嗅鞘細胞移植治療大鼠腦出血的實驗研究

1、嗅鞘細胞移植治療大鼠腦出血的實驗研究         11-04-03 11:43:00     編輯：studa20                作者：傅佳峰，葉盛，朱丹化，曾博，張宇，諸葛啟釧【摘要】  目的: 嗅鞘細胞移植入大鼠腦出血模型后，觀察偏癱大鼠功能恢復以及移植細胞后30 d內(nèi)的形態(tài)學變化。方法：差速貼

2、壁法培養(yǎng)出高純度的嗅鞘細胞，制作38只大鼠腦出血模型，分三組：第1組10只為空白組，第2組10只為HBSS移植組，第3組18只為嗅鞘細胞移植組；三組大鼠分別在術(shù)后3 d、7 d、14 d和30 d用forelimb placing方法進行評分，判斷嗅鞘細胞移植治療大鼠腦出血模型的作用。結(jié)果：hoechst示蹤及電鏡觀察結(jié)果，均證實嗅鞘細胞能在大鼠體內(nèi)存活；對三組大鼠進行評分，嗅鞘細胞移植組的功能恢復明顯優(yōu)于其他兩組。結(jié)論：從成年大鼠嗅黏膜用差速貼壁法能成功培養(yǎng)出嗅鞘細胞，并用于細胞移植，移植細胞能存活；嗅鞘細胞移植能改善大鼠腦出血后偏癱肢體的功能。 【關(guān)鍵詞】  嗅鞘細胞；腦出血；模

3、型，動物；細胞移植    Abstract:  Objective: To transplant the successfully cultured olfactory ensheathing cells to rat cerebral hemorrhage mode and to observe the neurological repair function of OECs and the shape of cells in hematoma and brain tissue of 30 days. Methods: High  purif

4、ication of olfactory ensheathing cells  using the method of the differing rates in attachment of the various cells type was cultured. Thirty-eight rats of cerebral hemorrhage mode were established and divided into 3 groups ；the first group (10 rats) was the blank group ；the second group (10 rat

5、s) the HBSS transplanting group；the third group (18 rats) the OECs transplanting group. The three groups were all scored in 3 days，7 days， 14 days and 30 days after operation by forelimb placing method. The contribution of OECs transplanton for curing rat cerebral hemorrhage with statistics method w

6、as eraluated. Results: OECs were comfirmed alive by immunofluorescence frace method and electron microscope；after scoring the three groups by forelimb placing method and calculating them， Olfactory ensheathing cells injected significantly reduced motor deficits compared with the control groups after

7、 cerebral hemorrhage (P <0.05). Conclusion: OECs can be successfully cultrued using the method of the differing rates of attachment of the various cells type from adult mouse olfactory mucosa and can be used for cell transplanting ；OECs transplanting method is a method of curing rat cerebral hemo

8、rrhage.    Key words:  olfactory ensheathing cells；cerebral hemorrhage；modes；animal；cell transplantation    腦出血疾病在我國是一種危害人民健康的疾病，在腦血管疾病中當屬最嚴重的一種，雖然其發(fā)病率只占其中的20%左右，但其病殘、死亡率都很高，是老年人死亡的首要原因1。神經(jīng)干細胞方面研究取得的成功，使神經(jīng)干細胞移植治療腦出血成為了研究熱點，但神經(jīng)干細胞也有其自身的缺點，比如，取材困難，存在倫理方面的問題，因此，有一種新的細

9、胞引起了人們的注意，這就是嗅鞘細胞，嗅鞘細胞不僅有神經(jīng)干細胞的特點，還有其自身的優(yōu)點，如取材方便，從嗅黏膜即可獲得嗅鞘細胞，能夠避免倫理問題。筆者嘗試用嗅鞘細胞移植來治療大鼠腦出血，希望能為下一步的臨床研究積累經(jīng)驗。    1  材料和方法    1.1  材料  雌性SD大鼠（250300 g，由溫州醫(yī)學院動物實驗中心提供），DME/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、VI型膠原酶、HBSS液、P75 NGFR、GFAP、FITC標記的羊抗小鼠IgG、hoechst均由GIBCO公司提供，LEICA解剖顯

10、微鏡，LEICA倒置相差顯微鏡，水平離心機為beckman公司的Avanti J-20 XP，熒光顯微鏡為Olympus公司產(chǎn)品，大鼠立體定向儀。    1.2  方法    免疫熒光鑒定: P75與hoechst雙染。用明視野和相差顯微鏡觀察，隨機選取5個視野計數(shù)陽性細胞數(shù)并計算平均陽性百分率。    在制作大鼠腦出血模型后的第3天，注射麻醉，將其置于立體定向架上。碘伏消毒后，沿中線切開縫合線，暴露顱骨。按照實驗分組，第2組在立體定向下引導微量注射器向大鼠腦組織尾狀核內(nèi)勻速注射(10 min)

11、10l HBSS，第3組注射由HBSS懸浮的嗅鞘細胞10l（細胞濃度為4×104/l)，其中4只大鼠的嗅鞘細胞標記Hoechst，注射部位為原手術(shù)入口，即前囟右旁3.0 mm，進針深度為6.0 mm，當注射5l左右，將微量注射器提高2.O mm繼續(xù)注射5l，注射時間上下部位各5 min，再分別上下部位各停針5 min后緩慢拔出注射器，3% H2O2清洗創(chuàng)面縫合頭皮后，碘酒消毒傷口。    1.3  統(tǒng)計學處理方法  采用單因素方差分析。    2  結(jié)果    2.1  免疫熒光鑒定及純度計算  免疫熒光鑒定：P75具有特異性，本實驗行嗅鞘細胞的P75和hoechst免疫熒光雙染。嗅鞘細胞根據(jù)形態(tài)分為梭形細胞、雙極細胞、三極細胞、多極細胞及連接成網(wǎng)狀的細胞（見圖1、圖2）。    純度計算：對培養(yǎng)7 d、14 d和21 d的細胞分別進行純度計算，各個時間的嗅鞘細胞的純度是不一樣的，培養(yǎng)7 d時嗅鞘細胞的純度最高，可達80%，以后逐漸下降，14 d純度為70%，21 d細胞純度僅為50%。文獻報道稱嗅鞘細胞比例達50%就可以進行細胞移植4，故本實驗培養(yǎng)