m6去甲基化酶alkbh5通過影響foxm1表達(dá)和自我維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性

1、The m6A Demethylase ALKBH5 Maintains Tumorigenicityof Glioblastoma Stem-Like Cells by Sustaining FOXM1 Expression and Cell Proliferation Programm6A去甲基化酶ALKBH5通過影響FOXM1表達(dá)和自我更新維持膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性Cancer CellIF：27.407April 10, 2017：Wendy匯目 錄CONTENTSPART 03結(jié)果PART 04借鑒總結(jié)PART 01背景介紹PART 02思路PART 05衍生定題1.背景介紹背景介紹G

2、lioblastoma（膠質(zhì)瘤）實(shí)體腦部腫瘤存活率低，易復(fù)發(fā)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞：自我更新抗化療放療調(diào)控機(jī)制未知膠質(zhì)瘤干細(xì)胞如何調(diào)節(jié)自我更新和致瘤性？背景介紹修飾m6A在膠質(zhì)瘤中如何？ALKBH5cALKBH5 ：哺乳動(dòng)物RNA 去甲基化酶N6甲基腺苷：體內(nèi)常見mRNA修飾物c膠質(zhì)瘤中DNA 甲基化很常見且研究多RNA m6A的甲基化機(jī)制未知ALKBH5與腫瘤的研究較少ALHBH5是如何調(diào)控在膠質(zhì)瘤中發(fā)揮去甲基化作用的？膠質(zhì)瘤中調(diào)控RNA甲基化？背景介紹Transcription factor FOXM1FOXM1：參與細(xì)胞，G1/S 和 G2/M 轉(zhuǎn)換,S期抑制FOXM1：膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，預(yù)后差調(diào)節(jié)

3、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞自我更新調(diào)節(jié)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞致瘤性FOXM1在膠質(zhì)瘤癌干細(xì)胞中與m6A的功能未知FOXM1受誰調(diào)控？ 如何調(diào)控？2.思路思路膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中ALKBH5表達(dá)情況ALKBH5R如何調(diào)節(jié)底物的功能ALKBH5R和底物的結(jié)合方式ALKBH5對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和自我更新以及致瘤性有何影響？ALKBH5R底物的功能是？（即在膠質(zhì)瘤中的作用）ALKBH5的調(diào)節(jié)底物是ALKBH5R和底物間的相互作用受什么影響思路檢測(cè)ALKBH5在GSC中的表達(dá)情況生信 RNA-seq analysis免疫熒光 WBEDU增殖體釋稀ALKBH5對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的影響自我更新小鼠預(yù)后分析和成瘤實(shí)驗(yàn)致瘤

4、性PIA分析 RNA seqALKBH5的底物篩選ALKBH5對(duì)底物FOMX1的影響qPCR WB 免疫熒光報(bào)告RNA seqALKBH5如何調(diào)控FOMX1RIPPull down調(diào)節(jié)方式RIP WBF-AS調(diào)節(jié)功能F-AS調(diào)節(jié)方式ALKBH5如何影響FOMX1和HuR的關(guān)系FOMX1相互作用蛋白篩選RIPF-AS如何調(diào)節(jié)ALKBH5和FOXM1的相互作用FOMX1上游調(diào)節(jié)因子尋找生信EDU增殖稀體釋自我更新小鼠預(yù)后分析和成瘤實(shí)驗(yàn)致瘤性結(jié)合位點(diǎn)3.結(jié)果 3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達(dá) 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？

5、 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進(jìn)GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖2.3 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在膠質(zhì)瘤中是一個(gè)負(fù)向預(yù)后因子1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在膠質(zhì)瘤是一個(gè)負(fù)向預(yù)后因子中結(jié)果RNA seqA.生信ALKBH5高表達(dá)的GSC，存活率低；B.不同細(xì)胞ALKBH5表達(dá)量分析C.免疫組化檢測(cè)ALKBH5和SOX2表達(dá)分析；D，相關(guān)性分析E.RNA seq 分析不同GCM和GSC中ALKBH5表達(dá)量分析 3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞

6、中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達(dá) 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進(jìn)GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖2.3 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在膠質(zhì)瘤中是一個(gè)負(fù)向預(yù)后因子 結(jié)果2.1 ALKBH5促進(jìn)GSC 自我更新三種GSC細(xì)胞系F.體外有限稀釋實(shí)驗(yàn)證明干擾ALKBH5，抑制GSC自我更新結(jié)果2.2 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖膠質(zhì)瘤細(xì)胞膠質(zhì)瘤干細(xì)胞A.

7、ALKBH5對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的存活率無影響；B. 干擾ALKBH5引起GSC G0期阻滯A.細(xì)胞存活率檢測(cè)；B.BrdU檢測(cè)細(xì)胞增殖；結(jié)果2.3 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性C.干擾ALKBH5抑制GSC自我更新；拯救實(shí)驗(yàn)恢復(fù)自我更新能力；突變酶活位點(diǎn)不能拯救自我更新能力。D.干擾ALKBH5促進(jìn)GSC小鼠的存活率； E.干擾ALKBH5抑制小鼠GSC體積小結(jié)表達(dá)高表達(dá)不表達(dá)增殖自我更新致瘤性ALKBH5膠質(zhì)瘤干細(xì)胞膠質(zhì)瘤正常 3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達(dá) 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和

8、FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進(jìn)GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖2.3 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在膠質(zhì)瘤中是一個(gè)負(fù)向預(yù)后因子結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物 RNA seq深度 分析，找到m6A序列m6A 相關(guān)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞相關(guān)ALKBH5相關(guān) 找到單一峰選擇不同GSC干細(xì)胞系兩種shRNA進(jìn)行干擾結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物分析干擾ALKBH5BCm6A分析IPA分析A.干擾GSC中ALKBH5的表達(dá)后，分析差異性（兩個(gè)細(xì)

9、胞系，2個(gè)shRNA取交集）；B.干擾ALKBH5后，GSC中腺苷酸甲基化N6位甲基化水平（即m6A）上升C.RNA seq深度發(fā)現(xiàn)干擾ALKBH5后，GGACU這個(gè)序列中A的甲基化上升D.干擾ALKBH5后，唯一的峰有5053個(gè)結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物篩選得到12個(gè)，與ALKBH5以及m6A相關(guān)，以及單一峰值的只有12個(gè)結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物85個(gè)FFOXM1的靶包含在內(nèi)且符合趨勢(shì)進(jìn)一步分析85個(gè)，發(fā)現(xiàn)F中表明FOXM1的均為FOXM1的靶可能性很大結(jié)果3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物小結(jié) ALKBH5 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞m6A底物16

10、個(gè)下游FOMX1 3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達(dá) 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進(jìn)GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖2.3 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在膠質(zhì)瘤中是一個(gè)負(fù)向預(yù)后因子結(jié)果4.1 ALKBH5 促進(jìn) FOXM1的表達(dá)A,B.干擾ALKBH5抑制FOMX1mRNA和蛋白表達(dá)；D,E，F(xiàn).免疫熒光分析ALKBH5和FOXM1的

11、共及相關(guān)性分析結(jié)果4.2 FOXM1 前體轉(zhuǎn)錄本是 ALKBH5的底物RNA的轉(zhuǎn)錄沒影響RNA的轉(zhuǎn)運(yùn)沒影響RNA的穩(wěn)定性沒影響 3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達(dá) 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進(jìn)GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖2.3 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在膠質(zhì)瘤中是一個(gè)負(fù)向預(yù)后因子結(jié)果5.1 FOMX1 轉(zhuǎn)錄本分析Foxm1轉(zhuǎn)

12、錄本分析FOXM1轉(zhuǎn)錄本分析以及引物設(shè)計(jì)結(jié)果5.1 FOXM1 前體轉(zhuǎn)錄本是 ALKBH5的底物RNA聚合酶抑制劑HuR:核內(nèi)RNA結(jié)合蛋白F.干擾ALKBH5抑制FOXM1前體轉(zhuǎn)錄本的表達(dá)；分析；G.ALKBH5G.免疫組化進(jìn)行ALKBH5分析結(jié)果5.2.ALKBH5結(jié)合FOXM1的 3UTR端B.Foxm1的3UTR在干擾ALKBH5 N6腺苷酸會(huì)被去甲基化A.甲基化峰檢測(cè)，F(xiàn)oxm1 3UTR上有單一峰結(jié)果5.3. 證實(shí)ALKBH5調(diào)節(jié)FOXM1的 3UTR端mRNA水平蛋D.包括3UTR序列的FOXM1才會(huì)在干擾ALKBH5后被降解包含有3UTR的序列有作用E.報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)干擾AL

13、KBH5后會(huì)抑制含有3UTR片段的FOXM1的表達(dá)結(jié)果5.4. ALKBH5促進(jìn)HuR 和FOXM1 轉(zhuǎn)錄起始轉(zhuǎn)錄本相互作用mRNAD. 干擾ALKBH后減少了HUR和FOMX1之間的結(jié)合E，F(xiàn). FOXM1和HuR間的關(guān)系：干擾HuR 抑制FOXM1的轉(zhuǎn)錄蛋白小結(jié)轉(zhuǎn)錄和蛋 ALKBH5 FOXM1底物調(diào)控3UTRHuRPre-FOMX1 mRNA相互作用 3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達(dá) 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1

14、 ALKBH5促進(jìn)GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖2.3 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在膠質(zhì)瘤中是一個(gè)負(fù)向預(yù)后因子結(jié)果6.1.FOXM1-AS 是FOXM1起始轉(zhuǎn)錄本的核 lncRNAA.F-AS結(jié)構(gòu)分析于核C.F-ASB.在膠質(zhì)瘤及干細(xì)胞中的表達(dá)分析結(jié)果6.2. 證實(shí)FOXM1-AS 是FOXM1起始轉(zhuǎn)錄本的核 lncRNA相關(guān)性分析mRNA水平蛋A,B.干擾F-AS后，抑制FOXM1表達(dá)； C.F-AS和FOXM1表達(dá)呈正相關(guān)F-as和FOMX1前體作用AMT:不影響蛋白間相互作用的一個(gè)RNA-RNA固定物注：探針無f

15、omx1結(jié)合區(qū)域；用探針拉F-asF.F-AS和FOXM1前體轉(zhuǎn)錄本結(jié)合D.F-AS和ALKBH5相互作用： 用ALKBH5拉到了F-ASE.F-AS探針檢測(cè)到ALKBH5證明F-AS可以和ALKBH5直接結(jié)合正向反向拉結(jié)果6.3. FOXM1-AS 有利于ALKBH5 和 FOXM1起始轉(zhuǎn)錄本的相互作用結(jié)果6.4. FOXM1-AS 是一個(gè)核 lncRNA 有利于ALKBH5 和 FOXM1起始轉(zhuǎn)錄本的相互作用反向?qū)嶒?yàn)，6.3是干擾ALKBH5,此處是干擾F-AS 后反證，進(jìn)一步表明三者的結(jié)合作用K.值得注意的是：干擾F-AS后， HUR富集量也減少了小結(jié)LNCRNA轉(zhuǎn)錄結(jié)合能力F-AS促進(jìn)

16、ALKBH5和FOMX1的結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)FOMX1 mRNA的轉(zhuǎn)錄的作用Pre-FOMX1 mRNAALKBH5F-ASPre-FOMX1 mRNA 3. 分析膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中 ALKBH5的底物 4. ALKBH5 在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中調(diào)節(jié) FOXM1的表達(dá) 5. ALKBH5如何調(diào)控FOXM1？ 結(jié)果7. F-AS和FOXM1 的功能6. 誰調(diào)節(jié) ALKBH5 和 FOXM1的相互作用2.1 ALKBH5促進(jìn)GSC 自我更新2.2 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖2.3 ALKBH5促進(jìn)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的致瘤性1.ALKBH5 在 膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，在膠質(zhì)瘤中是一個(gè)負(fù)向預(yù)后因子結(jié)果7. 1 FOXM1-

17、AS 促進(jìn)GSC的增殖自我更新和成瘤性D, E.抑制F-AS抑制GSC的增殖；F.抑制F-AS抑制GSC的自我更新結(jié)果7. 2 FOXM1-AS 促進(jìn)GSC的干性G.神經(jīng)分化的標(biāo)志檢測(cè)；干擾A,B:多能性檢測(cè)；過表達(dá)結(jié)果7.3. FOXM1 拯救 由 ALKBH5 或FOXM1-AS敲除引起的GSCs增殖抑制A. FOXM1拯救ALKBH5干擾引起的FOXM1的下游抑制量化分析B.FOXM1拯救ALKBH5或F-AS干擾引起的GSC腫瘤生長(zhǎng)抑制結(jié)果7.4. FOXM1 恢復(fù) 由 ALKBH5 或FOXM1-AS敲除引起的GSCs增殖抑制移植瘤增殖干性拯救干擾F-AS引起的增殖和干性抑制拯救干擾

18、ALKBH5引起的增殖和干性抑制小結(jié)FOXM1可以拯救干擾ALKBH5或F-AS引起的生物學(xué)效應(yīng)：拯救移植瘤中干性表達(dá)拯救膠質(zhì)瘤形成拯救FOXM1靶表達(dá)機(jī)制圖4.總結(jié)借鑒9.總結(jié)可借鑒的方法及內(nèi)容正常細(xì)胞癌細(xì)胞癌干細(xì)胞借鑒點(diǎn)1做對(duì)比實(shí)驗(yàn)案例改進(jìn)9.總結(jié)可借鑒的方法及內(nèi)容借鑒點(diǎn)2篩選處證據(jù)十分充足，不僅尋找功能相關(guān)差異顯著的，還考慮到的下游9.1 總結(jié)可借鑒的方法及內(nèi)容1.顱內(nèi)腫瘤實(shí)驗(yàn)：小鼠隨機(jī)分組。存活率實(shí)驗(yàn)：小鼠顱內(nèi)注射10,000 GSCs 直到垂死 或注射后 80 天。 拯救實(shí)驗(yàn)： GSCs 利用 ALKBH5 或 FOXM1-AS shRNA共轉(zhuǎn)染 FOXM1,ALKBH5 質(zhì)粒。 50,000 GSCs 顱內(nèi)注射進(jìn)入小鼠 (n = 8). 注射后30天 （GSC11） ，20 天（GSC17小鼠安樂死并 收獲大腦。