【圖文】綠色熒光蛋白(GFP)技術(shù)在細(xì)胞生物學(xué)研究中的應(yīng)用

1、 10 GFP報(bào)告蛋白用于細(xì)胞活體分離與純化 n 利用細(xì)胞表面標(biāo)記，通過流體細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(FACS， 可以分離與純化特殊類型細(xì)胞，對(duì)分析cDNA文庫(kù)、研究基因的細(xì)胞發(fā)育或 組織專一性表達(dá)十分重要26,27。利用GFP融合蛋白為細(xì)胞表面活體熒光 標(biāo)記，通過篩選已經(jīng)獲得GFP表達(dá)的大腸桿菌、人體腎細(xì)胞和猿猴COS-1細(xì) 胞特殊類型。Sheen J等在GFP轉(zhuǎn)染玉米原生質(zhì)體的流體參數(shù)分析中發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)染1518小時(shí)后，對(duì)照中只有一類細(xì)胞叢，表現(xiàn)較強(qiáng)紅色熒光和微弱的綠 色熒光，并且細(xì)胞間熒光強(qiáng)度相當(dāng)一致，沒有明顯差異。而GFP轉(zhuǎn)染的原生 質(zhì)體中出現(xiàn)兩類細(xì)胞叢，第一類與對(duì)照相似，呈現(xiàn)

2、紅色熒光，約占細(xì)胞總數(shù) 66.3%；第二類細(xì)胞叢呈現(xiàn)綠色熒光，熒光強(qiáng)度是對(duì)照的74倍。因此，用流 式細(xì)胞分光光度計(jì)或熒光活化細(xì)胞篩選儀(Epics Elite, Conlter Electronics,Miami FL, USA很容易將兩類細(xì)胞分離開來(lái)。原生質(zhì)體可以來(lái) 源于不同類型的組織細(xì)胞原生質(zhì)體表達(dá)的GFP信息，即可代表某種組織的信 息。采用發(fā)育專一性啟動(dòng)子構(gòu)建GFP表達(dá)載體，可以將這些具有基因表達(dá)特 異性的細(xì)胞類型分離出來(lái)。利用不同表達(dá)文庫(kù)轉(zhuǎn)染原生質(zhì)體，通過流體參數(shù) 分析和細(xì)胞分類，可以揭示在信號(hào)傳導(dǎo)途徑中所包含的許多反方活化因子 (trans-activating fectors。GF

3、P在生物學(xué)和分子生物學(xué)研究中的利用還不 僅僅局限于上述幾個(gè)方面。隨著研究的深入開展，其廣泛利用的潛力將不斷 表現(xiàn)出來(lái)。 四、存在的問題及展望 n n GFP標(biāo)記蛋白有很明顯的優(yōu)點(diǎn)，但這項(xiàng)技術(shù)還是有很多的局限性。第一，這種方法需 要很高的空間分辨力，培養(yǎng)的細(xì)胞要稀疏而且很??；第二，定量的范圍會(huì)受到融合蛋 白表達(dá)水平和顯像分辨力的干擾；第三，因?yàn)槿诤系鞍讛U(kuò)散到膜表面需要一定的時(shí)間， 因此動(dòng)力學(xué)響應(yīng)在某些情況下可能會(huì)受到時(shí)間上的限制；第四，由GFP標(biāo)記物本身引 起的電勢(shì)干擾是很難估計(jì)的，因?yàn)閹缀鯖]有其它的方法可以用來(lái)做比較；第五，幾乎 在所有的情況下,細(xì)胞內(nèi)GFP標(biāo)記分子的表達(dá)都伴隨著一些未標(biāo)記蛋白

4、的表達(dá)。例如,組 成高爾基反面網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的膜蛋白TGN38，它的正確功能定位和動(dòng)力學(xué)過程需要在同源 系統(tǒng)中低水平的表達(dá)，而在非同源系統(tǒng)中表達(dá)或在同源系統(tǒng)中高水平表達(dá)，則會(huì)導(dǎo)致 其斷裂或被錯(cuò)誤地定位28。第六，GFP的分子量雖然不大(27kDa，但對(duì)蛋白功能 的影響比一些短的(大約10個(gè)氨基酸熒光標(biāo)記蛋白要大。最后，雖然有報(bào)道指出，熒 光只能在表達(dá)GFP的細(xì)胞中檢測(cè)到，但是也有不少人擔(dān)心GFP基因可能還不能完全準(zhǔn)確 地反映轉(zhuǎn)化情況，GFP基因的表達(dá)可能有假象存在：一方面，細(xì)胞本身存在一些可以 受光激發(fā)的物質(zhì)，能產(chǎn)生一定量熒光；另一方面，GFP基固在受體內(nèi)的表達(dá)頻率并不 高。Sheen等(1995在

5、一些被CAB GFP基因轉(zhuǎn)化的植株中檢測(cè)不到清晰的熒光信號(hào)。 Hu、Sheen、Haselof等l995年在發(fā)表的文章中也分別提到了這一現(xiàn)象，看來(lái)GFP的 應(yīng)用條件還需進(jìn)行進(jìn)一步的摸索。 GFP成像技術(shù)是生化和分子細(xì)胞生物學(xué)中飛速發(fā)展的一個(gè)工具,它已經(jīng)滲透到了分子生 物學(xué)、遺傳學(xué)、動(dòng)物學(xué)、植物學(xué)、生理學(xué)等其它許多生命科學(xué)領(lǐng)域。有了GFP，培育 出奇特的熒光動(dòng)物和熒光植物已不再是夢(mèng)想。相信隨著基因工程技術(shù)和細(xì)胞工程技術(shù) 的日益成熟，GFP一定可以為我們揭開細(xì)胞中許多迄今為止還不為人所知的秘密,掀起 一場(chǎng)生物學(xué)上的綠色革命。 n n n n n n n n n n n n n n n 14Yuk

6、IHY,Wildt S,Jolicoeur M,et al.A GFP- based screen for growth arrested, recombinant protein - producing cells J.Biotechnol Bioeng, 2002(79:74- 82. 15 Strebel A, Harr T, Bachmann F, et al. Green fluorescent protein as a novel tool to measure apoptosis and necrosis J.Cytometry, 2001( 43 : 126- 133. 16

7、Sheen J, Hwang S, Niwa Y, et al. Green fluorescenet protein as a new vital marker in plant cellsJ. The Plant Journal, 1995(8 : 777- 784. 17Ellenberg J, et al., 1999, Trends Cell Biol., 9:52-56. 18Albano CR, Lu CH, Bentley WE, et al. High throughput studies of gene expression using green fluorescent

8、proteinoxidative tress promoter probe constructs- the potential for living chipsJ. J Biomol Screening, 2001( 6 : 421- 428. 19Rigler R, et al.,1993, Eur. Biophys, 22:169一175. 20Baird G S, et al., 1999,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96:11241-11246. 21李俠、章翔,2000,癌癥,19,7:56-58. 22朱君明、唐鎮(zhèn)生、江澄川等.1999,中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜

9、志,16(2:76-78. 23Xin X, Yu YS, Tsung HC, et al.,1999,Cell Res, 9(3:201-208. 24 薛啟漢. 綠色熒光蛋白的原核表達(dá)、純化以及抗體制備J. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 1999, 15( 1 : 52- 58. 25Moore A,Marecos E, Simonova M, et al.,1998,Microvas Res.,56(3:145-153. 26Galbratith DW. F luo rescence2activated cell so rting of p ro top lasts and somatic hybrids. In: Brevis JM , ed. P lant T issue Culture M anual: Fundamentals and App lications. Do rdrech töN o rwell.MA. Kluwer A cadem ic, 1991, 1- 19 27 Galbraith DW. F low cytometry and so rting of p lant p ro top lasts and cells. In:Darzynk iew icz Z, Crissman H,