引物設(shè)計(jì)步驟與要點(diǎn)

1、弓丨物設(shè)計(jì) step by step1、在NCBI上搜索到目的基因，找到該基因的mRNA，在CDS選項(xiàng)中，找到編碼區(qū)所在位置，在下面的origin中，Copy該編碼序列作為軟件查詢(xún)序列的候選對(duì)象。2、用 Primer Premier5 搜索引物 打開(kāi)Primer Premier5，點(diǎn)擊File-New-DNA sequenee, 出現(xiàn)輸入序列窗口， Copy目的序列在輸入框內(nèi)（選擇 As），此窗口內(nèi)，序列也可以直接翻譯成蛋白。點(diǎn)擊Primer，進(jìn)入引物窗口。 此窗口可以鏈接到 引物搜索”、引物編輯”以及 搜索結(jié)果”選項(xiàng)，點(diǎn)擊Search按鈕，進(jìn) 入引物搜索框，選擇PCR primers ”，P

2、airs”，設(shè)定搜索區(qū)域和引物長(zhǎng)度和產(chǎn)物長(zhǎng)度。 在Search Parameters里面，可以設(shè)定相應(yīng)參數(shù)。一般若無(wú)特殊需要，參數(shù)選擇默認(rèn)即可，但產(chǎn)物長(zhǎng)度可以適當(dāng)變化，因?yàn)?00200bp的產(chǎn)物電泳跑得較散，所以可以選擇300500bp. 點(diǎn)擊OK,軟件即開(kāi)始自動(dòng)搜索引物，搜索完成后，會(huì)自動(dòng)跳出結(jié)果窗口，搜索結(jié)果默認(rèn)按照評(píng)分（Rati ng ）排序，點(diǎn)擊其中任一個(gè)搜索結(jié)果，可以在引物窗口 ”中，顯示出該引物的綜合情況，包括上游引物和下游引物的序列和位置，弓I物的各種信息等。 對(duì)于引物的序列，可以簡(jiǎn)單查看一下，避免出現(xiàn)下列情況：3 '不要出現(xiàn)連續(xù)的3個(gè)堿基相連的情況，比如 GGG或CCC

3、,否則容易引起錯(cuò)配。此窗口中需要著重查看的包括：Tm應(yīng)該在5570度之間，GC%應(yīng)該在45%55%間，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下較好。該窗口的最下面列出了兩條引物的二級(jí)結(jié)構(gòu)信息，包括，發(fā)卡，二聚體，引物間交叉二聚體和錯(cuò)誤引發(fā)位置。若按鈕顯示為紅色，表示存在該二級(jí)結(jié) 構(gòu)，點(diǎn)擊該紅色按鈕，即可看到相應(yīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)位置圖示。最理想的引物，應(yīng)該都不存在這些二級(jí)結(jié)構(gòu)，即這幾個(gè)按鈕都顯示為None”為好。但有時(shí)很難找到各個(gè)條件都滿(mǎn)足的引物，所以要求可以適當(dāng)放寬，比如引物存在錯(cuò)配的話(huà)，可以就具體情況考察該錯(cuò)配的效率如何， 是否會(huì)明顯影響產(chǎn)物。對(duì)于引物具體詳細(xì)的評(píng)價(jià)需要借助于Oli

4、go來(lái)完成，Oligo自身雖然帶有引物搜索功能，但其搜索出的引物質(zhì)量感覺(jué)不如Primer5. 在Primer5窗口中，若覺(jué)得某一對(duì)引物合適，可以在搜索結(jié)果窗口中，點(diǎn)擊該引物，然后在菜單欄，選擇 File-Print-Current pair，使用PDF虛擬打印機(jī)，即可轉(zhuǎn)換為Pdf文檔，里面有該引物的詳細(xì)信息。3、用Oligo驗(yàn)證評(píng)估引物 在Oligo軟件界面，F(xiàn)ile菜單下，選擇 Open，定位到目的eDNA序列（在primer中，該 序列已經(jīng)被保存為 Seq文件），會(huì)跳出來(lái)兩個(gè)窗口，分別為 Internal Stability （ Delta G ）窗 口和Tm窗口。在Tm窗口中，點(diǎn)擊最左下

5、角的按鈕，會(huì)出來(lái)引物定位對(duì)話(huà)框，輸入候選的上游引物序列位置（Primer5已經(jīng)給出）即可，而引物長(zhǎng)度可以通過(guò)點(diǎn)擊Change Currentoligo length來(lái)改變。定位后，點(diǎn)擊Tm窗口的Upper按鈕，確定上游引物，同樣方法定位下游引物位置，點(diǎn)擊 Lower按鈕，確定下游引物。引物確定后，即可以充分利用Analyze菜單中各種強(qiáng)大的引物分析功能了。 Analyze中，第一項(xiàng)為 Key info，點(diǎn)擊Selected primers，會(huì)給出兩條引物的概括性信息， 其中包括引物的 Tm值，此值 Oligo是采用nearest neighbor method計(jì)算，會(huì)比 Primer5 中引物

6、的Tm值略高，此窗口中還給出引物的Delta G和3端的Delta G.3 '端的Delta G過(guò)高，會(huì)在錯(cuò)配位點(diǎn)形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引起DNA聚合反應(yīng)，因此此項(xiàng)絕對(duì)值應(yīng)該小一些，最好不要超過(guò)9。 Analyze中第二項(xiàng)為Duplex Formation，即二聚體形成分析，可以選擇上游引物或下游引 物，分析上游引物間二聚體形成情況和下游引物間的二聚體情況，還可以選擇 Upper/Lower ，即上下游引物之間的二聚體形成情況。引物二聚體是影響PCR反應(yīng)異常的重要因素，因此應(yīng)該避免設(shè)計(jì)的引物存在二聚體，至少也要使設(shè)計(jì)的引物形成的二聚體是不穩(wěn)定的，即其Delta G值應(yīng)該偏低，一般不要使其超過(guò)4

7、.5kcal/mol ,結(jié)合堿基對(duì)不要超過(guò)3個(gè)。Oligo此項(xiàng)的分析窗口中分別給出了3'端和整個(gè)引物的二聚體圖示和Delta G值。 Analyze中第三項(xiàng)為Hairpin Formation ，即發(fā)夾結(jié)構(gòu)分析。可以選擇上游或者下游引物, 同樣，Delta G值不要超過(guò)4.5kcal/mol，堿基對(duì)不要超過(guò) 3個(gè)。Analyze中第四項(xiàng)為Composition and Tm ，會(huì)給出上游引物、下游引物和產(chǎn)物的各個(gè)堿基的組成比例和 Tm值。上下游引物的 GC%需要控制在 40%60%，而且上下游引物之間的 GC%不要相差太大。Tm值共有3個(gè)，分別采用三種方法計(jì)算出來(lái)，包括nearest

8、neighbormethod、 GC method 和 2(A + T) + 4(G + C)method，最后一種應(yīng)該是 Primer5 所采用的 方法，Tm值可以控制在 5070度之間。第五項(xiàng)為False Priming Sites ,即錯(cuò)誤引發(fā)位點(diǎn)， 在Primer5中雖然也有 False priming分析, 但不如oligo詳細(xì)，并且oligo會(huì)給我正確引發(fā)效率和錯(cuò)誤引發(fā)效率，一般的原則要使誤引發(fā)效率在100以下，當(dāng)然有時(shí)候正確位點(diǎn)的引發(fā)效率很高的話(huà)，比如達(dá)到400500 ,錯(cuò)誤引發(fā)效率超過(guò)100幅度若不大的話(huà)，也可以接受。 Analyze中，有參考價(jià)值的最后一項(xiàng)是PCR”在此窗口中

9、，是基于此對(duì)引物的PCR反應(yīng)Summary，并且給出了此反應(yīng)的最佳退火溫度，另外，提供了對(duì)于此對(duì)引物的簡(jiǎn)短評(píng)價(jià)。若該引物有不利于 PCR反應(yīng)的二級(jí)結(jié)構(gòu)存在，并且Delta G值偏大的話(huà)，Oligo在最后的評(píng)價(jià)中會(huì)注明，若沒(méi)有注明此項(xiàng)，表明二級(jí)結(jié)構(gòu)能值較小，基本可以接受。 引物評(píng)價(jià)完畢后，可以選擇File Print,打印為PDF文件保存，文件中將會(huì)包括所有 Oligo 軟件中已經(jīng)打開(kāi)的窗口所包括的信息， 多達(dá)數(shù)頁(yè)。因此，打印前最好關(guān)掉 Tm窗口和Delta G 窗口，可以保留引物信息窗口、二級(jí)結(jié)構(gòu)分析窗口(若存在可疑的異常的話(huà))和PCR窗口。4、引物確定后，對(duì)于上游和下游引物分別進(jìn)行Blast

10、分析，一般來(lái)說(shuō)，多少都會(huì)找到一些其他基因的同源序列，此時(shí)，可以對(duì)上游引物和下游引物的blast結(jié)果進(jìn)行對(duì)比分析，只要沒(méi)有交叉的其他基因的同源序列就可以。、引物設(shè)計(jì)過(guò)程中的心得1、Primer 5.0搜索引物 Primer Length我常設(shè)置在18 30bp,短了特異性不好，長(zhǎng)了沒(méi)有必要。當(dāng)然有特殊要求 的除外，如加個(gè)酶切位點(diǎn)什么的。 PCR Product size最好是100 500bp之間，小于100bp的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出來(lái)， 條帶很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 Search parameters 還是選 Manual 吧，Search stringency 應(yīng)選

11、High , GC含量一般是 40 60 %。其它參數(shù)默認(rèn)就可以了。 搜索出來(lái)的引物，按Rating排序，逐個(gè)送 Oligo軟件里評(píng)估。當(dāng)然，搜索出的引物，其擴(kuò)增產(chǎn)物很短，你可以不選擇它，或是引物3端絲個(gè)A或T,或引物內(nèi)部連續(xù)的 G或C太多， 或引物3端淳個(gè)G或C,這樣的引物應(yīng)作為次選，沒(méi)得選了就選它。對(duì)于這樣的引物，如 果其它各項(xiàng)指標(biāo)還可以，我喜歡在引物末端去掉一個(gè)不滿(mǎn)意的或加上一個(gè)堿基，看看引物的評(píng)估參數(shù)有沒(méi)有變好點(diǎn)。2、Oligo 6.0評(píng)估引物 在analyze里，Duplex Formation 不管是上游引物、下游引物還是上下游引物之間，Themost stable 3 '

12、-Dimer 絕對(duì)值應(yīng)小于 4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall絕對(duì)值一般應(yīng)小于多少kcal/mol跟PCR退火溫度有關(guān)，我?guī)状螌?shí)驗(yàn)感覺(jué)在 PCR退火溫度在65。的時(shí)候， The most stable Dimer overall 6.7kcal/mol 沒(méi)有問(wèn)題。 Hairpin Formation 根據(jù)黃金法則 False priming sites: Primer 的priming efficiency 應(yīng)該是錯(cuò)配地方的 4倍左右，更多當(dāng)然 更好。 在PCR欄，丁香園戰(zhàn)友感覺(jué)其所顯示的optimal annealing temperatur

13、e數(shù)值值得參考。在PCR摸索條件的時(shí)候，退火溫度為其數(shù)值加減2的范圍就可以了。 Internal stability很重要：我們希望引物的內(nèi)部穩(wěn)定性是中間高、兩邊低的弧形，最起碼保證3端不要過(guò)于穩(wěn)定。下圖引物3端過(guò)于穩(wěn)定，很容易導(dǎo)致不適當(dāng)擴(kuò)增。G參照黃金法則，這其實(shí)很好理解：把一滴水放到大海里，這滴水就會(huì)不停的擴(kuò)散分布，擴(kuò)散的越厲害 越穩(wěn)定，所以G絕對(duì)值越大結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定。3、其他兩個(gè)評(píng)價(jià)系統(tǒng)不一樣，丁香園戰(zhàn)友感覺(jué)oligo評(píng)價(jià)引物好點(diǎn)，primer出來(lái)的引物，一般按效率排序，再結(jié)合退火溫度和引物長(zhǎng)度，選擇引物到oligo測(cè)試。這是初步的選擇，其實(shí)引物到了 oligo里，退火溫度也不一樣。3端的二聚體應(yīng)該避免，這個(gè)要看退火溫度決定，一個(gè)50。的退火溫度肯定和65。對(duì)二聚體的影響不一樣了，一般來(lái)講盡量控制在4.5kcal/mol以下（丁香園戰(zhàn)友