酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)

1、2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)教學(xué)基本內(nèi)容：酶促反應(yīng)的特點(diǎn)；單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程（米氏方程）的推導(dǎo)；抑制劑對酶促反應(yīng)的影響，競爭性抑制和非競爭性抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程的推導(dǎo)；產(chǎn)物抑制、底物抑制的概念，產(chǎn)物抑制和底物抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程的推導(dǎo)；多底物酶促反應(yīng)的機(jī)制，雙底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的推導(dǎo)；固定化酶的概念，常見的酶的固定化方法，固定化對酶性質(zhì)的影響及固定化對酶促反應(yīng)的影響，外擴(kuò)散過程和內(nèi)擴(kuò)散過程分析；酶的失活動(dòng)力學(xué)。2.1 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn)2.2 均相酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ) 單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)抑制劑對酶促反應(yīng)速率的影響多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.3 固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.4 酶的失活

2、動(dòng)力學(xué)授課重點(diǎn)：1. 酶的應(yīng)用研究與經(jīng)典酶學(xué)研究的聯(lián)系與區(qū)別2. 米氏方程。3 競爭性抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。4. 非競爭性抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。5. 產(chǎn)物抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。6. 底物抑制酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。7. 雙底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。8. 外擴(kuò)散對固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，Da準(zhǔn)數(shù)的概念。9. 內(nèi)擴(kuò)散對固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響，準(zhǔn)數(shù)的概念。10. 酶的失活動(dòng)力學(xué)。難點(diǎn)：1. 采用穩(wěn)態(tài)法和快速平衡法建立酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。2. 固定化對酶促反應(yīng)的影響，五大效應(yīng)(分子構(gòu)象的改變、位阻效應(yīng)、微擾效應(yīng)、分配效應(yīng)及擴(kuò)散效應(yīng))的區(qū)分。3. 內(nèi)擴(kuò)散過程分析，涉及到對微元單位進(jìn)行物料衡算和二

3、階微分方程的求解、無因次變換、解析解與數(shù)值解等問題。4.溫度對酶促反應(yīng)速率和酶的失活速率的雙重影響，最適溫度的概念。溫度和時(shí)間對酶失活的影響。本章主要教學(xué)要求：1. 掌握穩(wěn)態(tài)法和快速平衡法推導(dǎo)酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。2. 了解酶的固定化方法。理解固定化對酶促反應(yīng)速率的影響。掌握Da準(zhǔn)數(shù)的概念及準(zhǔn)數(shù)的概念，理解外擴(kuò)散和內(nèi)擴(kuò)散對酶促反應(yīng)速率的影響。 3. 了解酶的一步失活模型與多步失活模型，反應(yīng)過程中底物對酶穩(wěn)定性的影響。2 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)2.1 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn) 酶的基本概念 酶的穩(wěn)定性及應(yīng)用特點(diǎn) 酶是以活力、而不是以質(zhì)量購銷的。 酶有不同的質(zhì)量等級：工業(yè)用酶、食品用酶、醫(yī)藥用酶。酶的實(shí)際應(yīng)用中

4、應(yīng)注意，沒有必要使用比工藝條件所需純度更高的酶。酶的應(yīng)用研究與經(jīng)典酶學(xué)研究的聯(lián)系與區(qū)別經(jīng)典酶學(xué)研究中，酶活力的測定是在反應(yīng)的初始短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行的，并且酶濃度、底物濃度較低，且為水溶液，酶學(xué)研究的目的是探討酶促反應(yīng)的機(jī)制。工業(yè)上，為保證酶促反應(yīng)高效率完成，常需要使用高濃度的酶制劑和底物，且反應(yīng)要持續(xù)較長時(shí)間，反應(yīng)體系多為非均相體系，有時(shí)反應(yīng)是在有機(jī)溶劑中進(jìn)行。2.2 均相酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 均相酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是以研究酶促反應(yīng)機(jī)制為目的發(fā)展起來的。作為酶工程技術(shù)人員，如果僅僅比較詳細(xì)地解釋了酶促反應(yīng)機(jī)制和過程是不夠的，還應(yīng)對影響其反應(yīng)速率的因素進(jìn)行定量的分析，建立可信賴的反應(yīng)速率方程，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行反

5、應(yīng)器的合理設(shè)計(jì)和確定反應(yīng)過程的最佳條件。因此，以討論反應(yīng)機(jī)制為目的的酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與為了設(shè)計(jì)與操作反應(yīng)器的工業(yè)酶動(dòng)力學(xué)，在研究方法上自然不同。這與化學(xué)中的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和工業(yè)上的化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的不同一樣。 酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ)可采用化學(xué)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方法建立酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程。對酶促反應(yīng) ，有： （21） （22） （23）式中， k：酶促反應(yīng)速率常數(shù)； r：酶促反應(yīng)速率； rA：以底物A的消耗速率表示的酶促反應(yīng)速率； rP：以產(chǎn)物P的生成速率表示的酶促反應(yīng)速率。對連鎖的酶促反應(yīng)，如，有： （24） （25） （26） 單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)（米氏方程） 單底物不可逆酶促反應(yīng)是最簡單的酶促反應(yīng)。水解酶、異

6、構(gòu)酶及多數(shù)裂解酶的催化反應(yīng)均屬此類。對單底物酶促反應(yīng) ，根據(jù)酶底物中間復(fù)合物假說，其反應(yīng)機(jī)制可表示為：下面我們分別采用快速平衡法和穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)其動(dòng)力學(xué)方程?？焖倨胶夥ǎ簬c(diǎn)假設(shè)： （1）CS>>CE，中間復(fù)合物ES的形成不會(huì)降低CS。 （2）不考慮這個(gè)可逆反應(yīng)。 （3）為快速平衡，為整個(gè)反應(yīng)的限速階段，此ES分解成產(chǎn)物不足以破壞這個(gè)平衡。根據(jù)以上假設(shè)，建立動(dòng)力學(xué)方程： （27） （28） （29）解之，得 （210） 令， （211）則 （212） 穩(wěn)態(tài)法：幾點(diǎn)假設(shè)：（1）CS>>CE，中間復(fù)合物ES的形成不會(huì)降低CS。（2）不考慮這個(gè)可逆反應(yīng)。（3）CS>>

7、CE中間復(fù)合物ES一經(jīng)分解，產(chǎn)生的游離酶立即與底物結(jié)合，使中間復(fù)合物ES濃度保持衡定，即。 根據(jù)穩(wěn)態(tài)法假設(shè)建立動(dòng)力學(xué)方程： （213） （214） （215）解之，得 （216）令， （217）則 （218） 上式即為通常所說的米氏方程。米氏方程可用圖形表示：rrmaxrmax/2KmCS 圖21 酶濃度一定時(shí)反應(yīng)速率與底物濃度的關(guān)系 討論：（1） 當(dāng)CS<<Km時(shí)，屬一級反應(yīng)。（2） 當(dāng)CS>>Km時(shí)，屬零級反應(yīng)。（3） 當(dāng)CSKm時(shí)，。Km在數(shù)量上等于反應(yīng)速度達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。 Km和rmax的測定方法Linewear Burk法，即雙倒數(shù)法。 對米

8、氏方程兩側(cè)取倒數(shù)，得。以作圖，得一直線，直線斜率為，截距為。根據(jù)直線斜率和截距可計(jì)算出Km和rmax。1r斜率Km/rmax1rmax1CS1Km 圖22 雙倒數(shù)法求解Km和rmax溫度對酶促反應(yīng)速率的影響溫度對酶促反應(yīng)速率的影響，是通過影響k2和KS（）實(shí)現(xiàn)的。 Arrhenius 方程 （234） Vant-Hoff方程 （235）值得注意的是Arrhenius 方程僅在較低溫度下適用于酶促反應(yīng)。過高的溫度將導(dǎo)致酶的失活（見教材P23 圖2-4）。（235）式中為反應(yīng)熱。 抑制劑對酶促反應(yīng)速率的影響 首先應(yīng)搞清失活作用與抑制作用的異同。失活作用：指物理或化學(xué)因素部分或全部破壞了酶的三維結(jié)構(gòu)

9、，引起酶的變性，導(dǎo)致酶部分或全部喪失活性。抑制作用：指酶在不變性條件下，由于活性中心化學(xué)性質(zhì)的改變而引起酶活性的降低或喪失。凡能使酶的活性下降而不引起酶蛋白變性的物質(zhì)稱做酶的抑制劑(inhibitor)。使酶變性失活(稱為酶的鈍化)的因素如強(qiáng)酸、強(qiáng)堿等，不屬于抑制劑。通常抑制作用分為可逆性抑制和不可逆性抑制兩類。EIS.1競爭性抑制 圖23 競爭性抑制作用示意圖反應(yīng)機(jī)理： （236） （237）采用快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程： （238） （239） （240） （241）解之，得 （242）式中，采用穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程： （243） （244） （245） （246） 解之，得 （247）式

10、中: ，令 ，（247）式可變形為 （248） 式中 將（248）式與米氏方程比較，可知最大反應(yīng)速率測有變化，而Km增大。 以作圖，得一直線，直線斜率為，截距為，如圖23所示。CI 1r1CS1rmax-1Km-1KmCI = 0 圖24 競爭性抑制作用下曲線.2非競爭性抑制SIE 圖25 非競爭性抑制作用示意圖反應(yīng)機(jī)理： （249） （250） （251）采用快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程： （252） （253） （254） （255） （256）解之，得 （257）式中，采用穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程： （258） （259） （260） （261） （262） 解之，得 （263）式中，令，（26

11、3）式可變形為 （264） 式中 將（264）式與米氏方程比較，可知最大反應(yīng)速率減小，而Km不變。1r1CS1rmax-1KmCI = 0CI 1rmax 以作圖，得一直線，直線斜率為，截距為，如圖26所示。 圖26 非競爭性抑制作用下曲線2. 2.4.3產(chǎn)物抑制酶促反應(yīng)中，有時(shí)隨產(chǎn)物濃度提高，產(chǎn)物與酶形成復(fù)合物，阻礙了底物與酶的合成，從而降低了酶促反應(yīng)的速度。反應(yīng)機(jī)理： （265）采用快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程： （266） （267） （268） （269）解之，得 （270）式中，采用穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程： （271） （272） （273） （274） 解之，得 （275）式中， 可見，

12、產(chǎn)物抑制實(shí)際上屬于競爭性抑制。.4底物抑制對于某些酶促反應(yīng)，當(dāng)?shù)孜餄舛容^高時(shí)，rp呈下降的趨勢，這種反應(yīng)被稱為高濃度底物抑制或底物抑制（substrate inhibition）型反應(yīng)。rCS0 圖2-7 底物抑制示意圖反應(yīng)機(jī)制：采用快速平衡法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程： （276） （277） （278） （279）解之，得 （280）式中，。 多底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)一般的多底物酶促反應(yīng)可表示為：反應(yīng)式中包含多種底物和多種產(chǎn)物，因此反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程較為復(fù)雜。這里僅討論雙底物酶促反應(yīng)生成兩種產(chǎn)物的情況。設(shè)計(jì)兩底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模型時(shí)會(huì)提出這樣一個(gè)問題，即哪一個(gè)底物先與酶結(jié)合。兩底物同時(shí)與酶結(jié)合的可能性可以排除

13、，因?yàn)檫@要求三體碰撞。很清楚，除非有證據(jù)表明，確實(shí)是A先與酶結(jié)合或B先與酶結(jié)合，否則，只能假定兩底物中的任何一個(gè)都有可能與酶結(jié)合。這樣可提出隨機(jī)機(jī)制（或分支機(jī)制），隨機(jī)與分支在這里有相同的含義，只是從不同的角度描述同一個(gè)問題。隨機(jī)是從概率的角度，分支是從反應(yīng)的途徑上描述。EEQEPEPQEABEAEBE圖2-8 雙底物雙產(chǎn)物酶促反應(yīng)隨機(jī)機(jī)制 兩底物A、B都有可能先與酶結(jié)合，既可能是酶先與B結(jié)合形成EB，再與A結(jié)合，生成EAB，也可能是酶先與A結(jié)合生成EA，再與B結(jié)合生成EAB。EAB為三元復(fù)合物。EAB轉(zhuǎn)變?yōu)镋PQ，EPQ再釋放出產(chǎn)物。產(chǎn)物的釋放也是隨機(jī)的，既可能先釋放出Q，生成EP，再釋放出

14、P，生成E；也可能先釋放出P，生成EQ，EQ再釋放出Q，生成E。在隨機(jī)機(jī)制中出現(xiàn)了三元復(fù)合物EAB，而有些反應(yīng)模型中并不形成三元復(fù)合物。如下圖所示：QBPAEEQEGEAE （2-81）QBPAEA釋放出產(chǎn)物P后，基團(tuán)G仍保留在酶分子上，在酶分子上的G再與B結(jié)合生成Q。在該模型中，沒有出現(xiàn)三元復(fù)合物，但出現(xiàn)了一種“修飾過的酶”EG。在某些酶促反應(yīng)中，反應(yīng)機(jī)制可能要簡單得多。如：PQBAEEPEPQEABEAE （2-82）PQBA 2.3 固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué) 固定化酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)基礎(chǔ) 這里分三個(gè)方面討論：什么是酶的固定化？為什么進(jìn)行酶的固定化？怎樣進(jìn)行酶的固定化？ 生物工業(yè)用酶大多為水溶性，

15、酶促反應(yīng)體系為均相體系，均相體系簡單，但存在一個(gè)缺點(diǎn)，就是酶難以回收利用，同時(shí)，酶和產(chǎn)物混在一起，給產(chǎn)物的提取帶來困難。解決此問題可采用酶的固定化技術(shù)。.1 酶的固定化技術(shù)定義 酶的固定化技術(shù)就是將水溶性的酶分子通過一定的方式，如靜電吸附，共價(jià)鍵等與載體如角叉菜膠、離子交換樹脂等材料，制成固相酶的技術(shù)。 細(xì)胞的固定化技術(shù)：為省去從微生物（動(dòng)、植物）中提取酶的操作，確保酶的穩(wěn)定性，采用直接固定化微生物細(xì)胞，動(dòng)植物細(xì)胞、組織技術(shù)。.2 酶和細(xì)胞固定化方法 作用力 載體 物理吸附法 物理吸附 石英砂，多孔玻璃，淀粉，硅膠，活性碳載體結(jié)合法 離子結(jié)合法 離子鍵 離子交換樹脂 共價(jià)結(jié)合法 共價(jià)鍵 纖維素

16、，尼龍交聯(lián)法：利用雙功能試劑，在酶分子間發(fā)生交聯(lián)，凝膠形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。EOEEOOOE包埋法：將酶包埋在凝膠的微細(xì)格子里，或被半透性的聚合膜所包埋，使酶分子只能從凝膠的網(wǎng)絡(luò)中漏出，而小分子的底物和產(chǎn)物可自由通過。 格子型 常用凝膠：角叉菜膠，明膠，淀粉凝膠，聚丙烯酰胺凝膠 微膠囊.3 固定化對酶性質(zhì)的影響 （1）底物專一性的改變 由于立體障礙，使的底物特異性發(fā)生改變。例如，胰蛋白酶既作用于高分子的蛋白質(zhì)，又作用于低分子的肽或多肽。采用羧甲基纖維素對胰蛋白酶進(jìn)行固定化后，胰蛋白酶對二肽或多肽的作用不變，但對酪蛋白的作用僅為游離酶的3左右。 （2）穩(wěn)定性增強(qiáng) 一般固定化酶比游離酶穩(wěn)定性好，表現(xiàn)在熱穩(wěn)

17、定性，保存和使用穩(wěn)定性的增加，及對蛋白酶的抵抗性和耐受性增強(qiáng)。 （3）最適pH值和最適溫度變化 酶固定化載體為多聚陽離子性質(zhì)時(shí)，固定化酶的最適pH值向酸性一側(cè)移動(dòng)；酶固定化載體為多聚陰離子性質(zhì)時(shí)，固定化酶的最適pH值向堿性一側(cè)移動(dòng)；產(chǎn)物為酸性時(shí)，固定化酶最適pH值向酶性一側(cè)移動(dòng)；產(chǎn)物為中性時(shí)，最適pH值一般無變化。 （4）動(dòng)力學(xué)參數(shù)的變化 酶經(jīng)固定化后，表觀米氏常數(shù)發(fā)生變化。.4影響固定化酶促反應(yīng)的主要因素（1）分子構(gòu)象的改變指固定化過程中酶與載體的相互作用引起酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心的構(gòu)象發(fā)生了變化，導(dǎo)致酶與底物的結(jié)合力下降。（見教材P27圖26）（2）位阻效應(yīng) 由于載體的遮蔽作用或固定化方法

18、不當(dāng)，給酶的活性中心或調(diào)節(jié)中心造成空間障礙 ，使底物和酶無法與酶接觸。（見教材P27圖26）（3）微擾效應(yīng) 由于載體的親水性、疏水性、介電常數(shù)等性質(zhì)，使酶所處的微環(huán)境與宏觀環(huán)境不同，從而改變了酶的催化能力或酶對效應(yīng)物的調(diào)節(jié)能力的效應(yīng)。（4）分配效應(yīng) 由于載體與底物之間疏水性、親水性或靜電作用引起微環(huán)境和宏觀環(huán)境之間物質(zhì)的不等分配，從而影響酶促反應(yīng)速率的一種效應(yīng) 分配效應(yīng)可用分配系數(shù)KP來定量描述。 Kp的定義：載體內(nèi)外底物（或其他物質(zhì)）濃度之比。 Kp的測定：在已知底物濃度CS0、體積V0的溶液中，放入不含底物的一定體積V的載體，并保持適宜條件，當(dāng)達(dá)到平衡時(shí)，測定載體外溶液的底物濃度CS。(5

19、) 擴(kuò)散效應(yīng) 由于底物、產(chǎn)物或其他效應(yīng)物的遷移和傳遞速度所受到的限制，當(dāng)物質(zhì)擴(kuò)散系數(shù)很低，酶活性較高時(shí)，在固定化周圍形成濃度梯度，造成微觀環(huán)境和宏觀環(huán)境間底物、產(chǎn)物濃度產(chǎn)生差別。 擴(kuò)散效應(yīng)可定量描述。 固定化酶促反應(yīng)中的過程分析.1 外部擴(kuò)散過程 當(dāng)固定化酶促反應(yīng)受外部擴(kuò)散限制時(shí)，固定化酶表面處底物濃度CSS小于主體溶液底物濃度CS，因此固定化酶促反應(yīng)速率rout小于未固定化時(shí)的酶促反應(yīng)速率ro。用外擴(kuò)散效率因子hout表示外擴(kuò)散對固定化酶促反應(yīng)的影響。記作 （283）（時(shí)，）可見，只要確定了固定化酶表面濃度CSS， 即可計(jì)算外擴(kuò)散效率因子hout。那么，固定化酶表面底物濃度CSS又

20、如何確定呢？以表面固定化酶為例。主體溶液底物濃度為CS，載體外表面底物濃度為CSS。CSSCS外擴(kuò)散速率 N=kLa(CS-CSS)，Nmax=kLaCS （2-84） 酶促反應(yīng)速率 （2-85） 達(dá)到平衡時(shí)，即 （2-86）由（286）式即可唯一確定CSS。N，rrmaxNmax0 CSS CS(CSS，rout)CSS也可用圖解法確定。rCS曲線與NCS曲線交點(diǎn)即為(CSS，rout)。NmaxN，rrmax0 CSS CS(CSS，rout) 圖2-9 圖2-10圖2-9為的情況，此時(shí)；圖2-10為的情況，此時(shí)。，稱為Da準(zhǔn)數(shù)當(dāng)時(shí)，過程為外擴(kuò)散控制。當(dāng)時(shí)，過程為反應(yīng)控制。令，（2-86）

21、式可變形為：整理，得 （287）上式表明C*為Da準(zhǔn)數(shù)的函數(shù)，即。令，（283）式可變形為 （288）（288）式表明為C*的函數(shù)，即。由此可知，Da準(zhǔn)數(shù)是決定效率因子和比濃度C*的唯一參數(shù)，因而是表征傳質(zhì)過程對反應(yīng)速率影響的基本準(zhǔn)數(shù)。Da準(zhǔn)數(shù)越小，固定化酶表面濃度越接近于主體濃度CS，越接近1。Da準(zhǔn)數(shù)越大，固定化酶表面濃度越趨近于零，越小，越趨近于零?？梢?，為提高固定化酶外擴(kuò)散效率，應(yīng)設(shè)法減小Da準(zhǔn)數(shù)。從公式可知，減小Da準(zhǔn)數(shù)的方法有兩個(gè)，一是降低固定化酶顆粒的粒徑，增大比表面積，但由于粒徑減小會(huì)伴隨壓降增加，因此應(yīng)用中綜合考慮，確定合適的粒徑；二是使固定化酶表面流體處于湍流狀態(tài)以增大。2

22、.3.2.2 內(nèi)部擴(kuò)散過程具有大量內(nèi)孔的球形固定化顆粒，其內(nèi)部是酶促反應(yīng)的主要場所，底物通過孔口向內(nèi)擴(kuò)散，達(dá)到不同深度，產(chǎn)物沿反方向從內(nèi)部向孔口擴(kuò)散。顆粒內(nèi)部各點(diǎn)處底物和產(chǎn)物濃度不同，導(dǎo)致各處的反應(yīng)速率的差異。內(nèi)擴(kuò)散效率因子hin的定義為單位時(shí)間內(nèi)顆粒內(nèi)部實(shí)際酶促反應(yīng)速率rin與按顆粒外表面底物濃度計(jì)算而得到的反應(yīng)速率ro之比。記作 (2-89) 為獲得固定化酶顆粒內(nèi)部實(shí)際反應(yīng)速率rin，就要首先確定顆粒內(nèi)部底物濃度分布。Rdrr 圖2 多孔球形固定化酶顆粒內(nèi)的物料衡算對球形固定化顆粒，半徑為R，在距中心處為r處取一厚度為dr的微元?dú)んw，在微元?dú)んw內(nèi)，底物濃度CSr，穩(wěn)定狀態(tài)下，對底物S進(jìn)行物

23、料衡算：流入量流出量反應(yīng)量 (2-90)整理，得兩側(cè)同除，得 (2-91)當(dāng)酶促反應(yīng)符合米氏方程規(guī)律時(shí)，在微元?dú)んw內(nèi) 故， (2-92)令，式中f為西勒（Thiele）準(zhǔn)數(shù)，其物理意義是表面反應(yīng)速率與內(nèi)擴(kuò)散速率之比。對各類反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與固定化酶的形狀，普遍化的f的定義式為將(2-92)式轉(zhuǎn)化為無因次形式，得 (2-93)邊界條件：， ，該微分方程無解析解，只能用數(shù)值法求解。 (2-94)引入無因次參數(shù)，則 (2-95)同樣，無解析解，只有數(shù)值解。見教材P33圖210。由圖210可知，b對hin影響不大，影響內(nèi)部傳遞效率因子的主要參數(shù)西勒準(zhǔn)數(shù)f。如果，則不隨f變化，近似等于1，也就是說沒有內(nèi)部傳質(zhì)

24、阻力，若，則，反應(yīng)為內(nèi)擴(kuò)散所限制。為提高固定化酶內(nèi)擴(kuò)散效率，應(yīng)設(shè)法減小f。減小f的措施主要是適當(dāng)降低固定化酶顆粒粒徑。下面將固定化酶外擴(kuò)散限制與內(nèi)擴(kuò)散限制進(jìn)行比較。表2-1 外擴(kuò)散過程與內(nèi)擴(kuò)散過程的比較外擴(kuò)散過程內(nèi)擴(kuò)散過程Da準(zhǔn)數(shù)是決定外擴(kuò)散效率因子的唯一參數(shù)準(zhǔn)數(shù)是決定內(nèi)擴(kuò)散效率因子的主要參數(shù)Da準(zhǔn)數(shù)定義：西勒準(zhǔn)數(shù)定義：外擴(kuò)散效率因子定義：內(nèi)擴(kuò)散效率因子定義：Da<1，過程為反應(yīng)控制，Da準(zhǔn)數(shù)越小，越接近1；Da>1，過程為外擴(kuò)散控制，Da準(zhǔn)數(shù)越大，越趨近于零。<0.3時(shí)，1，過程為反應(yīng)控制。>0.3時(shí)，<1，過程為內(nèi)擴(kuò)散控制。2.4 酶的失活動(dòng)力學(xué)2.4.1 未

25、反應(yīng)時(shí)酶的失活動(dòng)力學(xué)2.4.1.1 一步失活模型(one step model) 多數(shù)酶的失活符合一步失活模型。其反應(yīng)機(jī)制為式中，E為具有活性的酶，D為失活的酶。kd為失活反應(yīng)速率常數(shù)。建立酶失活動(dòng)力學(xué)方程： （296） 邊界條件： 積分，得 （297） 幾個(gè)概念： ：一步失活常數(shù)。：半衰期，當(dāng) ：時(shí)間常數(shù)， 三者關(guān)系：  ， （298）2.4.1.2 多步失活模型 ( multi step model ) 多步串聯(lián)失活模型：酶的失活經(jīng)歷多步，即可劃分為 同步失活模型：全部酶分子可劃分為熱穩(wěn)定性不同的若干個(gè)組分，每個(gè)組分均符合一步失活模型。對同步失活模型，全部酶中殘存活性酶的比率 （

26、299）式中，為失活速率常數(shù)為的酶組分的分率。因此，多步串聯(lián)失活模型較為復(fù)雜，這里不再詳細(xì)討論。復(fù)習(xí)題14題即為多步失活模型的一個(gè)實(shí)例。2.4.1.3 溫度對酶失活的影響 溫度對酶失活的影響體現(xiàn)在改變酶失活速率常數(shù)上。對一級失活模型，有 失活反應(yīng)Arrhenius方程 （2100）式中， 失活反應(yīng)Arrhenius方程的指前因子 失活反應(yīng)活化能一般蛋白質(zhì)的變性或失活的活化能在125kJ/mol以上，高于一般化學(xué)反應(yīng)的活化能（2083kJ/mol），這意味著酶失活對溫度十分敏感。同時(shí)考慮溫度和時(shí)間對酶失活影響的關(guān)系式 （2101） 教材中P35圖211是根據(jù)上式繪出的圖形?？梢钥闯鰰r(shí)間和溫度對酶

27、失活的雙重影響。在同一溫度下保溫時(shí)間越長，殘存酶活力越低。2.4.2 反應(yīng)中酶的熱失活動(dòng)力學(xué) 酶的穩(wěn)定性與酶的壽命直接相關(guān)，因此至關(guān)重要。酶在反應(yīng)中的穩(wěn)定性稱為操作穩(wěn)定性。酶的操作穩(wěn)定性測定方法：分批測定法、連續(xù)測定法、圓二色性分析法。不同溫度下酶促反應(yīng)過程曲線見教材36頁圖212。 一定的酶促反應(yīng)都是由正向的酶促反應(yīng)與酶的失活反應(yīng)的復(fù)合。當(dāng)時(shí)間一定，隨溫度的升高，反應(yīng)速率增大，轉(zhuǎn)化率提高，但當(dāng)溫度高于某一值時(shí)，由于酶的熱失活速率加快，當(dāng)快于酶促反應(yīng)速率上升的速度時(shí)，酶的總反應(yīng)速率下降，最終降為零。 對某一反應(yīng)時(shí)間，就有一與最高轉(zhuǎn)化率對應(yīng)的溫度，該溫度稱為最佳溫度。不同的反應(yīng)時(shí)間，有不同的最佳

28、溫度。最佳溫度是溫度對酶促反應(yīng)速率和酶失活速率雙重作用的結(jié)果。2.4.2.1 反應(yīng)中酶的失活模型 （2103） （2104） （2105）按此模型推導(dǎo)其失活動(dòng)力學(xué)方程： （2107） （2108） （2109）方程聯(lián)立求解，得 （2110）（式中，）討論：（1）d1時(shí)，1，反應(yīng)時(shí)與未反應(yīng)時(shí)酶的失活速率完全相同。從反應(yīng)機(jī)制中可以看出，d1時(shí)，復(fù)合物ES與游離酶E失活速率常數(shù)完全相同，表明底物對酶失活無影響。（2）d0時(shí)，取最小值，反應(yīng)時(shí)酶失活速率達(dá)到最低。從反應(yīng)機(jī)制中可以看出，d0時(shí)，復(fù)合物ES 完全不失活，或者說酶完全被底物所保護(hù)。（3）0<d<1時(shí)，反應(yīng)時(shí)酶失活速率低于

29、未反應(yīng)時(shí)酶失活速率。從反應(yīng)機(jī)制可以看出，0<d<1時(shí)，復(fù)合物ES失活速率常數(shù)低于游離酶E，或者說底物對酶失活有部分保護(hù)作用，能在一定程度上抑制酶的失活。（4）d>1時(shí)，反應(yīng)時(shí)酶失活速率高于未反應(yīng)時(shí)酶失活速率。從反應(yīng)機(jī)制中可以看出，d>1時(shí)，復(fù)合物ES失活速率常數(shù)大于游離酶E失活速率常數(shù)，或者說底物加速酶的失活。由上述分析可見，d反映了底物對酶失活速率的影響，因此稱d為底物對酶穩(wěn)定性影響系數(shù)。習(xí)題與答案3應(yīng)用直線作圖法（Lineweaver-Burk法；Haneswoolf法；Eadie-Hofstree法和積分法）求米氏方程中的動(dòng)力學(xué)參數(shù)KS和rmax，并比較各種方法所

30、得結(jié)果誤差大小。答：(1) Lineweaver-Burk法：米氏方程可變形為，以作圖，將得一直線，直線截距為，斜率為，據(jù)此計(jì)算。此法由于采用兩個(gè)獨(dú)立變量和，底物濃度很低時(shí)，反應(yīng)速率也很低，取倒數(shù)，誤差較大。 (2) HanesWoolf法：米氏方程可變形為，以作圖，將得一直線，直線截距為，斜率為，據(jù)此計(jì)算。此法在底物濃度很低時(shí)誤差較小。 (3) EadieHofstee法：米氏方程可變形為，以作圖，將得一直線，直線截距為，斜率為，據(jù)此計(jì)算。上述方法的共同點(diǎn)，是要從動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中獲取不同的CS值和r值。而r不能由試驗(yàn)直接取得，試驗(yàn)中能直接得到的是不同時(shí)間t時(shí)的濃度CS值（或CP值）。為此需要根據(jù)

31、速率的定義式，在CSt的關(guān)系曲線上求取相應(yīng)各點(diǎn)切線的斜率，才能確定不同時(shí)間的反應(yīng)速率r。這種求取動(dòng)力學(xué)參數(shù)的方法又稱之為微分法。顯然，用這種微分法作圖求取反應(yīng)速率會(huì)帶來較大的誤差。 (4) 積分法。米氏方程積分后可變形為以作圖，將得一直線，直線斜率為，截距為。因此直接采用動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)中測得的時(shí)間t、底物濃度CS數(shù)據(jù)作圖，即可求取動(dòng)力學(xué)參數(shù)值。6. 許多酶催化水解反應(yīng)的機(jī)制式為：，整個(gè)反應(yīng)分兩個(gè)階段進(jìn)行，采用穩(wěn)態(tài)法建立反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，均可寫成如下形式：解：酶催化水解反應(yīng)機(jī)制為 采用穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程： 解之，得式中，7有人研究了不同溫度對酶的穩(wěn)定性與酶活力的影響，得到如圖2-13所示結(jié)果?；?/p>

32、于此，他得到結(jié)論是：該酶在50°C以下是穩(wěn)定的，并且最適反應(yīng)溫度為35°C。這一結(jié)論正確與否，請說明。答：（1）酶的穩(wěn)定性受溫度和時(shí)間的雙重影響，其函數(shù)表達(dá)式為表明溫度和時(shí)間對酶穩(wěn)定性的雙重影響。在同一溫度下，不同的保溫時(shí)間殘存酶活力有極大差異。圖（a）中不同溫度下保溫10min后殘余酶活力曲線只表明，在保溫時(shí)間為10min時(shí)，酶在50°C以下是穩(wěn)定的，而并不能得出“酶在50°C以下是穩(wěn)定的”這一結(jié)論。因?yàn)椴煌谋貢r(shí)間必將對酶的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。（2）一定的酶促反應(yīng)都是由正向的酶促反應(yīng)與酶的失活反應(yīng)的復(fù)合。當(dāng)時(shí)間一定，隨溫度的升高，反應(yīng)速率增大，轉(zhuǎn)化率提

33、高，但當(dāng)溫度高于某一值時(shí)，由于酶的熱失活速率加快，當(dāng)快于酶促反應(yīng)速率上升的速度時(shí)，酶的總反應(yīng)速率下降，最終降為零。 對某一反應(yīng)時(shí)間，就有一與最高轉(zhuǎn)化率對應(yīng)的溫度，該溫度稱為最適溫度。不同的反應(yīng)時(shí)間，有不同的最適溫度。最適溫度是溫度對酶促反應(yīng)速率和酶失活速率雙重作用的結(jié)果。圖（b）只表明反應(yīng)時(shí)間為10min時(shí)，酶的最適反應(yīng)溫度為35°C。但并不能籠統(tǒng)地說酶的最適反應(yīng)溫度為35°C。因?yàn)槿绻磻?yīng)時(shí)間變化，酶的最適反應(yīng)溫度將發(fā)生變化。8一般對于同一種酶促反應(yīng)，在進(jìn)行連續(xù)反應(yīng)時(shí)的實(shí)際操作溫度比分批實(shí)驗(yàn)所求得的最適溫度要低。請從實(shí)際反應(yīng)時(shí)間較長來說明，并說明原因。答：最適溫度是溫度對

34、酶促反應(yīng)速率和酶失活速率雙重作用的結(jié)果，酶的失活又受溫度和時(shí)間的雙重影響。因此不同的反應(yīng)時(shí)間，有不同的最適溫度。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間較長時(shí)，在較低的溫度下即可達(dá)到短時(shí)反應(yīng)較高溫下所能達(dá)到的同樣的失活速率，從而引起酶最適溫度的降低。通常連續(xù)式操作比分批式操作時(shí)間長，因此，其最適反應(yīng)溫度比分批實(shí)驗(yàn)的要低。9利用穩(wěn)態(tài)法建立可逆酶促反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)方程。解：可逆酶促反應(yīng)機(jī)制為采用穩(wěn)態(tài)法推導(dǎo)動(dòng)力學(xué)方程 （1） （2） （3）解之，得 （4） 令， ， （5） 則， （6） 設(shè)平衡狀態(tài)時(shí)底物濃度為，產(chǎn)物濃度為，平衡常數(shù)為。 有 （7）達(dá)到平衡時(shí)，即0 （8）化簡，得， （9）故， （10）因反應(yīng)為單分子反應(yīng)，故 （11）令 （12）將（10）、（11）、（12）式代入（6）式，得式中： 10