)。感染細菌的能力決定于噬菌體的蛋白質(zhì)外殼。、普遍性轉(zhuǎn)導(dǎo)：.作用：可轉(zhuǎn)導(dǎo)細菌染色體組的任何部分。轉(zhuǎn)導(dǎo)顆粒：把細菌染色體片段包裝在噬菌體蛋白質(zhì)外殼內(nèi)而產(chǎn)生的假噬菌體，其中并不包含噬菌體的遺傳物質(zhì)。 、特殊性轉(zhuǎn)導(dǎo)：由溫和噬菌體(、MU、MB 噬菌體)進行的轉(zhuǎn)導(dǎo), 特點：轉(zhuǎn)導(dǎo)僅限于靠近原噬菌體附著點的基因。一、噬菌體的結(jié)構(gòu)：1.結(jié)構(gòu)簡單：蛋白質(zhì)外殼、核酸、某些碳水化合物、脂肪等。2.多樣性的原因：外殼的蛋白質(zhì)種類、染色體類型和結(jié)構(gòu)。3.兩大類： 烈性噬菌體：T噬菌體系列(T1-

11、T7)； 溫和性噬菌體: P1和噬菌體。2.P1和噬菌體的特性：P1和各代表不同的溶源性類型：P1噬菌體：侵入后并不整合到細菌的染色體上，獨立存在于細胞質(zhì)內(nèi)；噬菌體：通過交換整合到細菌染色體上。溶源性細菌分裂兩個子細胞：P1噬菌體復(fù)制則使每個子細胞中至少含有一個拷貝；噬菌體隨細胞染色體復(fù)制而復(fù)制，細胞中有一個拷貝。共同特點：核酸既不大量復(fù)制，也不大量轉(zhuǎn)錄和翻譯。2T2噬菌體的研究最為廣泛：.正常噬菌體r+：噬菌斑小而邊緣模糊。r-突變體(rapid lysis，速溶性)：噬菌斑大而邊緣清楚。.寄主范圍突變體：指能克服噬菌體抗性的突變體。例：T2 h+ 噬菌體：只侵染大腸桿菌B株；半透明噬菌斑。

12、T2 h- 突變株：能利用B株和B/2株；透明噬菌斑。雙重感染：h-和h+均能感染B株可用T2兩個親本h-r+和h+r同時感染B株。h-r+(透明，小)h+r-(半透明，大)同時感染B菌株獲得噬菌體子代親本型：h-r+， h+r-重組型：h-r-， h+r+將親本型和重組型混合子代感染混合有B和B/2菌株的培養(yǎng)基h-r+(親)：噬菌斑透明、小，邊緣模糊h+r-(親)：噬菌斑半透明、大，邊緣清楚h-r-(重組)：噬菌斑透明、小，邊緣清楚h+r+(重組)：噬菌斑半透明、小，邊緣模糊重組值計算：重組值=重組噬菌斑數(shù)/總噬菌斑數(shù)100%= (h+r+ + h-r-)/(h+r- + h-r+ + h+r+ + h-r-)100%去掉%即可作為圖距。不同速溶菌的突變型在表現(xiàn)型上不同，可分別寫成ra、