百日咳鮑特菌脂寡糖的制備及寡糖結(jié)合物在小鼠體內(nèi)免疫原性研究.docx

1、.論著.百日咳鮑特菌脂寡糖的制備及寡糖結(jié)合物在小鼠體內(nèi)免疫原性研究李鑫，高晶晶，羅樹權(quán)，李燕婷，喬瑞潔，劉方蕾，謝貴林蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室甘肅省疫苗工程技術(shù)研究中心，11.甫蘭州730046摘要：目的提取純化百日咳鮑特菌(簡稱百日咳桿菌)脂真糖(lipo-oligosaccharides,LOS),制備百日咳桿菌多糖蛋白結(jié)合物，并分析其理化性質(zhì)及免疫原性。方法通過改良熱酚水法提取百日咳桿菌的LOS,采用曲解法純化LOS,通過1%冰醋酸水解獲得寡(oligosaccharides,OS),產(chǎn)物經(jīng)Tricine-SDS-PA(；E及核磁共振級i普(HNMR)鑒定。OS的羥基經(jīng)1

2、-氤基4二甲氛基n比嚏四氯硼酸酯(1-cyano-4-(limethylaminopyridiniumtetrafluoroljorate,CDAP)活化后，與破傷風(fēng)類毒素己二酸酰麟衍生物(1TAI1)共價(jià)結(jié)合,制備多糖蛋白結(jié)合物.經(jīng)SephacrylS-300層析柱純化后收集結(jié)合物原液.并對結(jié)合物的理化性質(zhì)、抗原性進(jìn)行分析，采用兩種劑量(2.5pig/劑和5.0ng/劑)免疫BALB/c小鼠，分析其免疫原性。結(jié)果純化后LOS純度>90%,核磁共振結(jié)果表明OS結(jié)構(gòu)正確,功能基團(tuán)得到保留。制備的結(jié)合物抗原性未發(fā)生改變，經(jīng)3針免疫后，兩種劑量下結(jié)合物均有劑次加強(qiáng)效應(yīng)(P<0.05),旦

3、兩者差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論將百日咳桿菌OS與TIh結(jié)合是制備百門咳桿菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的可行途徑，并旦結(jié)合物在小鼠體內(nèi)其有良好的免疫應(yīng)答。關(guān)鍵詞:百日咳鮑待菌;脂寡糖;結(jié)合物;免疫原性中圖分類號：R37842文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號：1005-5673(2018)05-0021-07DOI：10.133O9/ki.Pmi.2O18.O5.OO4Preparationoflipo-oligosaccharidesfromBordetellapertussisandinvestigationofrelatedconjugateimmunogenicityinmiceLIXin,

4、GAOJing-jingtLUOShu-quan,LIYan-ting,QIAORui-jie,UUFang-lei,XIEGui-linTheb'irstResearchDepartment,LanzhouInstiluleofBiologicalProductsCo.Jid.,CenterforG<insuProvincialVaccineEngineeringResearch,Lanzhou730046,(kinsuProvince,ChinaCorrespondingauthor：XIEGui-lintE-mail:glxieAbstract:ObjectiveTopur

5、ifylipo-oligosaccharides(LOS)fromBordetellatertussisandpreparationoftherelatedconjugates,andtoinvestigatethephysicalandchemicalpropertiesandimmunogenicityoftheconjugatesinmice.MethodsThelipo-oligosaccharideswereextractedfromBordetellapertussiswithmodifiedhotphenolwatermethod,andpurifiedbyenzymatichy

6、drolysis,oligosaccharide(O-SP)wasobtainedby1%glacialaceticacidhydrolysis,andtheproductwasidentifiedbyTricine-SDS-PAGEandNMR(1HNMR).Thehydroxy)ofhydrolysatewasactivatedby1-Cyano-4-dimclhylaminopyridiniumtetrafluoroborate(CDAP)andthencombinedwithTPAI)inpreparationoftheconjugate.Theconjugateswerepurifi

7、edbySephacrylS-300chromatography.Thephysicalandchemicalcharacteristicsandantigenicityoftheconjugatewereanalyzed.Balb/Cmicewereimmunizedwithtwodoses(2.5pig/dogeand5p.g/doge)oftheconjugatesandtheimmunogenicitywasanalyzed.ResultsThepurityofoligosaccharideswasmorethan90%.TheNMRresultsshowedthatthestruct

8、ureofoligosaccharideswascorrectandfunctionalgroupswereretained.Theantigenicityofthepreparedconjugatesdidnotchange.Therewereboostresponsesbythethreeconjugateimmunizationswithtwodoses(P<0.05),andtherewasnoastatisticaldifferencel)etweenthetwodoses.ConclusionItwasafeasiblewayinpreparationofconjugatev

9、accineagainstBordetellapertussisinfectionbycovalentlinkagebetweenLOSandcarrierproteinsofTTH.andthepreparedconjugatescouldgeneratehighlyimmuneresponsesinmice.Keywords：Bordetellapertussis;Lipo-oligosaccharides(LOS);Conjugate;Immunogenicity作者簡介：李燕(1992-),男，碩士研究生，主要從事細(xì)通性疫百日咳(pertussis)是一種由百日咳鮑特菌(Bor-苗研究

10、。detellaPer岫is,簡稱百日咳桿菌)引起的急性呼吸通信作者：謝資林，研究員，E-mail:«lxie道傳染病，百日咳桿菌以人為唯一天然宿主，雖然有良好的疫苗接種覆蓋率，但每年仍有5000萬例患者并導(dǎo)致約30萬例患者死亡,90%的病例發(fā)生于發(fā)展中國家。目前，有兩種百日咳疫苗，一種為全細(xì)胞白日咳疫苗(wholecellpertuussisvaccine,wP)，另-種為無細(xì)胞百日咳疫苗(acellularpertussisvaccine,aP)owP從20世紀(jì)40年代就開始使用,有效降低了百日咳的發(fā)病率和死亡率，但該疫苗副反應(yīng)發(fā)生率高，且癥狀嚴(yán)重。經(jīng)過數(shù)十年的努力，一種更安全的

11、aP被研制出來，并從20世紀(jì)90年代逐步替代wP。但近年來，在疫苗接種覆蓋率很高的地區(qū)，百日咳疾病出現(xiàn)了明顯的反彈。2010年美國加州的百日咳病例超過9000例,創(chuàng)其近60年的峰值。2012年英國百日咳的死亡率達(dá)到自1984年來的最高位知。WARFEL等在狒狒模型中證明,aP雖然可以對鮑特菌感染提供保護(hù)，但不能完全阻止其傳播，且aP預(yù)防感染的效果明顯不如wPo百日咳疾病的復(fù)燃需要重新去認(rèn)識百日咳疫苗，其中，添加可誘導(dǎo)殺菌活性的抗原也不失為一種可行的思路，針對細(xì)菌扯外層多糖抗原的抗體都具有殺菌活性儉o百日咳桿菌的外圍多糖是脂寡M(lipo-oligosaccharides,LOS)0相對于脂多W

12、(lipopolysaccharide,LPS)的多檀重復(fù)結(jié)構(gòu)，LOS只有與核心賓oligosaccharides,OS)相連的末端三糖，故JE相對分子質(zhì)量更小。百日咳桿菌LOS的末端多糖是一種非重復(fù)的三糖結(jié)構(gòu)，分別為a-N-乙酰氛基葡萄糖J3-2-乙?；?3-乙酰氨基-2,3-雙脫氧-甘露糖酵酸和F-2.乙酰氨基-4-甲基基-海藻糖，見圖1。由于LOS抗原屬于胸腺非依賴型抗原，其免疫原性弱造成抗體持續(xù)時(shí)間短，一般不能誘導(dǎo)免疫記憶炒此。所以本研究將百日咳桿曲OS與破傷風(fēng)類毒素衍生物(tetanustoxoidderivatives,TTAII)結(jié)合,制備成百日咳桿菌多糖蛋白結(jié)合物，并對其結(jié)合

13、工藝及免疫原性進(jìn)行研究。a-GIcNI7a-GleA-2-a-HeplP13(«-GlcNAcl-/?-ManNAc3NAcA-3-/?-FucNAc4NMe)K-(>-aGlcNl-/-Glc-4-a-Hep-5-a-Kdo-lP-2-(>-LipidA|4ma-Hpea-GalNA圖1百日咳桿菌LOS的結(jié)構(gòu)Fig.lStructureofpertussislipo-oligosaccharides1材料與方法1.1藺種百日咳桿菌58031株由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司第一研究室提供。1.2載體及超免血清1將、白日咳桿前家兔免疫血清、破傷風(fēng)類毒素小鼠免疫血清均由蘭州

14、生物制品研究所有限責(zé)任公司提供。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級BALB/c雌性小鼠，體重1214g,由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供。14主要試劑及儀器氫氧化鈉、冰醋酸、氯化鈉、硫酸、氯化鈣和醋酸鈉均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性磷酸前標(biāo)記羊抗鼠1如購自Soulhembiotech公司；己二酸二酰麟(ADH)、1.氤基4二甲胺基毗隴四瓶硼酸鹽(1-cyano-4-dimethylaminopyridiniumtetrafluoroborate,CDAP)、三乙胺(TEA)、脫氧膽酸鈉(DOC)、乙睛、苯酚、DNaseI、RNaseA和ProteinaseK均購自Sigma公司。Sep

15、hacrylS-300層析柱、凝膠層析系統(tǒng)均購自GE公司；Bio-gelP-4層析柱購自美國Bio-Rad公司;600MHz核磁共振譜儀購自Broker公司;SpectraMAX190酶標(biāo)儀、96孔酶標(biāo)板均購自Costar公司；透析袋購自Millipore公司。1.5 OS的制備及鑒定LOS的提取及純化稱取200g菌體，采用改良熱酚水法提取LOS,通過酶解法純化提取物。將粗制LOS用200mL2mmol/LMgSO4-50mmol/LTris(pH7.6)緩沖液溶解后裝入透析袋，加入DNaseI300mg%RNaseA150mg,37弋?dāng)嚢柰肝?8h。加入ProteinaseK200mg,37

16、T攪拌透析1214ho將透析物移入28用無熱原蒸憎水?dāng)嚢柰肝?d以上，每天換水兩次。以離心半徑8cm,8000r/min4Y離心40min,棄沉淀，收集上清。上清凍干后得精制LOS.-20Y凍存待用。以wrry法測定蛋白含址，全波長掃描測定核酸含最，用Tricine-SDS-PAGE電泳分析純度，用免疫雙擴(kuò)散法測定抗原性。1.5.1 LOS水解制備OS將粘制LOS用注射用水溶解成10mg/mL,加入冰醋酸至終質(zhì)堡分?jǐn)?shù)為1%,100%：油浴90min,將pH調(diào)整至7.0左右終止反應(yīng)。以離心半徑8cm,35000r/min,4丁超速離心4h,取上清，上清凍干。用毗噬：醋酸：水緩沖液（體積比為4：8

17、：988,pH4.7）將凍干物溶解成20mg/m"使用Bio-gelP-4層析柱，緩沖液同為毗隴醋酸溶液，流速1mVmin,將第一峰合并裝入透析袋，用注射用水48幻透析2d,每12h換水1次。凍干后稱重，于-20無保存。1.5.2 OS的結(jié)構(gòu)分析通過核磁共振分析組譜'HNMR分析OS的結(jié)構(gòu)。1.6 結(jié)合物的制備將OS用0.85%NaCl溶解成20mg/mL,室溫靜置過夜。測初始pH,室0.1mol/LNaOH溶液調(diào)整pH至5.86.2。CDAP以100mg/mL溶于乙脂中,向溶液中加入OS一半質(zhì)量的CDAP,維持pH5.8-6.0反應(yīng)30s,用TEA溶液將pH維持在7.3,反

18、應(yīng)2min。加入TT.m,維持pH7.88.2之間反應(yīng)2婚反應(yīng)液裝入MWCO10000透析袋，用0.85%NaCl溶液透析2d。間隔8h置換透析液1次。將透析后的反應(yīng)液經(jīng)0.2pirn濾器過濾后，用SephacrylS-300層析柱純化，收集、W0.25的洗脫液,流動(dòng)相為0.2mol/LNaCl溶液。將收集的洗脫液經(jīng)0.22jim膜除幽過濾，收集濾過液，即結(jié)合物。1.7結(jié)合物檢測1.7.1結(jié)合物的理化性質(zhì)多糖采用苯酚-硫酸法測定，蛋白質(zhì)采用Lowry法測定。取1ml,結(jié)合物原液，加入1%脫氧膽酸鈉（pH7.3）100pL,充分混勻,4勾放置30min,加入50皿的1mol/LHC1,以離心半徑

19、8cm,12000r/min離心30min,緩慢吸取上清1mL0測定上清中多糖含房，換算游離多糖含量。1.7.2結(jié)合物鑒別試驗(yàn)采用瓊脂糖免疫雙擴(kuò)散法對結(jié)合物進(jìn)行鑒別試驗(yàn)，方法參照中華人民共和國藥典2015版（三部）“免疫雙擴(kuò)散法”執(zhí)行。1.7.3抗原性檢測采用抑制EL1SA對OS和結(jié)合物的抗原性變化進(jìn)行檢測。百日咳桿菌LOS以10pg/mL包被于Costar酶標(biāo)板，每孔100|xL,4氣:放置過夜;將不同質(zhì)最濃度的待測樣品溶液（OS或結(jié)合物）60nL加入60nL稀釋后的兔抗全菌體超免血清中，每個(gè)樣品濃度平行兩孔,充分混合形成抗原-抗血清混合液，室溫放置30min后，100頭1/孔加入酶標(biāo)板,3

20、7丁孵育2h；洗板5次,拍干；100|iL/孔加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG酶標(biāo)二抗,37丁孵育2h；洗板5次，拍干；在酶標(biāo)板中?？准尤?00堿性磷酸醐底物,37弋放置1h；讀取AnmO以未吸附的超免血清為陽性對照，未加血清的Ifll清稀釋液為陰性對照，吸附的血清為樣品，陽性孔的4值應(yīng)在1.52.0之間，按如下公式計(jì)算抑制率:抑制率=1-（孔性-4怵/偵性-4陰性）乂100%,將多糖濃度和相應(yīng)濃度下的抑制率輸入Graph-Padprism軟件，繪制抑制曲線。1.8結(jié)合物免疫原性1.8.1免疫接種及采血將小鼠隨機(jī)分為3組（OS組、結(jié)合物組一、結(jié)合物組二），每組20只，免疫劑量分別為2.5、2.

21、5、5.0jig/只,于0、14、28d經(jīng)腹股溝皮下注射0.1mL。注射后28d、42d小鼠眼球采血.分離血清。1.8.2抗體水平檢測用間接ELISA測定血清抗LOSIgG含量。百咳桿菌LOS以10|ig/mL包被于96孔槌標(biāo)板，100閆/孔,4乞放置過夜；洗板5次,拍干；血清稀釋（第2針血清200倍稀釋，第3針血清500倍稀釋，陰性血清20倍稀釋。小鼠ELISA參比血清500倍稀釋備用）。向第-排每孔中加入200|iL血清后，依次2倍系列稀釋,37Y放宜2h,洗板5次;每孔加入100jiL堿性磷酸前標(biāo)記羊抗鼠lgG37Y孵育2h,洗板5次;在酶標(biāo)板中每孔加入100piL堿性磷酸酶底物，37龍

22、放置1h；讀取力蜘5。采用Softmax軟件分析中提供的四參數(shù)擬合法分析數(shù)據(jù)，陽性血清ELISA單位為100EU/mL,應(yīng)用分析模板對各樣品的IgG含量:進(jìn)行計(jì)算。1.8.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)汁學(xué)分析，免疫原性的比較采用單因素方差分析，以尹0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果OS的制備及婆定2.1.1 LOS的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果百日咳桿菌LOS的Tricine-SDS-PAGE結(jié)果顯示有2個(gè)條帶，遷移慢（BandA）的是完整的LOS,含有類脂A、核心OS和末端三糖;遷移快（BandB）的僅含有類脂A和核心OS。經(jīng)過酶解處理后LOS（泳道2）純度大于90%,

23、未出現(xiàn)雜蛋門條帶，相對分子質(zhì)量在4000左右，見圖2。注:泳道I.出時(shí)低分fMiMarler；泳道2.U>S圖2百日咳Hl%LOS的Tricine-SDS-PAGE銀染圖注:中間孔.輸耗的4日北肝倘免疫it清；孔I.U>SJL2.OS圖3U)S及OS瓊脂物免疫雙擴(kuò)散Fig.3Testli|x>-olig<>siiri-l)ari(leand<>lig<»«i<-<-hari<l«*l>agan»wdoulilciiiiiimiKKlifTiisionFig.2llicsilivrrs

24、tuiningofR./M-rtuxsisIX）Sl）yTricine-SDS-PAGE2.1.2 LOS及OS的抗原性LOS.OS與兔抗百日咳桿菌全弟體超免血清在瓊脂糖免疫雙擴(kuò)散圖上均呈現(xiàn)清晰光滑的免疫沉淀線,提示兩者抗原性良好,見圖3。2.1.3核酸及蛋白含ht結(jié)果經(jīng)過水解后,OS中的核酸和蛋白含址有進(jìn)一步的降低,最終得到的OS核酸質(zhì)辱分?jǐn)?shù)為2.55%,蛋白質(zhì)址分?jǐn)?shù)為1.09%,見表I。2.1.4OS的結(jié)構(gòu)百日咳桿菌OS的600MHz核磁共振波譜II化學(xué)位移圖顯示，在，HNMR中4.7ppm（注：1ppm=I.OxlO-6）處的12個(gè)吸收峰是表1LOS及OS的化學(xué)特性Tab.l(Hirmi

25、calpnqxTtifsoflijxiH也.zm寸hwideandoligosa<*chari(l<*樣品核酸質(zhì)ht分?jǐn)?shù)（%）蜀白質(zhì)量分?jǐn)?shù)（）LOS5.911.75OS2.551.09各個(gè)單糖的端基質(zhì)子知；3.04.4ppm的吸收峰是環(huán)質(zhì)子的吸收峰；2.88ppm的單峰是FucNMr的甲基峰；2.06、2.03、1.99、1.89ppm分別是EucNAc、（；kNAc.Man2NAc和Man3NAc的甲基峰；1.46ppm是Fuc的甲基峰，見圖4,上述結(jié)果與文獻(xiàn)11報(bào)道的百日咳OS600MHz*HNMR圖譜的結(jié)果一致5.55.01.54.03.53.()2.52.01.51.00.

26、50ppm注：I|>|H1I=I.Ox106圖4OS600MHz(HNMR圖譜Fig.4600MHz1HNMRspectrumofoligosaccharide2.2結(jié)合物的檢測結(jié)合物經(jīng)SephacnlS-300純化后的化學(xué)分布,221結(jié)合物的理化性質(zhì)游離多糖質(zhì)ht分?jǐn)?shù)為收集A=0.25之前的部分，【叫收率為27.35%.井II.().45%,多糖蛋|'|質(zhì)M分?jǐn)?shù)比為0.75,見&2叮與游離多糖有效分離，見圖5衰2百H咳桿萌LOS結(jié)合物的基本待性Tab.2Priinan<-haraclfrisli<-sofconjugaks多慵質(zhì)砒濃度(jig/ml.)蛋門質(zhì)

27、ht分?jǐn)?shù)(Jig/nil.)源離多糖質(zhì)ht分?jǐn)?shù)(%)多糖/蛋門位結(jié)介率(%)呵收率(W)165.76221.010.45().7565.1727.35圖5結(jié)合物純化層析圖譜Fig.5Chnimalographicprofileof(*onjugaltkspuriGcalion注:i.站合物;2.綸抗全ar體血清;3.抗it血清圖6結(jié)合物的瓊脂糖免疫艱擴(kuò)散Fig.6DelrftionconjugatesbyAgarosedoubleimmuncMliffusionOS成帝衣度(pg/mL)圖7百日咳桿菌LOS和結(jié)合物的抑制ELISA曲線Fig.7Inhibition-ELISAcurveofli

28、|M>|M>lysa<-chari(lt*aiulconjugatefrom".pertussis2.2.3抑制ELISA分析抗原性百日咳桿菌OS與2.2.2結(jié)合物招別試瀚結(jié)合物與綸抗百日咳桿前全前體超免血清及兔抗'IT超免血清均可形成明顯的免疫沉淀線，且兩條沉淀線可融合在一起.證明結(jié)合物是由I'iII咳桿菌QS與TT共價(jià)結(jié)合形成的.見圖6。結(jié)合物的抑制曲線兒乎-完全而合.抑制率達(dá)到5()口時(shí)所需抗原濃度沒有明顯變化.表明結(jié)合物保留LOS的抗原性。百日咳桿菌LOS抗原對百日咳桿菌陽性血清的抑制率可以達(dá)到100%,而相同濃度下，載體蛋白TPw對陽性血清

29、的抑制率為0,表明椅測方法特異性良好，見圖72.3免疫原性小鼠血清抗LOSIgG含量結(jié)果顯示,LOS組與結(jié)合物組免疫后各針次間的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。兩種劑量下，免疫應(yīng)答均有明顯的針次加強(qiáng)效應(yīng)；與第2針相比，第3針免疫后血清抗LOSIgC含量明顯增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)o結(jié)合物二組誘導(dǎo)產(chǎn)生抗體的能力略高于結(jié)合物一組，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,結(jié)合物二組第3針免后血清中抗LOSIgG含量與結(jié)合物一組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=1.00.P>0.05)。LOS與結(jié)合物免疫小鼠后誘導(dǎo)的血清抗LOSIgG含量，見表3。表3LOS與結(jié)合物免疫小鼠后誘導(dǎo)的血清抗LOSIg

30、G含址Tab.3Thecontentofanti-LOSIgGinmiceserumsinducedbyLOSandconjugateimmunizations組別抗原抗LOSIgG含量第2針免后14d(28d)第3針免后14d(42d)結(jié)合物一組OS-TTU113.15(5.03,34.34)236.53(157.06,388.18)結(jié)合物二組OS-TTU127.02(15.28,75.04)288.47(213.19,390.38)OS組OS2.87(1.33,6.18)6.12(3.73,10.03)注：()為95%可信K間。3討論由f針對細(xì)菌最外層多糖抗原的抗體都具有殺菌活性，因此.多

31、糖抗原一般都是細(xì)菌疫苗研制的目標(biāo)抗原，所以研究建立了百日咳桿菌LOS的提取純化方法。通過改良熱酚水法提取LOS1,2,由于核酸含量:較高，通過酶解法去除核酸，在提取LOS過程中會(huì)加入醋酸鈉、氯化鈣、乙醇等溶液，這些物質(zhì)對多糖化學(xué)檢測和結(jié)合都有一定的影響，因此要通過透析除去里面含有的小分子雜質(zhì)，經(jīng)過純化最終得到的OS核酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)及蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)均低f3%。具有兩親性質(zhì)的LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞外膜的改要組成成分，而百日咳桿菌細(xì)胞壁外膜的組成成分為LOS'e,與其他革蘭陰性細(xì)菌相比，百日咳桿菌最外層糖鏈較短，僅由三個(gè)單糖組成，因此相對分子質(zhì)最較小，所以不會(huì)像其他細(xì)菌LPS一樣在SDS-PAGE

32、上出現(xiàn)梯狀條帶，而是在電泳圖譜中顯示有兩條條帶3叫.遷移慢的是完整的LOS,含有類脂A、核心OS和末端三糖,遷移快的僅含有類脂A和核心OS。類脂A為LOS的毒性中心，對于內(nèi)毒素毒性起決定作用，所以不能作為免疫原直接免疫人體。通過低濃度的乙酸加熱水解，類脂A與LOS內(nèi)核之間的酮甘鍵對酸敏感,從而造成斷裂水解后進(jìn)行超速離心,類脂A由其疏水性形成相對分子質(zhì)雖較大的聚合體從而在離心過程中沉淀下來,()S處于上清中。因此得到了無內(nèi)毒素毒性的OS。通過凝膠層析進(jìn)一步的降低核酸和蛋白質(zhì)的含雖增加了工藝的穩(wěn)定性，降低了產(chǎn)品的批間差異。百日咳LOS產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要位點(diǎn)是末端三糖通過600MHz核磁共振波譜儀測

33、定'H化學(xué)位移圖結(jié)果證明所提取的百H咳桿的OS化學(xué)結(jié)構(gòu)正確，且末端三糖未破壞。這為針對這些功能基團(tuán)進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)時(shí)提供了充實(shí)的依據(jù)。研究中通過CDAP活化OS上的羥基與TT、h上的豚基直接結(jié)合制備成結(jié)合物。抑制EL1SA結(jié)果顯示，制備的結(jié)合物沒有破壞LOS的抗原性，抗原性得到良好的保留。小鼠免疫學(xué)數(shù)據(jù)顯示，由于OS抗原屬于胸腺非依賴型抗原，其免疫原性較弱，結(jié)合物采用兩種不同的免疫劑ht免疫小鼠后都誘導(dǎo)產(chǎn)生了很高的免疫應(yīng)答，而H.均有劑次加強(qiáng)效應(yīng),表明制備的結(jié)合物有很好的免疫原性且具有T細(xì)胞依賴的反應(yīng)特性，成功將多糖由胸腺非依賴性抗原轉(zhuǎn)變?yōu)樾叵僖蕾囆钥乖?。綜上所述,研究中成功提取純化了百日

34、咳桿菌LQS,純度較高，結(jié)構(gòu)正確。以此制備的結(jié)合物在小鼠體內(nèi)具有良好的免疫原性。因此，將百日咳桿菌OS與T1h結(jié)合是制備百日咳桿菌多糖蛋白結(jié)合疫苗的可行途徑。同時(shí)提示百日咳桿菌OS結(jié)合物"能是改善現(xiàn)有疫苗效果的潛在抗原成分。參考文獻(xiàn)IBLACKKE.COUSENSS,JOHNSONHL.elal.GIoImI,regional,andnationalcausesofchildmortalityin2(X)8：asystrmalicu-naly»isJ.Lan.et,2010,375(9730)：1969-1987.21CHIAPP1NIE.STIVALA.GALLIL.el

35、al.Pertussisn-enwr.genceinthepost-vaccinationeraJ.BMCInfectDis,2013,13(1):151-162.3：ROEHRB.Whoopingcoughou由reakhitsseveralUSstatesJ.BMJ,2010,24(341)；c4627.4 MURPHYJF.Pertussishasre-emergedJ.IrMedJ,2012,105(8)：260.5 WARFELJM,ZIMMERMANI.I.MERKELTJ.Acellularper-lussisvaccinesprotectagainstdiseasebutfai

36、ltopreventinfectionandtransmissioninanonhumanprimatemodelJ.ProcNatlAcadSciISA.2014,111(2)：787-792.6 PASSWELLJH.ASHKENZIS,BANET-LEVIY,ctal.Agc-glatedefYicacyofShigellaO-SPecificpolysaccharideconjugatesinI-4-year-oldIsraelichildrenJ.Vaccine,2010,28(10):2231-2235.7 C/XKOEFML.AUSSELL,ZARROUKH,ctal.Struc

37、turalvariabilityandoriginalityoftheBordetellaendotoxinsJ.EndotoxinRes,2001,7(1)：63-68.8 DIFABIOJL,CAKOKFM,KARIBIANI),etal.Charactcriza-lionofthecommonantigeniclipopolysaccharideO-chainsproducedbyBordetellabronchiseplicaandHordelcllatarapertuMis.J.FEMSMicrobio!lx-d.1992,97(3)：275-282.9STEINKE.Thymus-

38、independentan<ithymus-dependentresponseslopolysaccharideantigensJ.JInfectDis.1992,165(6)：S49-S52.10 NIEDZIELAT,I.ET0WSKAI.LUKASIEWICZJ.rtal.Epitopeofthevaccine-typeHordetellapertussisstrain186lipooligosaccha-ridran<iantiendotoxinactivityofantil>odiesdirectedagainsttheterminal|w*nlasa<-(：

39、han<l<*-tetanusloxoidconjugate,J.InfectIm-mun.2005.73(11)：7381-7389.11 MONDJJ,LEESA,SNAPPERCM.Tcell-independeniantigenstype2J.AnnuRevImmunol,1995,13(I):655-692.12INZANATJ.Eleclrophorclicheterogeneityandinterstrainvariationofthe1iiwpolysaccharideofHuenwphihisinfluenzaJ.JIn-feciDis,1983.148(3)；492-499.13 RIETSCHELET,K1KIKAEFU,SCHADEU.rial.