培養(yǎng)基成分對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響

1、培養(yǎng)基成分對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響 【摘要】目的研究MS培養(yǎng)基中大量元素、微量元素對彭澤貝母愈傷生長及生物堿含量的影響，篩選有利于彭澤貝母愈傷組織生長和生物堿積累的培養(yǎng)基配方。方法采用正交和單因素實驗設(shè)計，以生長40 d的彭澤貝母愈傷組織的生長率和生物堿含量為指標(biāo)，評價各因素對其影響的大小。結(jié)果各因素對彭澤貝母愈傷組織生長影響大小依次為PCaKN,對生物堿積累影響大小依次為KNCaP；培養(yǎng)基中NO3-N含量較高時，有利于生物堿的積累；微量元素缺乏時均有利于彭澤貝母愈傷組織的生長，缺Cu、缺I時不利于生物堿的積累。結(jié)論有利于彭澤貝母愈傷組織生長和生物堿積累的最佳組合分別為：N3P

2、1K3Ca2、 N1P2K3Ca1；培養(yǎng)基中大量元素、微量元素對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量存在一定影響。 【關(guān)鍵詞】 彭澤貝母 愈傷組織 生長量 生物堿Abstract：ObjectiveTo study the effect of large elements, trace elements of MS culture medium on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus ,and to select the culture medium which is advantageous i

3、n its growth and alkaloid accumulation.MethodsWith the growth rate and alkaloid content of the 40 days callus as indexes, single-factor and orthogonal experimental design was conducted to evaluate the impact of various factors.ResultsThe effect of various factors on the growth of the callus is PCaKN

4、 ,and on the alkaloids was KNCaP; the alkaloid content was higher when the proportion of NO3-N was higher than NH+4-N；Lacing trace elements were all advantageous in growth of the callus，but lacing I and Cu were not helpful to the accumulation of alkaloids. ConclusionThe best combination of the vario

5、us factors for the growth and the accumulation of alkaloids of the callus respectively is: N3P1K3Ca2、 N1 P2 K3Ca1； large elements, trace elements of MS culture medium have effects on the growth and alkaloid content of Fritillaria monantha Migo callus.Key words：Fritillaria monantha Migo; Callus; Alka

6、loids ; Growth江西彭澤貝母Fritillaria monantha Migo主產(chǎn)于江西北部的彭澤、湖口、都昌、九江、瑞昌、修水等縣，已被確定為國產(chǎn)貝母屬植物在江西的新分布,彭澤貝母作川貝母使用已有多年的 歷史 ， 藥 研究表明，彭澤貝母的藥理、藥效接近甚至優(yōu)于幾種常用貝母。近年來，其需求量增大，人們過度采挖，導(dǎo)致其野生蘊藏量銳減，加上人工栽培條件嚴(yán)格，有性繁殖年限長，無性繁殖系數(shù)低，病蟲害防治難等，不能滿足人們長期用藥的需求。隨著近年來對植物生物化學(xué)研究的深入，利用植物細(xì)胞、組織或器官培養(yǎng)獲得并優(yōu)化藥用植物次生代謝產(chǎn)物，以及最終利用遺傳工程制取次生代謝產(chǎn)物以滿足人類對藥用植物的巨

7、大需求，已成為當(dāng)前藥用植物生物技術(shù)領(lǐng)域的研究。大規(guī)模藥用植物組織培養(yǎng)技術(shù)的成功，使藥用植物組織細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)在中藥領(lǐng)域得到了更深的研究和。本課題組研究了不同激素組合對彭澤貝母愈傷組織誘導(dǎo)的影響，并對其高產(chǎn)細(xì)胞做了篩選1，2。本文在此基礎(chǔ)上研究了MS培養(yǎng)基中無機成分對其生長及生物堿含量的影響，為進一步 工業(yè) 化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。 1 材料與儀器 1.1 材料為本實驗室繼代培養(yǎng)的疏松的彭澤貝母愈傷組織。1.2 藥品貝母素甲購自 中國 藥品生物制品檢定所，批號：110750-200607；氯仿、甲醇、氨水、溴甲酚綠、鄰苯二甲酸氫鉀等均為分析純。1.3 儀器UV7501紫外/可見分光光度計（無錫科達儀器廠）

8、；SW-CJ-2F醫(yī)用凈化臺（上海博訊）；PB303-N 電子 天平（瑞士梅特勒）；全自動高壓蒸氣滅菌鍋（上海博訊）等。 2 方法 2.1 培養(yǎng)條件以MS為基本培養(yǎng)基，NAA 2.5 mg/L+6-BA1.0 mg/L+KT 0.5mg/L為激素組合置于溫度（201），光照強度為1 000-1 500lx，濕度為100%光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。2.2 生長量測定接種和取材前后均稱量培養(yǎng)基的重量, 計算 接種量、收獲量和增長率（每個處理3瓶）：接種量=接種后瓶重(g)-接種前瓶重(g)，收獲量=收獲前瓶重(g)-收獲后瓶重(g)，生長率（%）=收獲量(g)100接種量(g)。2.3 對其生長及生物堿含

9、量的影響以N，P，K，Ca為4個因素，MS培養(yǎng)基中原濃度、1/2濃度、1/4濃度3個水平，采用正交設(shè)計L9(34)進行實驗（見表1），培養(yǎng)40 d后取出材料，測定生長率和生物堿含量。表1 N，P，K，Ca含量正交設(shè)計因素水平表（略）2.4 NH4+-N與NO3-N對愈傷組織生長及生物堿含量的影響培養(yǎng)基中的氮源改用KNO3和NH4Cl，總N濃度不變，研究其不同比例對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量的影響，處理見表2。表2 銨態(tài)N與硝態(tài)N對其生長及生物堿含量的影響（略）2.5 微量元素缺乏對彭澤貝母愈傷組織生長及生物堿含量的影響以MS培養(yǎng)基為對照，把彭澤貝母愈傷組織接種到分別不加Fe，Mn，B，M

10、o，Zn，I，Co，Cu的培養(yǎng)基上，培養(yǎng)40 d后，取出材料測定生長率和生物堿含量。2.6 生物堿的提取與含量測定生物堿的提取與含量測定 參考 劉紅寧3、上官一平4等的方法，并在此基礎(chǔ)上做了改進。 0.04%溴甲酚綠溶液配制：精密稱取溴甲酚綠80 mg，加入少量1 mol/L NaOH溶液溶解，定容至200 ml,置陰暗處備用。 3 結(jié)果 3.1培養(yǎng)基中N、P、K、Ca含量對愈傷組織生長及生物堿含量的影響見表3。從表3可以看出，處理7愈傷組織增長率最大, 為108.42%,處理3最小,僅為38.11%；而生物堿含量最高的為處理3,含量為0.163%,最小的為處理4，僅為0.04%。通過直觀極差

11、比較可知，RPRCaRKRN，RKRNRCaRP，表明各因素中對彭澤貝母愈傷組織生長的影響大小依次為PCaKN，而對生物堿積累影響大小則為KNCaP，有利于彭澤貝母愈傷組織生長的最佳組合為：N3P1K3Ca2，有利于彭澤貝母愈傷組織生物堿積累的最佳組合為：N1 P2 K3Ca1。表3 N、P、K、Ca含量對其生長及生物堿含量的影響（略）3.2 銨態(tài)N與硝態(tài)N對愈傷組織增殖及生物堿含量的影響見表4。從表4可以看出,處理5彭澤貝母愈傷組織的平均增長率最高為88.92%,即 NH4+/N03-為1/2時，其次為處理3為83.08%,即 NH4+/N03-為2/1時，當(dāng)培養(yǎng)基中僅為NH4+-N時，增長

12、率只有8.68%，增長率最小的為空白對照，僅為4.67%；當(dāng)NH4+/N03-為1/2時生物堿含量最高，達到0.164%，培養(yǎng)基中NH4+/N03-為1/2、1/4、僅N0-3-N時，生物堿含量均高于其他處理，在空白對照中生物堿含量最低。由此表明源對彭澤貝母愈傷組織的生長分化及生物堿的積累是有一定影響的，只有當(dāng)不同形態(tài)的源比例適宜時，才有利于愈傷組織的增殖和生物堿的積累。表4 銨態(tài)N與硝態(tài)N對其生長及生物堿含量的影響（略）3.3 微量元素缺乏對彭澤貝母愈傷組織增殖及生物堿含量的影響見圖23。從圖中可以看出，缺乏微量元素均有利于彭澤貝母愈傷組織的增殖，其中缺Co時增長率達到128.19%，生物堿

13、含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于對照；缺Zn、缺Fe時生物堿含量最高，達到了0.234%，缺I、缺Cu不利于生物堿的積累。 4 討論培養(yǎng)基的組成是植物生長的一個決定因素，不同植物對培養(yǎng)基有不同的要求，并對培養(yǎng)基中的不同成分有不同的敏感性。本試驗發(fā)現(xiàn)，當(dāng)MS培養(yǎng)基中NO-3-N的比例增高時有利于彭澤貝母愈傷組織中生物堿的積累。微量元素在植物細(xì)胞生長中起著不可替代的作用，它們大多是酶的組成成分或活化劑，缺少其中一種就會代謝受阻，但是植物對其的需要量甚微，稍多就發(fā)生毒害。本文研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)培養(yǎng)基中缺B、缺Zn、缺Cu、缺Mo、缺Co、缺Mn、缺Fe、缺I時均有利于彭澤貝母愈傷組織的生長，但是缺Cu、缺I時不利于生物堿的積累，與近幾年研究的植物逆境有利于中藥有效成分的積累相一致5?！?參考 文獻 】 1張壽文,劉賢旺, 黃慧蓮，等.不同激素組合對彭澤貝母愈傷組織誘導(dǎo)效應(yīng)的研究J.江西中院學(xué)報,2004, 16(4):52.2張壽文,雷志強,劉華