細(xì)胞培養(yǎng)基種類與基本成分

1、細(xì)胞培養(yǎng)基種類與基本成分培養(yǎng)基種類經(jīng)典的培養(yǎng)基有很多種，其中DMEM、RPMI 1640、MEM、DMEM/F12都 是應(yīng)用最廣泛的培養(yǎng)基。其他 如M199、IMDM、L15培養(yǎng)基等也用于某些 細(xì)胞的培養(yǎng)。其具體的特征及應(yīng)用如下：1、BME細(xì)胞培養(yǎng)基基礎(chǔ) Eagle 培養(yǎng)基(Basal Medium Eagle) , 1955 年 Eagle 設(shè)計(jì)，BSS+ 12 種氨 基酸+谷氨酰胺+ 8種維生素。簡(jiǎn)單、便于添加，適于各種傳代細(xì)胞系和特殊研 究用，在此基礎(chǔ)上改良的細(xì)胞培養(yǎng)基品種有 MEM、DMEM、IMDM等。2、MEM細(xì)胞培養(yǎng)基又稱低限量 Eagle培養(yǎng)基(Minimal Essentia

2、l Medium) , 1959年在 Eagle's基礎(chǔ) 培養(yǎng)基(BME)上修改而來(lái)，刪去賴氨酸、生物素，氨基酸濃度增加，適合多 種細(xì)胞單層生長(zhǎng)，有可高壓滅菌品種，是一種最基本、試用范圍最廣的培養(yǎng)基， 但因其營(yíng)養(yǎng)成分所限，針對(duì)生產(chǎn)之特定細(xì)胞培養(yǎng)與表達(dá)時(shí)， 并不一定是使用效果 最佳或者最經(jīng)濟(jì)的培養(yǎng)基。3、DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基|DMEM是由Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基，起初是為小鼠成纖維細(xì)胞設(shè)計(jì)的。DMEM的氨基酸濃度是MEM的兩倍，維生素濃度是 MEM的4倍，采用雙倍 的HCO3-和CO2濃度起到更好的緩沖作用。最初的配方中葡萄糖含量為1000 mg/L,后來(lái)為了某些細(xì)胞的生長(zhǎng)需

3、要，將葡萄糖含量又調(diào)整為4500 mg/L,這就是大家常說(shuō)的低糖和高糖了。低糖適于依賴性貼壁細(xì)胞培養(yǎng)，特別適用于生長(zhǎng)速度快、附著性較差的月中瘤細(xì)胞 培養(yǎng)。高糖更適合高密度懸浮細(xì)胞培養(yǎng)， 也適用于附著性較差，但又不希望它脫 離原來(lái)生長(zhǎng)點(diǎn)的克隆培養(yǎng)，也可用于雜交瘤中骨髓瘤細(xì)胞和 DNA轉(zhuǎn)染的轉(zhuǎn)化細(xì) 胞的培養(yǎng)。例如CHO細(xì)胞表達(dá)生產(chǎn)乙肝疫苗、CHO細(xì)胞表達(dá)EPOo4、IMDM細(xì)胞培養(yǎng)基|Guilber 和 Iscove 將 Dulbecco' Medium 改良為 Iscove's Medium,用于培養(yǎng)紅細(xì)胞 和巨噬細(xì)胞前體。此種培養(yǎng)液含有硒、額外的氨基酸和維生素、丙酮酸鈉和HEP

4、ES。并用硝酸鉀取代了硝酸鐵。IMDM 還能夠促進(jìn)小鼠B淋巴細(xì)胞，LPS 刺激的B細(xì)胞，骨髓造血細(xì)胞，T細(xì)胞和淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。IMDM為營(yíng)養(yǎng)非 常豐富的培養(yǎng)液，因此可以用于高密度細(xì)胞的快速增殖培養(yǎng)。5、RPMI-1640 細(xì)胞培養(yǎng)基|Moore等人于1967年在Roswell Park Memorial Institute研制，針對(duì)淋巴細(xì)胞培養(yǎng) 設(shè)計(jì)，含BSS+ 21種氨基酸+維生素11種等。現(xiàn)也用于懸浮細(xì)胞培養(yǎng)，如哺乳 動(dòng)物、特殊造血細(xì)胞、正?；驉盒栽錾陌准?xì)胞，雜交瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，其它像 K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴細(xì)胞、T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞以及 HCT-

5、15 上皮細(xì)胞等均可參考使用。6、HamF10細(xì)胞培養(yǎng)基|1963年Ham設(shè)計(jì)，含微量元素，可在血清含量低時(shí)用，適用于克隆化培養(yǎng)。F10 適用于倉(cāng)鼠、人二倍體細(xì)胞，特適于羊水細(xì)胞培養(yǎng)。7、DMEM/F12 細(xì)胞培養(yǎng)基|Ham's F12是為在低血清濃度下克隆 CHO細(xì)胞而設(shè)計(jì)的，現(xiàn)在也廣泛應(yīng)用于克 隆形成率的分析及原代培養(yǎng)。F12還可以與DMEM等體積混合使用，得到一種 高濃度與成分多樣化相結(jié)合的產(chǎn)物，這種培養(yǎng)基已應(yīng)用于許多原代培養(yǎng)及更難養(yǎng) 的細(xì)胞系的培養(yǎng)。由于營(yíng)養(yǎng)成分豐富，且可以使用較少血清，故也常作為無(wú)血清 培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。8、M199細(xì)胞培養(yǎng)基|1950年Morgan等設(shè)計(jì)的

6、具有確定化學(xué)成分的細(xì)胞培養(yǎng)液，即 M-199。除BSS 外，含有53種成分，為全面培養(yǎng)基，主要用于雞胚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)。此培養(yǎng)液 必須輔以血清才能支持長(zhǎng)期培養(yǎng)。M-199可用于培養(yǎng)多種種屬來(lái)源的細(xì)胞，并能 培養(yǎng)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞?，F(xiàn)廣泛用于病毒學(xué)、疫苗生產(chǎn)。9、McCoy5A培養(yǎng)基1959年MeCoy為肉瘤細(xì)胞設(shè)計(jì)，BSS+40種成分。可支持多種（如骨髓、皮膚、 肺和脾臟等）的原代移植物的生長(zhǎng)，除適于一般的原代細(xì)胞培養(yǎng)外，主要用于作 組織活檢培養(yǎng)、一些淋巴細(xì)胞培養(yǎng)以及一些難培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)支持。例如Jensen 大鼠肉瘤成纖維細(xì)胞、人淋巴細(xì)胞、HT-29、BHL-100等上皮細(xì)胞。10、L15細(xì)胞培養(yǎng)基I

7、L-15培養(yǎng)液適用于快速增殖瘤細(xì)胞的培養(yǎng)，用于在 CO2缺乏的情況下培養(yǎng)月中瘤 細(xì)胞株。此培養(yǎng)液采用磷酸鹽緩沖體系， 氨基酸組成進(jìn)一步改良，并由半乳糖替 代了葡萄糖。培養(yǎng)基成分細(xì)胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基 (目前使用的培 養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基)，按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。 干粉培養(yǎng)基需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌， 液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直 接使用，非常方便。1、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、維生素及其它輔 助物質(zhì)：氨基酸氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。 不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異， 但有幾 種氨基酸細(xì)胞自身不能合

8、成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基 酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)， 細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于 谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20C冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。 已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4c冰箱中儲(chǔ)存2周以上時(shí)，還應(yīng)重新加入原來(lái)量的谷 氨酰胺。碳水化合物碳水化合物是細(xì)胞生長(zhǎng)主要能量來(lái)源， 其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。 主 要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡。止匕外，通過(guò)提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液

9、的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素 ， 細(xì)胞通?？赡褪?60mOsm/kg320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi) 波動(dòng)。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會(huì)明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓， 特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加HEPES時(shí)需按以下方法調(diào)節(jié) 鈉離子濃度。緩沖系統(tǒng)大多數(shù)細(xì)胞所需pH在7.2 - 7.4。但是，細(xì)月fi培養(yǎng)最適pH值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類 不同而不同。成纖維細(xì)胞喜歡較高 pH (7.4 - 7.7),而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏酸 pH (7.0 - 7.4)。由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉(NaHCO3)與CO2體系進(jìn)行緩沖，因此，氣相中 的CO2濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫

10、鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2 濃度設(shè)定在5%,培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為1.97g/L;如果CO2濃度維持 在10%,培養(yǎng)液中NaHCO3的加入量為3.95g/L。細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋不應(yīng)擰得太緊，以保證氣體交換。HEPES是一種非離子緩沖液，在pH 7.2 - 7.4范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時(shí)對(duì)一些 細(xì)胞可能有毒。HEPES緩沖液可與低水平的碳酸鈉(0.34g/L)共用，以抵消因 額外加入HEPES引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng) 擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，

11、堿性培養(yǎng)液呈深紅色。維生素在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來(lái)源，但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長(zhǎng)。其它成分在一些較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的 DMEM 培養(yǎng)液，使用時(shí)還需要補(bǔ)加丙酮酸鈉和 2-筑基乙醇(2-Mercaptoethanol, 2-Me) 。2-Me對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有很重要的作用。有人認(rèn)為它相當(dāng)于胎牛血清，有直 接刺激細(xì)胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個(gè)重要作用是使血清 中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，為非特異性的激活作用。 同時(shí)避免過(guò)氧化物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的損害。另一個(gè)重要作用是促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和 DNA合

12、成，增加植物凝集素(PHA)對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，已廣泛應(yīng)用于雜交 瘤技術(shù)，另外，也開始用于一些難以培養(yǎng)的細(xì)胞。2-Me是一種小分子還原劑，極易氧化。分子量為 78.13,純的2-Me是一種無(wú)色有刺激味的液體，比重為 1.110-1.120(Do20),常用終濃度為5X0-5M。常配制成0.1M的儲(chǔ)存液，用時(shí)每 升培養(yǎng)液加0.5ml。液體培養(yǎng)基保存：液體培養(yǎng)基應(yīng)于4c冰箱避光保存，實(shí)驗(yàn)前放入37c預(yù)熱。未加血清液體培養(yǎng)基 有效期為12個(gè)月。液體培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而慢慢分 解。如果細(xì)胞生長(zhǎng)不良，可以再添加適量 L-谷氨酰胺。干粉培養(yǎng)基保存：4 c冰箱避光保存，有效期36個(gè)

13、月。 血清細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、 馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的 血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離 出的血清，價(jià)格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來(lái)的 血清，如廠家能做到這一點(diǎn)，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物 質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)， 而不同批次的血清支 持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力也不同，尤其是對(duì)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些批次血清可能含有毒 性或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。因此，在購(gòu)買大量血清之前，必須對(duì)血清

14、支持細(xì)胞生 長(zhǎng)能力進(jìn)行檢測(cè)，然后再大量購(gòu)買質(zhì)量好的同一批號(hào)的血清，并注意以下幾點(diǎn)：(1)需要長(zhǎng)期保存的血清必須儲(chǔ)存于-20C - 70c低溫冰箱中。4c冰箱中保存 時(shí)間切勿超過(guò)1個(gè)月。由于血清結(jié)冰時(shí)體積會(huì)增加約 10%,因此，血清在凍入 低溫冰箱前，必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jī)隽选?2) 一般廠商提供的血清為無(wú)菌，無(wú)需再過(guò)濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則 可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過(guò)濾，切勿直接過(guò)濾血清。(3)瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20 C至-70 C低溫冰箱中的血清放入 4c冰箱中溶解1天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過(guò)程中需不 斷輕輕搖晃均勻(小心勿造成

15、氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切 勿直接將血清從-20C進(jìn)入37c解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝 集而出現(xiàn)沉淀。(4)熱滅活是指56C, 30分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過(guò)程中刖搐晃 均勻。此熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體成分(complement)滅活。除非必須， 一般不建議作此熱處理，因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多， 而且還會(huì)影響 血清的質(zhì)量。補(bǔ)體參與反應(yīng)有：細(xì)胞毒作用，平滑肌細(xì)胞收縮，肥大細(xì)胞和血小 板釋放組胺，增強(qiáng)吞噬作用，促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。(5)切勿將血清在37c放置太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成 分會(huì)破會(huì)而影響血清質(zhì)量。(6)血清中的沉淀物絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維 蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5分鐘去除，也可不用處理。顯微鏡下 小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀 物在顯微鏡下觀察象 小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下