病原菌耐藥信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及多抗原肽疫苗研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì).docxVIP

1、第42卷第2期2013年浙江大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)http:http:JOURNALOFZHEJIANGUNIVERSITY(MEDICALSCIENCES)DOI：10.3785/j.issn.1008-9292.2013.02.001病原菌耐藥信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及多抗原肽疫苗研究進(jìn)展與發(fā)展趨勢(shì)孫愛(ài)華I,方佳琪2,嚴(yán)杰(1.浙江醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，浙江杭州310053；2.浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)系，浙江杭州310058)摘要細(xì)菌耐藥性是當(dāng)前人類(lèi)面臨的重大醫(yī)學(xué)問(wèn)題之一。接種疫苗是預(yù)防各種傳染病最為經(jīng)濟(jì)和有效的措施，也是預(yù)防和控制耐藥性病原菌感染相關(guān)傳染病的有效途徑。文中介紹了病原菌耐藥相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制及

2、新型多抗原肽疫苗研究進(jìn)展，并分析了其發(fā)展趨勢(shì)，以供相關(guān)領(lǐng)域研究者參考。關(guān)鍵詞大腸桿菌；沙門(mén)菌，甲型副傷寒；副結(jié)核分枝桿菌；細(xì)菌菌苗；肽類(lèi)；抗藥性，細(xì)菌;藥物耐受性；病原菌；耐藥性；疫苗中圖分類(lèi)號(hào)R378文獻(xiàn)標(biāo)志碼A文章編號(hào)1008-9292(2013)02刃12526傳染病依然是當(dāng)前威脅人類(lèi)健康和生命的主要疾病之一。例如,0139群霍亂、SARS、禽流感、豬鏈球菌病等新發(fā)傳染病(emerginginfectiousdiseases)不斷出現(xiàn),結(jié)核病、甲副傷寒、手足口病、H1N1流感等再現(xiàn)傳染病(re-emerginginfectiousdiseases)重新流行【戚。細(xì)菌性再發(fā)傳染病往往與病原

3、菌耐藥性增強(qiáng)密切相關(guān)。例如，目前我國(guó)臨床上分離的結(jié)核分枝桿菌對(duì)多種抗結(jié)核藥物的耐藥率高達(dá)50%-70%8,甲型副傷寒沙門(mén)菌對(duì)臨床常用抗生素的耐藥率高達(dá)60%以上，但其耐藥分子機(jī)制尚未完全明了。接種疫苗是預(yù)防各種傳染病最為經(jīng)濟(jì)和有效的措施，尤其在預(yù)防和控制耐藥性病原菌引起的傳染病更有實(shí)際價(jià)值。基因工程疫苗是當(dāng)前疫苗研發(fā)的主要方向，雖然存在產(chǎn)量較低及免疫保護(hù)性較弱等缺陷，但采用多抗原肽(multipleantigenicpeptide,MAP)疫苗研發(fā)策略有可能解決上述問(wèn)題。因此，作者就近年來(lái)二元信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)與病原菌耐藥性關(guān)系、MAP疫苗研究進(jìn)展及其發(fā)展趨勢(shì)進(jìn)行簡(jiǎn)要論述，供相關(guān)領(lǐng)域研究者參考。1細(xì)

4、菌耐藥相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)與調(diào)控1.1細(xì)菌耐藥主要機(jī)制目前已知細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥的主要機(jī)制是:產(chǎn)生藥物鈍化酶;抗生素受體突變而與抗生素結(jié)合(親和)能力下降;下調(diào)藥物膜通道蛋白表達(dá)或降低膜通透性,使進(jìn)入細(xì)菌的抗生素減少;通過(guò)細(xì)菌特定的分泌系統(tǒng)(藥物外排泵)將菌體內(nèi)的抗生素外排。以往對(duì)細(xì)菌耐藥機(jī)制研究大多局限于發(fā)現(xiàn)新型藥物鈍化酶、藥物膜通道蛋白和外排泵及耐藥相關(guān)抗生素受體突變新類(lèi)型。近年來(lái)，細(xì)菌信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)調(diào)控藥物鈍化酶與藥物膜通道蛋白表達(dá)、藥物外排泵活化及其在細(xì)菌耐藥性形成過(guò)程的重要作用逐漸引起了人們的關(guān)注。12細(xì)菌二元信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)任何生物必然與其生存環(huán)境發(fā)生相互聯(lián)系和影響，實(shí)現(xiàn)這種相互聯(lián)系和影響的最主要

5、方式是通過(guò)彼此之間收稿日期：2013-01-24修回日期：2013-02-18基金項(xiàng)目：浙江省H然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY12H19002)；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生科學(xué)研究基金資助項(xiàng)目(2011KYB006).作者簡(jiǎn)介:孫愛(ài)華(1968-)，女，教授，主要從事病原曲致病與耐藥機(jī)制及實(shí)驗(yàn)室診斷方法研究.通訊作者:嚴(yán)杰(1956-),男，醫(yī)學(xué)博士，教授，博導(dǎo),主要從事病原菌致病機(jī)制及基因工程疫苗研究；E-mail：med_bp的信息交換及反應(yīng)，感受和應(yīng)答外界信號(hào)物質(zhì)基礎(chǔ)是信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。與哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞比較，細(xì)菌信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)相對(duì)簡(jiǎn)單,一般由兩類(lèi)分工明確的蛋白組成，故稱(chēng)之二元信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)（two-compone

6、ntsignalingsystem,TCSS）:跨膜傳感蛋白（sensorprotein,SP）:多為具有信號(hào)分子受體功能的組氨酸激酶,少數(shù)為絲氨酸/蘇氨酸激酶；胞漿內(nèi)應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白（responseregulatorprotein,KRP），通常被跨膜傳感激酶磷酸化后激活,具有轉(zhuǎn)錄因子樣作用，通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因產(chǎn)物表達(dá)水平對(duì)環(huán)境信號(hào)進(jìn)行適應(yīng)性應(yīng)答nn。目前認(rèn)為,每種細(xì)菌至少需要數(shù)十個(gè)不同的TCSS,才能具備感受各種環(huán)境信號(hào)并進(jìn)行反應(yīng)的能力，并且在病原菌趨化、黏附與定植、分泌毒力因子、產(chǎn)生耐藥性等過(guò)程中發(fā)揮作用網(wǎng)；。13病原菌耐藥相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)及其調(diào)控作用1.3.1誘導(dǎo)藥物鈍化酶表達(dá)我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示

7、，在1/4最低抑菌濃度（MIC）的青霉素或頭胞嚏胯刺激下，大腸埃希菌&內(nèi)酰胺類(lèi)鈍化酶基因（TEM、SHV、CTX-M）表達(dá)水平迅速，且升高顯著，在1/4MIC的鏈霉素作用下，大腸埃希菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌氨基糖甘類(lèi)鈍化酶基因aac（6'）.Ib、aac（3）-U、aph（3，）和aac（6）-Ie.aph（2）.Ia表達(dá)水平也得到快速上調(diào)，但上述鈍化酶基因表達(dá)水平上調(diào)可被組氨酸激酶阻斷劑氯策碘柳胺所抑制，提示亞致死量抗生素可作為外源信號(hào)分子，通過(guò)TCSS上調(diào)藥物鈍化酶基因表達(dá)水平，從而表現(xiàn)為對(duì)抗生素的耐藥性皿。1.3.2抑制抗生素活化異煙豚和乙胺丁醇是常用抗結(jié)核藥物。

8、業(yè)已證明，異煙豚須經(jīng)結(jié)核分枝桿菌過(guò)氧化氫酶過(guò)氧化物酶氧化后才能形成具有抑制分枝菌酸合成活性的中間產(chǎn)物，結(jié)核分枝桿菌編碼過(guò)氧化氧酶-過(guò)氧化物酶的katG基因表達(dá)上調(diào)可使菌株對(duì)異煙麟高度敏感U;乙胺丁醇能選擇性地抑制結(jié)核分枝桿菌細(xì)胞壁組分阿拉伯半乳聚糖和阿拉伯甘露聚糖的合成,若編碼阿拉伯糖基轉(zhuǎn)移酶的embA/embB基因過(guò)度表達(dá)，可使結(jié)核分枝桿菌持續(xù)合成上述阿拉伯聚糖而表現(xiàn)為對(duì)乙胺丁醇的耐藥有線索顯示，結(jié)核分枝桿菌SenX3/RegX3和PknH/EmbR可能是分別調(diào)控katG和embA/embB基因的TCSS*17*191o1.3.3抑制抗生素受體表達(dá)肺炎鏈球菌臨床菌株有很高的耐藥率,但該菌不產(chǎn)

9、生內(nèi)酰胺酶】。青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）突變被認(rèn)為是肺炎鏈球菌對(duì)&內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素耐藥的重要機(jī)制，但有證據(jù)顯示,CiaH/CiaRTCSS中的CiaH失活或跨膜真核型絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）激酶StkP發(fā)生突變，細(xì)菌可產(chǎn)生與PBPs突變無(wú)關(guān)的對(duì)青霉素耐藥性2b23o我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CiaR可與PBPs編碼基因啟動(dòng)子結(jié)合并顯著下調(diào)基因表達(dá)水平，肺炎鏈球菌StkP胞外區(qū)具有PBPs功能結(jié)構(gòu)域，StkP編碼基因被敲除后,PBPs表達(dá)水平極顯著下降且對(duì)青霉素和頭抱唆腭耐藥性顯著增強(qiáng)，提示StkP可作為B-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素傳感激酶并通過(guò)CiaR調(diào)控PBPs表達(dá)，從而呈現(xiàn)為對(duì)階內(nèi)酰胺類(lèi)抗生

10、素的高耐藥性。1.3.4下調(diào)細(xì)菌膜通透性細(xì)菌對(duì)氨基糖昔類(lèi)抗生素耐藥機(jī)制依次為藥物攝取的減少、藥物主動(dòng)外排、鈍化酶作用及核糖體結(jié)合位點(diǎn)改變。PhoQ/PhoP是一種多功能的TCSS,但可下調(diào)鼠傷寒沙門(mén)菌膜通透性，減少細(xì)菌對(duì)氨基糖昔類(lèi)抗生素?cái)z取量，導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)此類(lèi)抗生素耐藥我們以往研究證實(shí)，PhoQ/PhoP介導(dǎo)了銅綠假單胞菌對(duì)氨基糖甘類(lèi)抗生素的耐藥性.敲除組氨酸激酶PhoQ編碼基因可使細(xì)菌對(duì)氨基糖甘類(lèi)抗生素鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星和妥布霉素的敏感性提高5122048倍，其機(jī)制與該TCSS下調(diào)氨基糖昔類(lèi)抗生素膜通道蛋白OprH表達(dá)水平有直接關(guān)系曰。135促進(jìn)藥物外排細(xì)菌1型分泌系統(tǒng)（T1SS）是由

11、三種蛋白亞單位組成的輸出復(fù)合物:結(jié)合于內(nèi)膜的ATP結(jié)合裝置（ABC）、在外膜中形成通道的外膜蛋白（OMP）、位于周漿間隙連接ABC和通道0MP的蛋白（MFP）。除分泌溶血素等細(xì)菌毒性蛋白外，進(jìn)入菌體的多種抗菌藥物主要通過(guò)T1SS外排。有研究顯示，大腸埃希菌EvgA/EvgSTCSS可調(diào)控膜通道OMP和MFP表達(dá)并激活A(yù)BC,從而促進(jìn)抗菌藥物外排,其分子作用機(jī)制尚有待于進(jìn)一步證實(shí)叫。.、.2疫苗研究現(xiàn)狀與多抗原肽疫苗2.1疫苗種類(lèi)及其優(yōu)缺點(diǎn)目前實(shí)際使用的疫苗有全菌死疫苗、減毒活疫苗、組分疫苗(如莢膜多糖)和基因工程疫苗。全菌死疫苗安全性好，但免疫保護(hù)性較弱、毒副作用較大;減毒活疫苗免疫效果雖好，

12、但毒副作用較大且存在生物安全問(wèn)題;組分疫苗安全有效，但不是所有病原菌均可產(chǎn)生能用于制備組分疫苗的抗原C目前的基因工程疫苗主要是以單一重組蛋白為抗原的疫苗，抗原成分明確且無(wú)明顯的毒副作用，但免疫效果不甚理想。病毒表面蛋白抗原種類(lèi)很少,故單一重組蛋白為抗原的基因工程疫苗預(yù)防病毒感染效果較好(如乙型肝炎表面抗原HBsAg疫苗)。細(xì)菌抗原構(gòu)造復(fù)雜多樣，往往需要多靶點(diǎn)攻擊才能奏效,故單一抗原的基因工程疫苗預(yù)防細(xì)菌感染效果較差。采用多種細(xì)菌蛋白抗原的多價(jià)基因工程疫苗是提高免疫效果的有效途徑,但各基因獨(dú)立表達(dá)無(wú)疑將使疫苗成本成倍增加。用柔性肽作為連接序列，可構(gòu)建含多個(gè)抗原編碼基因的人工融合基因，但目前的原核

13、表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)大片段基因的效率低下。2.2病原菌血清群型與多價(jià)疫苗幾乎所有病原菌均存在抗原性并有一定差異的血清群或血清型。為了有效預(yù)防某種病原菌感染，往往根據(jù)當(dāng)?shù)貎?yōu)勢(shì)流行的血清群或血清型來(lái)制備多價(jià)疫苗。例如，我國(guó)目前使用的鉤端螺旋體疫苗即為57個(gè)血清群組成的多價(jià)全菌死疫苗3】。然而，不同血清群或血清型的病原菌往往存在共同的蛋白抗原，因此叮用于制備通用性基因工程疫苗功。2.3疫苗增強(qiáng)性疾病一些病原微生物疫苗接種后再感染相應(yīng)病原微生物時(shí)，其致病作用明顯增強(qiáng)的現(xiàn)象稱(chēng)為疫苗增強(qiáng)性疾病(Vaccineenhanceddisease,VED)oVED雖非普遍現(xiàn)象,但仍可見(jiàn)于不少病原微生物疫苗中，如人呼吸道合

14、胞病毒、SARS冠狀病毒、肺炎支原體、沙眼衣原體死疫苗或亞單位疫苗。究其原因，是這些病原微生物致病主要機(jī)制為引發(fā)病理性免疫反應(yīng)，疫苗接種使機(jī)體處于致敏狀態(tài),感染相應(yīng)病原微生物后引發(fā)病理性超敏反應(yīng)而使疾病明顯加重。G蛋白、S蛋白、主要外膜蛋白(MOMP)和熱休克蛋白60(HSP60)分別是呼吸道合胞病毒、SARS冠狀病毒、肺炎支原體和沙眼衣原體引起VED的主要因子3小。因此,VED是此類(lèi)病原微生物至今尚無(wú)疫苗的主要原因。24MAP疫苗定義與特點(diǎn)病原微生物蛋白抗原分了中抗原表位(antigenicepitope)與高分子核心載體人工交聯(lián)的多價(jià)組合式疫苗稱(chēng)為MAP疫苗。該疫苗具有能同時(shí)提呈多種多個(gè)抗

15、原表位、抗原提呈作用強(qiáng)、可通過(guò)各抗原肽分枝之間相苴作用以非共價(jià)結(jié)合形成構(gòu)成表位(conformationalepitopes)而提高免疫效果、個(gè)別氨基酸突變不影響抗原提呈及后繼免疫反應(yīng)、不同表位可組合式裝配等特點(diǎn)，因此成為當(dāng)前新型疫苗研發(fā)前沿。2.4.1抗原表位是抗原分子中能誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答的短肽片段，與抗原決定簇(antigendeterininant)的含義基本相似，但抗原表位一般含有與MHC分子和B細(xì)胞表位結(jié)合位點(diǎn)?？乖砦豢煞譃門(mén)細(xì)胞和B細(xì)胞表位，分別引發(fā)細(xì)胞和體液免疫應(yīng)答。在實(shí)際研究中，通常先采用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)蛋白抗原分子中的B細(xì)胞表位(hltp：/mobyle.pasteur.

16、fr/cgi-bin/portal,bp?#forms:antigenic)和T細(xì)胞表位(http：/www.syfpeithi.de/Scripts/MHCServer.dl1/EpitopePrediclion.htm)，此類(lèi)表位稱(chēng)為預(yù)測(cè)表位，其功能有待于實(shí)驗(yàn)證明。盡管預(yù)防性疫苗主要是通過(guò)誘生抗體達(dá)到保護(hù)作用，但T表位可激活T細(xì)胞應(yīng)答而有利于提高抗體水平，故目前傾向于采用T和B聯(lián)合表位(TB)肽制備MAP疫苗切。通常采用噬菌體展示系統(tǒng)表達(dá)含T-B聯(lián)合預(yù)測(cè)表位的重組PIII蛋白，然后采用該蛋白抗原重組表達(dá)產(chǎn)物及全菌抗血清進(jìn)行WesternBlot反應(yīng)，根據(jù)雜交信號(hào)有無(wú)或強(qiáng)弱,分為無(wú)效表位、有

17、效表位和優(yōu)勢(shì)表位。優(yōu)勢(shì)表位體現(xiàn)該蛋白分子主要抗原性，可用于制備MAP疫苗*氣2.4.2核心載體為人工合成的寡聚或多聚高分子抗原表位肽通過(guò)分子交聯(lián)法連接于核心載體'，形成以核心載體為中心、外展多種抗原表位樹(shù)狀臂(dendriticarms)的交聯(lián)體，也即MAP疫苗?？乖砦慌c核心載體交聯(lián)后成為完全抗原，其免疫原性顯著增強(qiáng)。核心載體需具備如下基本條件:無(wú)毒性;有較多表面基團(tuán)用于交聯(lián)抗原表位肽;分子大小可控;能生物降解，2.5MAP疫苗應(yīng)用前景上述MAP疫苗的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn),決定了該疫苗有廣泛的應(yīng)用前景。2.5.1克服現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)效率的限制以300個(gè)氨基酸組成的抗原分子為例，一個(gè)T-B聯(lián)合抗原表

18、位（通常為30個(gè)氨基酸的短肽）若有完整抗原分子50%免疫原性,10個(gè)表位效果相當(dāng)于完整分子5倍,但長(zhǎng)度相似。因此，可利用基因工程技術(shù)構(gòu)建含特定蛋白酶（如腸激酶）酶切位點(diǎn)的重復(fù)串聯(lián)T-B聯(lián)合抗原表位序列，然后再經(jīng)過(guò)常規(guī)重組表達(dá)、通過(guò)蛋白酶酶切及分離獲得大址目的表位，從而克服現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)效率的限制而提高產(chǎn)量。2.5.2制備有VED現(xiàn)象的病原微生物疫苗業(yè)已發(fā)現(xiàn)，同一蛋白抗原中可分別存在誘導(dǎo)正?？垢腥久庖吡虿±硇悦庖邞?yīng)答的不同抗原表位，通過(guò)抗原表位篩選和免疫學(xué)鑒定，可分辨誘導(dǎo)正?？垢腥久庖邞?yīng)答或病理性免疫應(yīng)答的抗原表位例如，沙眼衣原體誘導(dǎo)的Thl型細(xì)胞免疫應(yīng)答有免疫保護(hù)作用，Th2型細(xì)胞因于IL-1

19、0則介導(dǎo)病理性免疫反應(yīng)。因此，首先確定有VED現(xiàn)象的病原微生物主要蛋白抗原,從中篩選出能誘導(dǎo)正?？垢腥久庖吡Φ目乖砦?，然后制備MAP疫苗。2.5.3制備通用性病原菌基因工程疫苗如前所述，細(xì)菌是原核細(xì)胞,抗原構(gòu)造復(fù)雜多樣，多價(jià)基因工程疫苗才能有較好的免疫保護(hù)效果盡管病原菌常有不同血清群或血清型，但往往存在數(shù)種共同蛋白抗原】。因此為了提高基因工程疫苗效果、避免多次表達(dá)而降低生產(chǎn)成本，采用MAP疫苗研發(fā)策略是制備通用性病原菌基因工程疫苗的有效途徑。3展望耐藥性是一些細(xì)菌感染性疾病再次流行的主要原因，接種疫苗是預(yù)防傳染病最有效的措施。因此深入探討細(xì)菌耐藥新機(jī)制、研發(fā)更為有效的細(xì)菌新型疫苗具有重要醫(yī)學(xué)

20、意義。感染是病原微生物與宿主相互作用過(guò)程，這個(gè)觀念已被普遍接受，但耐藥也是細(xì)菌針對(duì)環(huán)境中抗生素殺菌或抑菌作用的反應(yīng)性抵抗行為。因此，闡明細(xì)菌感受抗生素分子信號(hào)的受體、抗生素信號(hào)菌體內(nèi)傳遞途徑、調(diào)控耐藥相關(guān)基因(藥物鈍化酶、抗生素受體、藥物活化酶、藥物膜通道蛋白及外排系統(tǒng))表達(dá)的應(yīng)答調(diào)節(jié)蛋白(RRP)及其工作機(jī)制，將是今后細(xì)菌耐藥性研究的新領(lǐng)域，其研究成果將為研發(fā)以干擾細(xì)菌耐藥相關(guān)信號(hào)通路為原理的新型抗耐藥細(xì)菌藥物提供科學(xué)依據(jù)。同時(shí)，適用范圍廣、高效無(wú)毒、多價(jià)組合式新型病原菌基因工程疫苗也將是今后疫苗研發(fā)的主攻方向，這不僅需要研發(fā)出更為便利高效的基因表達(dá)新系統(tǒng)及相關(guān)生物工程新技術(shù)，同時(shí)也要求人們

21、對(duì)病原菌對(duì)抗宿主免疫力機(jī)制以及宿主抗感染免疫機(jī)制本質(zhì)有更為深入的認(rèn)識(shí)與了解。References:1 SHAKHNOVICHEA,STURTEVANTI),MEKALANOSJJ.Molecularmechanismsofvirstatinresistancebynon-Ol/non-0139strainsofVibriocholeraeJ.MolMicrobiol,2007,66(6):1331-1341.2 KANB,WANGM,JINGH；etal.Molecularevolutionanalysisandgeographicinvestigationofsevereacuterespi

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